趙 馳，朱永清，董 玲，黃巧蓮，趙 正，劉 培，何葉正，屈婷敏，李治華*

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

李子（Prunus salicinaLindl.）別名布霖、嘉慶子，屬薔薇科核果類水果，其果實富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素C、抗壞血酸以及鐵、鈣、磷等多種微量元素[1]，具有降低血壓、止咳、清肺、促進消化、美容養(yǎng)顏等功效[2]。我國李子種植歷史悠久且面積較大，主產(chǎn)區(qū)位于西北及長江流域地區(qū)，產(chǎn)量位列世界第一[3]。近年來，由于李子不耐貯藏并且種植面積不斷擴大，部分地區(qū)出現(xiàn)了“豐產(chǎn)不豐收”的問題，極大的挫傷了果農(nóng)的積極性。利用發(fā)酵工藝對李子進行精深加工，開發(fā)李子果酒，不僅能增加果農(nóng)收入，而且還能夠解決李子不耐貯藏、附加值低的問題。同時發(fā)酵型李子酒保留了李子的特有風(fēng)味和營養(yǎng)成分，且具有低酒精度、低含糖量的特點，兼具保健酒和飲料酒的雙重功效，深受消費者的喜愛。

目前，國內(nèi)外研究者針對李子果酒的研究非常少，主要集中于發(fā)酵工藝、檢測方法及陳釀風(fēng)味。郭意如等[4]對發(fā)酵型李子果酒的部分制作工藝進行了研究，確定了制作李子果酒的最優(yōu)李子品種、酶制劑和SO2添加量、澄清工藝及發(fā)酵溫度；劉永衡等[5]采用溶劑萃取法對陳釀30 d和120 d的幸運李子果酒進行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用分析，考察了陳釀時間對李子果酒香氣成分的影響。但對于李子果酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及揮發(fā)性物質(zhì)變化的研究尚未報道。

因此，本研究對李子果酒主發(fā)酵過程中的主要理化指標(biāo)（酒精度、總酸、pH、揮發(fā)酸、總糖）進行動態(tài)實時監(jiān)控，并采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性成分進行分析，為提高李子酒的品質(zhì)和安全提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脆紅李：永輝超市；白砂糖：成都太古糖業(yè)有限公司；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；LALLZYME EX-V復(fù)配酶制劑、偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、硫酸、磷酸：成都市飛騰博川生物公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計：深圳天溯計量檢測有限公司；CP153分析天平：奧豪斯儀器有限公司；SPME Fiber（75μm）：上海安普實驗科技有限公司；Agilent9000GC/5977BMSD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAXUI色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 李子果酒制備工藝流程及操作要點

原材料選擇及預(yù)處理→酶解→調(diào)整成分→主發(fā)酵→過濾→澄清→陳釀→成品

操作要點：

原材料選擇及預(yù)處理：選取新鮮、飽滿、無病蟲害的李子果實，用流動清水進行清洗，然后去核破碎打漿。

酶解：向李子果汁中加入0.03 g/L復(fù)配酶制劑，以提高李子果漿出汁率和澄清效果。

調(diào)整成分：向李子果汁中加入180 g/L白砂糖[4]；加入0.1 g/L偏重亞硫酸鉀，以抑制雜菌。

主發(fā)酵：將干酵母加入40℃溫水中進行活化，在李子果漿中加入0.2 g/L活化酵母，將發(fā)酵罐置于26℃條件下發(fā)酵7 d，期間進行攪拌使其完全發(fā)酵。

過濾、澄清及陳釀：發(fā)酵7 d后，采用0.4 g/L的皂土進行下膠處理，將酒液通過紗布和硅藻土進行過濾并移至新的發(fā)酵罐中于20℃陳釀2個月[6-7]。

1.3.2 樣品收集

將酵母接入李子果漿的時間計為發(fā)酵第1天，李子果酒主發(fā)酵周期一般為7 d，因此，在李子果酒發(fā)酵第1、2、3、4、5、6、7、8天進行取樣，所有采集樣品均經(jīng)過4層紗布過濾后進行分析。

1.3.3 理化指標(biāo)的測定

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對李子果酒樣品的酒精度、總糖含量、總酸含量及揮發(fā)酸含量進行測定；采用pH計測定pH值。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對李子果酒中的揮發(fā)性成分進行測定。

參照張晶等[8]的方法，并略作修改。在20 mL頂空瓶內(nèi)加入10 mL李子果酒樣，45℃條件下平衡10 min，將萃取頭插入頂空瓶中于45℃條件下萃取40 min后拔出，插入氣相色譜儀進樣口，230℃條件下解吸5 min。

GC條件：載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；無分流進樣；程序升溫：起始溫度35℃，維持3 min；以6℃/min升至150℃，維持1 min；然后再以12℃/min升至230℃，維持3 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electronionization，EI）；電子能量為70eV；離子源溫度為230℃；接口溫度為280℃；質(zhì)量掃描范圍為20～550 u。

定性定量分析：對GC-MS得到的李子果酒質(zhì)譜數(shù)據(jù)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11標(biāo)準(zhǔn)譜庫進行檢索，并結(jié)合保留指數(shù)進行定性分析；采用面積歸一化法確定各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量[9-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 李子果酒主發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化

李子果酒發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化過程如圖1所示。

圖1 李子果酒主發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of total acid content and pH of plum fruit wine during main fermentation process

由圖1可知，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量呈現(xiàn)先逐漸下降后趨于穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)發(fā)酵1～4 d時，總酸含量由10.13 g/L下降至10.00 g/L；當(dāng)發(fā)酵4～6 d時，總酸含量下降速度加快，從10.00 g/L下降至9.10 g/L；當(dāng)發(fā)酵7～8 d時，總酸含量趨于穩(wěn)定，主發(fā)酵結(jié)束，總酸含量為9.13 g/L。pH值變化與總酸含量變化趨勢相反，當(dāng)發(fā)酵1～5 d時，pH值由3.67上升至3.75；當(dāng)發(fā)酵5～8 d時，pH值趨于平穩(wěn)，到主發(fā)酵結(jié)束時達到3.76。

2.2 李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化

李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化情況不僅反映出酵母菌對糖分的利用和酒精的產(chǎn)生情況，也是體現(xiàn)李子果酒發(fā)酵進程的重要標(biāo)志[12]，其變化情況見圖2。

圖2 李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化Fig.2 Changes of alcohol content and total sugar content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖2可知，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，總糖含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢，酒精度則相反。當(dāng)李子果酒發(fā)酵1～5 d時，總糖含量迅速下降，從186.47 g/L下降至22.79 g/L，酒精度迅速上升，從0快速增加至11.90%vol。發(fā)酵5 d之后，總糖含量逐漸趨于平穩(wěn)，而酒精度則緩慢下降。發(fā)酵8 d時，總糖含量為22.90 g/L，酒精度為11.10%vol。

2.3 李子果酒主發(fā)酵過程中揮發(fā)酸含量的變化

揮發(fā)酸是評價果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，揮發(fā)酸含量過高會改變酵母的發(fā)酵能力，造成發(fā)酵異常，同時會對果酒口感產(chǎn)生較大影響，帶給人醋味和尖酸感[13]。其變化情況見圖3。

圖3 李子果酒主發(fā)酵過程中揮發(fā)酸含量的變化Fig.3 Changes of volatile acid content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖3可知，在李子果酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，揮發(fā)酸含量呈逐漸上升趨勢，當(dāng)李子果酒發(fā)酵1～2 d，揮發(fā)酸含量快速上升，從0.07 g/L上升至0.17 g/L；當(dāng)發(fā)酵2～6 d，揮發(fā)酸含量雖逐漸增加，但上升速度變緩；當(dāng)發(fā)酵6～8 d，揮發(fā)酸含量又快速升高，發(fā)酵8 d時，揮發(fā)酸含量為0.25 g/L。

李子果酒發(fā)酵過程中，pH值、總酸含量、酒精度、總糖含量以及揮發(fā)酸含量的變化與李子果酒的發(fā)酵程度和品質(zhì)密切相關(guān)。在發(fā)酵過程中，總糖和總酸含量呈下降的趨勢，pH值、酒精度及揮發(fā)酸含量呈上升趨勢，究其原因，可能是由于發(fā)酵前4天，微生物處于快速生長繁殖階段，其代謝活動劇烈，使揮發(fā)酸含量快速上升[13]，并迅速利用李子果酒中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇，從而導(dǎo)致果酒中酒精含量快速增高，而糖類物質(zhì)含量迅速下降。隨著發(fā)酵進程的持續(xù)進行，酵母菌可利用的糖類物質(zhì)變少，同時酒精含量的增加也會對酵母菌的生長和活動產(chǎn)生抑制作用，造成酵母菌分解糖類物質(zhì)速率降低，酒精度和總糖含量趨于平穩(wěn)。發(fā)酵后期酒精度略微降低是由于乙醇和酰基輔酶A在釀酒酵母細胞內(nèi)被醇?；D(zhuǎn)移酶催化生成相應(yīng)的酯類造成的[14]?？偹岷拷档褪怯捎谝恍┧犷愇镔|(zhì)在微生物的作用下被分解及利用，如乙酸乙酯的合成途徑，酵母在酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯，從而導(dǎo)致總酸含量逐漸降低、pH值升高，而揮發(fā)酸含量在主發(fā)酵后期依舊呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢，所以在之后陳釀過程中需要對陳釀環(huán)境以及儲藏管理加大控制力度，避免揮發(fā)酸含量持續(xù)增高對李子果酒口感和品質(zhì)造成負面影響[15]。

2.4 李子果酒主發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性物質(zhì)變化

揮發(fā)性物質(zhì)是果酒風(fēng)味的重要指標(biāo)[16-17]，其主要來源于水果本身、微生物代謝以及陳釀過程，通過HS-SPMEGC-MS檢測及NIST數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)，李子果酒主發(fā)酵過程中主要物質(zhì)是醇類和酯類物質(zhì)，其中主要變化的醇類物質(zhì)有乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，其變化過程見圖4。

圖4 李子果酒主發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of alcohols in plum fruit wine during main fermentation process

由圖4可知，在李子果酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇、異戊醇、異丁醇的相對含量呈先升高再下降后趨于穩(wěn)定的趨勢；苯基乙醇的相對含量呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢；1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢。主發(fā)酵結(jié)束后，乙醇、異戊醇、異丁醇、苯基乙醇、1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對含量分別為51.79%、15.74%、4.46%、1.47%、2.09%、0.71%。

主要變化的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，其變化過程見圖5。

圖5 李子果酒主發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的變化Fig.5 Changes of esters in plum fruit wine during main fermentation process

由圖5可知，在李子酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對含量均呈逐漸升高的趨勢；而3-甲基-1-丁醇乙酸酯和乙酸己酯的總體趨勢則表現(xiàn)為先上升后下降。主發(fā)酵結(jié)束后，乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對含量分別為3.91%、4.59%、7.46%、0.75%、3.14%、2.86%。

香氣成分是李子果酒品質(zhì)的重要組成部分，6種醇類物質(zhì)中1-己醇、異戊醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇這4種醇類物質(zhì)各自具有獨特風(fēng)味特征，如1-己醇具有水果芬芳的誘人香氣，異戊醇為國家規(guī)定的食用香精，苯基乙醇具有花香；6種主要的酯類物質(zhì)也是李子果酒香氣構(gòu)成的重要成分，如辛酸乙酯具有白蘭地酒香味，主要用于調(diào)味品、香料制造，癸酸乙酯和乙酸異戊酯均可用于調(diào)香[18-23]。

3 結(jié)論

本研究以李子為原料制作李子果酒，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值、酒精度呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢；總酸、總糖含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢；揮發(fā)酸含量呈上升趨勢。主發(fā)酵結(jié)束后，李子果酒的酒精度為11.10%vol、總酸含量為9.13 g/L、pH值為3.76、揮發(fā)酸含量為0.25 g/L、總糖含量為22.90 g/L。李子果酒發(fā)酵過程中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為醇類和酯類，主要變化的醇類包括乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，主要變化酯類包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯。本研究揭示了李子果酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律。