張可可，席 宇，程 方，劉 凱，陰紅霞，房占杰，劉人聚，史團(tuán)省，劉 巖*

（1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

紅色酵母菌是一類重要的資源微生物，其細(xì)胞內(nèi)可積累類胡蘿卜素[1-3]和油脂[4-5]等多種生物活性物質(zhì)[6-7]。目前，已從環(huán)境中分離出多株紅色酵母菌[8-9]。作為一種紅色酵母菌，鎖擲孢酵母（Sporidiobolus）的多個菌株能高產(chǎn)油脂，是微生物油脂開發(fā)的理想研究對象[10]，而且鎖擲孢酵母油脂中富含油酸，可作為功能性油脂的一種來源[11]。此外，鎖擲孢酵母合成類胡蘿卜素[12-14]的特性也引起研究人員的極大興趣。因此，鎖擲孢酵母在食品加工[15]、腐敗菌防治[16]和醫(yī)藥研發(fā)[12]等領(lǐng)域的應(yīng)用日趨增多，利用鎖擲孢酵母細(xì)胞積累油脂、色素、酶類等有益代謝產(chǎn)物的特性受到研究者的重視[17-18]。

煙草廢水中含有大量可溶性糖類物質(zhì)，且其pH值為弱酸性，適合真菌類微生物生長[19-20]。近年來，有關(guān)煙葉內(nèi)生真菌的研究較多[21-24]，而對煙草廢水中微生物類群的研究甚少。本研究采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基從煙草廢水中分離一株紅色酵母菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并初步探討其發(fā)酵馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose water，PDW）產(chǎn)油脂和色素的潛力，旨在為紅色酵母菌天然產(chǎn)物的開發(fā)和有機(jī)釀造廢水的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

煙草廢水：河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司污水處理站。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Ladder Mix Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；丙酮（分析純）：河南省金碩化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；氯仿（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；甲醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖水（PDW）：青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ300精密電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-30SII高壓蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Avanti J-25低溫高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；GHP-9160恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Microstation自動微生物鑒定儀：美國Biolog公司；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；WH861漩渦混合器：上?？等A生化儀器制造公司；UV1700紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；3730XL測序儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

將采集的煙草廢水用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋（10-1～10-5），然后將梯度稀釋液分別涂布于PDA培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)紅色菌落，采用PDA培養(yǎng)基劃線純化，獲得單菌落，4℃保藏于PDA培養(yǎng)基斜面，備用。

1.3.2 分離菌株的鑒定

形態(tài)觀察[25]：將分離菌株劃線于PDA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)[26]：采用Microstation自動微生物鑒定儀對分離菌株的碳源利用情況進(jìn)行檢測。

分子生物學(xué)鑒定：分離菌株ITS序列的擴(kuò)增及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行，序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。

1.3.3 分離菌株的培養(yǎng)

挑取一環(huán)分離菌株接種于含20 mL PDW的100 mL三角瓶中，30℃、150r/min條件下培養(yǎng)18h制備種子液。取5mL種子液接種于含45 mL PDW的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 d，測定生物量、胞內(nèi)油脂及色素。

1.3.4分析方法

生物量的測定[27]：取20mL發(fā)酵液，8000r/min離心5min，棄上清，收集菌體，稱質(zhì)量并計(jì)算菌體濕質(zhì)量，105℃烘至恒質(zhì)量后，稱質(zhì)量并計(jì)算菌體干質(zhì)量。

菌體胞內(nèi)油脂的提取和含量測定[28]：采用酸熱法提取菌體胞內(nèi)油脂。1 g濕菌體加入4 mol/L鹽酸10 mL，混合均勻，室溫放置20 min后沸水浴10 min，-20 ℃冰浴30 min，加入氯仿和甲醇各10 mL，振蕩30 min，5 000 r/min離心3 min，靜置分層，分離下部氯仿層，65℃干燥2 h，稱質(zhì)量并計(jì)算油脂含量及產(chǎn)量。

色素的提取與含量測定[29-30]：在1g濕菌體中加入4mol/L的鹽酸溶液6 mL，室溫振蕩浸泡30 min，沸水浴5 min，冰水混合物中迅速冷卻10 min后進(jìn)行細(xì)胞破碎。在細(xì)胞破碎液中加入4 mL丙酮，避光振蕩30 min，離心收集丙酮浸提液。采用紫外可見分光光度計(jì)在波長400～600nm處對丙酮浸提液進(jìn)行掃描，獲得最高吸收波長及其對應(yīng)的吸光度值，計(jì)算色素的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

經(jīng)多次劃線純化，從PDA培養(yǎng)基平板上分離出一株紅色單菌落，命名為YH0902，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定。

2.2 菌株YH0902的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株YH0902在PDA培養(yǎng)基上的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，該菌落呈玫紅色，濕潤不透明，菌落凸起，表面光滑，邊緣完整。由圖1b可知，菌株YH0902的細(xì)胞呈橢圓形，有明顯的芽體產(chǎn)生，部分細(xì)胞內(nèi)有明顯的高折光率顆粒區(qū)域，可能是富集油脂的原因。根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》可知，菌株YH0902的菌落特征與細(xì)胞形態(tài)特征與酵母菌高度相符[31-32]。

圖1 菌株YH0902的菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain YH0902

2.2.2 生理生化特征分析

菌株YH0902的碳源利用結(jié)果見表1。由表1可知，菌株YH0902可以利用D-阿洛酮糖、L-山梨糖、D-苷露醇、麥芽三糖、D-棉子糖、α-D-葡萄糖、D-半乳糖磺，琥珀酸和D-木糖等碳源；不能利用乙酸、D-纖維二糖、N-乙?；鵇-葡萄糖、麥芽糖醇、I-赤藻糖醇等碳源。

表1 菌株YH0902的碳源利用結(jié)果Table 1 Results of carbon source utilization of strain YH0902

2.2.3分子生物學(xué)鑒定

以菌株YH0902基因組為模板，ITS 1、ITS 2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶位于500～600 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖2 菌株YH0902的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of ITS sequence of strain YH0902

測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，選取同源性較高的12株酵母菌，采用MEGA 6.05軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株YH0902與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）聚于同一分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株YH0902的形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定其為一株近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。

圖3 基于ITS序列菌株YH0902的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YH0902 based on ITS sequences

2.3 菌株YH0902胞內(nèi)色素及油脂的初步分析

采用紫外可見分光光度計(jì)在波長400～600 nm處對丙酮浸提液進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株YH0902細(xì)胞色素的丙酮提取液的掃描圖譜與類胡蘿卜素的掃描光譜圖基本一致[29]，具有明顯的雙肩峰特征，最大吸收波長為488 nm。因此，可以推測菌株YH0902細(xì)胞內(nèi)含有大量的類胡蘿卜素。

圖4 菌株YH0902胞內(nèi)色素丙酮提取液的掃描光譜Fig.4 Scanned spectrum of intracellular pigment acetone extracting solution of strain YH0902

菌株YH0902的生物量、胞內(nèi)油脂及色素的分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，菌株YH0902在PDW中，30℃、150r/min條件下培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液中菌體濕質(zhì)量為（48.53±0.36）g/L，干質(zhì)量為（10.63±0.15）g/L。菌株YH0902油脂產(chǎn)量可達(dá)（3.30±0.17）g/L，占細(xì)胞干質(zhì)量的（31.04±0.23）%，油脂含量相對較高。菌株YH0902胞內(nèi)色素產(chǎn)量為（4.33±0.19）mg/L。本實(shí)驗(yàn)采用商品化PDW進(jìn)行發(fā)酵，成本較高，但生物量相對較低。因此，下一步的實(shí)驗(yàn)需要探索廉價的基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，如食品釀造廢水等，通過發(fā)酵優(yōu)化和營養(yǎng)物質(zhì)的添加，提高發(fā)酵產(chǎn)物色素或油脂的產(chǎn)量。

表2 菌株YH0902的生物量、胞內(nèi)油脂及色素Table 2 Biomass,intracellular lipid and pigment of strain YH0902

3 結(jié)論

本研究采用PDA培養(yǎng)基從煙草廢水中分離出一株紅色酵母菌YH0902，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物鑒定其為一株近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。該菌株可利用PDW培養(yǎng)基產(chǎn)生油脂和色素，30℃、150r/min條件下培養(yǎng)4d，濕質(zhì)量為（48.53±0.36）g/L，干質(zhì)量為（10.63±0.15）g/L，胞內(nèi)油脂產(chǎn)量可達(dá)（3.30±0.17）g/L，色素產(chǎn)量為（4.33±0.19）mg/L。因此，菌株YH0902在微生物源天然色素及油脂開發(fā)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。