趙 馳，朱永清，董 玲，黃巧蓮，趙 正，劉 培，何葉正，屈婷敏，李治華*

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

李子（Prunus salicinaLindl.）別名布霖、嘉慶子，屬薔薇科核果類水果，其果實(shí)富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素C、抗壞血酸以及鐵、鈣、磷等多種微量元素[1]，具有降低血壓、止咳、清肺、促進(jìn)消化、美容養(yǎng)顏等功效[2]。我國(guó)李子種植歷史悠久且面積較大，主產(chǎn)區(qū)位于西北及長(zhǎng)江流域地區(qū)，產(chǎn)量位列世界第一[3]。近年來，由于李子不耐貯藏并且種植面積不斷擴(kuò)大，部分地區(qū)出現(xiàn)了“豐產(chǎn)不豐收”的問題，極大的挫傷了果農(nóng)的積極性。利用發(fā)酵工藝對(duì)李子進(jìn)行精深加工，開發(fā)李子果酒，不僅能增加果農(nóng)收入，而且還能夠解決李子不耐貯藏、附加值低的問題。同時(shí)發(fā)酵型李子酒保留了李子的特有風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分，且具有低酒精度、低含糖量的特點(diǎn)，兼具保健酒和飲料酒的雙重功效，深受消費(fèi)者的喜愛。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者針對(duì)李子果酒的研究非常少，主要集中于發(fā)酵工藝、檢測(cè)方法及陳釀風(fēng)味。郭意如等[4]對(duì)發(fā)酵型李子果酒的部分制作工藝進(jìn)行了研究，確定了制作李子果酒的最優(yōu)李子品種、酶制劑和SO2添加量、澄清工藝及發(fā)酵溫度；劉永衡等[5]采用溶劑萃取法對(duì)陳釀30 d和120 d的幸運(yùn)李子果酒進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用分析，考察了陳釀時(shí)間對(duì)李子果酒香氣成分的影響。但對(duì)于李子果酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及揮發(fā)性物質(zhì)變化的研究尚未報(bào)道。

因此，本研究對(duì)李子果酒主發(fā)酵過程中的主要理化指標(biāo)（酒精度、總酸、pH、揮發(fā)酸、總糖）進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)控，并采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，為提高李子酒的品質(zhì)和安全提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脆紅李：永輝超市；白砂糖：成都太古糖業(yè)有限公司；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；LALLZYME EX-V復(fù)配酶制劑、偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、硫酸、磷酸：成都市飛騰博川生物公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)：深圳天溯計(jì)量檢測(cè)有限公司；CP153分析天平：奧豪斯儀器有限公司；SPME Fiber（75μm）：上海安普實(shí)驗(yàn)科技有限公司；Agilent9000GC/5977BMSD氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAXUI色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 李子果酒制備工藝流程及操作要點(diǎn)

原材料選擇及預(yù)處理→酶解→調(diào)整成分→主發(fā)酵→過濾→澄清→陳釀→成品

操作要點(diǎn)：

原材料選擇及預(yù)處理：選取新鮮、飽滿、無病蟲害的李子果實(shí)，用流動(dòng)清水進(jìn)行清洗，然后去核破碎打漿。

酶解：向李子果汁中加入0.03 g/L復(fù)配酶制劑，以提高李子果漿出汁率和澄清效果。

調(diào)整成分：向李子果汁中加入180 g/L白砂糖[4]；加入0.1 g/L偏重亞硫酸鉀，以抑制雜菌。

主發(fā)酵：將干酵母加入40℃溫水中進(jìn)行活化，在李子果漿中加入0.2 g/L活化酵母，將發(fā)酵罐置于26℃條件下發(fā)酵7 d，期間進(jìn)行攪拌使其完全發(fā)酵。

過濾、澄清及陳釀：發(fā)酵7 d后，采用0.4 g/L的皂土進(jìn)行下膠處理，將酒液通過紗布和硅藻土進(jìn)行過濾并移至新的發(fā)酵罐中于20℃陳釀2個(gè)月[6-7]。

1.3.2 樣品收集

將酵母接入李子果漿的時(shí)間計(jì)為發(fā)酵第1天，李子果酒主發(fā)酵周期一般為7 d，因此，在李子果酒發(fā)酵第1、2、3、4、5、6、7、8天進(jìn)行取樣，所有采集樣品均經(jīng)過4層紗布過濾后進(jìn)行分析。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)李子果酒樣品的酒精度、總糖含量、總酸含量及揮發(fā)酸含量進(jìn)行測(cè)定；采用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對(duì)李子果酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定。

參照張晶等[8]的方法，并略作修改。在20 mL頂空瓶?jī)?nèi)加入10 mL李子果酒樣，45℃條件下平衡10 min，將萃取頭插入頂空瓶中于45℃條件下萃取40 min后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，230℃條件下解吸5 min。

GC條件：載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；無分流進(jìn)樣；程序升溫：起始溫度35℃，維持3 min；以6℃/min升至150℃，維持1 min；然后再以12℃/min升至230℃，維持3 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electronionization，EI）；電子能量為70eV；離子源溫度為230℃；接口溫度為280℃；質(zhì)量掃描范圍為20～550 u。

定性定量分析：對(duì)GC-MS得到的李子果酒質(zhì)譜數(shù)據(jù)與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析；采用面積歸一化法確定各揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量[9-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 李子果酒主發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化

李子果酒發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化過程如圖1所示。

圖1 李子果酒主發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of total acid content and pH of plum fruit wine during main fermentation process

由圖1可知，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酸含量呈現(xiàn)先逐漸下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵1～4 d時(shí)，總酸含量由10.13 g/L下降至10.00 g/L；當(dāng)發(fā)酵4～6 d時(shí)，總酸含量下降速度加快，從10.00 g/L下降至9.10 g/L；當(dāng)發(fā)酵7～8 d時(shí)，總酸含量趨于穩(wěn)定，主發(fā)酵結(jié)束，總酸含量為9.13 g/L。pH值變化與總酸含量變化趨勢(shì)相反，當(dāng)發(fā)酵1～5 d時(shí)，pH值由3.67上升至3.75；當(dāng)發(fā)酵5～8 d時(shí)，pH值趨于平穩(wěn)，到主發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到3.76。

2.2 李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化

李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化情況不僅反映出酵母菌對(duì)糖分的利用和酒精的產(chǎn)生情況，也是體現(xiàn)李子果酒發(fā)酵進(jìn)程的重要標(biāo)志[12]，其變化情況見圖2。

圖2 李子果酒主發(fā)酵過程中酒精度和總糖含量的變化Fig.2 Changes of alcohol content and total sugar content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖2可知，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總糖含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，酒精度則相反。當(dāng)李子果酒發(fā)酵1～5 d時(shí)，總糖含量迅速下降，從186.47 g/L下降至22.79 g/L，酒精度迅速上升，從0快速增加至11.90%vol。發(fā)酵5 d之后，總糖含量逐漸趨于平穩(wěn)，而酒精度則緩慢下降。發(fā)酵8 d時(shí)，總糖含量為22.90 g/L，酒精度為11.10%vol。

2.3 李子果酒主發(fā)酵過程中揮發(fā)酸含量的變化

揮發(fā)酸是評(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，揮發(fā)酸含量過高會(huì)改變酵母的發(fā)酵能力，造成發(fā)酵異常，同時(shí)會(huì)對(duì)果酒口感產(chǎn)生較大影響，帶給人醋味和尖酸感[13]。其變化情況見圖3。

圖3 李子果酒主發(fā)酵過程中揮發(fā)酸含量的變化Fig.3 Changes of volatile acid content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖3可知，在李子果酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)酸含量呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)李子果酒發(fā)酵1～2 d，揮發(fā)酸含量快速上升，從0.07 g/L上升至0.17 g/L；當(dāng)發(fā)酵2～6 d，揮發(fā)酸含量雖逐漸增加，但上升速度變緩；當(dāng)發(fā)酵6～8 d，揮發(fā)酸含量又快速升高，發(fā)酵8 d時(shí)，揮發(fā)酸含量為0.25 g/L。

李子果酒發(fā)酵過程中，pH值、總酸含量、酒精度、總糖含量以及揮發(fā)酸含量的變化與李子果酒的發(fā)酵程度和品質(zhì)密切相關(guān)。在發(fā)酵過程中，總糖和總酸含量呈下降的趨勢(shì)，pH值、酒精度及揮發(fā)酸含量呈上升趨勢(shì)，究其原因，可能是由于發(fā)酵前4天，微生物處于快速生長(zhǎng)繁殖階段，其代謝活動(dòng)劇烈，使揮發(fā)酸含量快速上升[13]，并迅速利用李子果酒中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇，從而導(dǎo)致果酒中酒精含量快速增高，而糖類物質(zhì)含量迅速下降。隨著發(fā)酵進(jìn)程的持續(xù)進(jìn)行，酵母菌可利用的糖類物質(zhì)變少，同時(shí)酒精含量的增加也會(huì)對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用，造成酵母菌分解糖類物質(zhì)速率降低，酒精度和總糖含量趨于平穩(wěn)。發(fā)酵后期酒精度略微降低是由于乙醇和?；o酶A在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)被醇?；D(zhuǎn)移酶催化生成相應(yīng)的酯類造成的[14]?？偹岷拷档褪怯捎谝恍┧犷愇镔|(zhì)在微生物的作用下被分解及利用，如乙酸乙酯的合成途徑，酵母在酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯，從而導(dǎo)致總酸含量逐漸降低、pH值升高，而揮發(fā)酸含量在主發(fā)酵后期依舊呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì)，所以在之后陳釀過程中需要對(duì)陳釀環(huán)境以及儲(chǔ)藏管理加大控制力度，避免揮發(fā)酸含量持續(xù)增高對(duì)李子果酒口感和品質(zhì)造成負(fù)面影響[15]。

2.4 李子果酒主發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性物質(zhì)變化

揮發(fā)性物質(zhì)是果酒風(fēng)味的重要指標(biāo)[16-17]，其主要來源于水果本身、微生物代謝以及陳釀過程，通過HS-SPMEGC-MS檢測(cè)及NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，李子果酒主發(fā)酵過程中主要物質(zhì)是醇類和酯類物質(zhì)，其中主要變化的醇類物質(zhì)有乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，其變化過程見圖4。

圖4 李子果酒主發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of alcohols in plum fruit wine during main fermentation process

由圖4可知，在李子果酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙醇、異戊醇、異丁醇的相對(duì)含量呈先升高再下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；苯基乙醇的相對(duì)含量呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對(duì)含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。主發(fā)酵結(jié)束后，乙醇、異戊醇、異丁醇、苯基乙醇、1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對(duì)含量分別為51.79%、15.74%、4.46%、1.47%、2.09%、0.71%。

主要變化的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，其變化過程見圖5。

圖5 李子果酒主發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)的變化Fig.5 Changes of esters in plum fruit wine during main fermentation process

由圖5可知，在李子酒發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對(duì)含量均呈逐漸升高的趨勢(shì)；而3-甲基-1-丁醇乙酸酯和乙酸己酯的總體趨勢(shì)則表現(xiàn)為先上升后下降。主發(fā)酵結(jié)束后，乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對(duì)含量分別為3.91%、4.59%、7.46%、0.75%、3.14%、2.86%。

香氣成分是李子果酒品質(zhì)的重要組成部分，6種醇類物質(zhì)中1-己醇、異戊醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇這4種醇類物質(zhì)各自具有獨(dú)特風(fēng)味特征，如1-己醇具有水果芬芳的誘人香氣，異戊醇為國(guó)家規(guī)定的食用香精，苯基乙醇具有花香；6種主要的酯類物質(zhì)也是李子果酒香氣構(gòu)成的重要成分，如辛酸乙酯具有白蘭地酒香味，主要用于調(diào)味品、香料制造，癸酸乙酯和乙酸異戊酯均可用于調(diào)香[18-23]。

3 結(jié)論

本研究以李子為原料制作李子果酒，在李子果酒主發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值、酒精度呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；總酸、總糖含量呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；揮發(fā)酸含量呈上升趨勢(shì)。主發(fā)酵結(jié)束后，李子果酒的酒精度為11.10%vol、總酸含量為9.13 g/L、pH值為3.76、揮發(fā)酸含量為0.25 g/L、總糖含量為22.90 g/L。李子果酒發(fā)酵過程中主要的揮發(fā)性物質(zhì)為醇類和酯類，主要變化的醇類包括乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，主要變化酯類包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯。本研究揭示了李子果酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律。