曹文紅

卵巢癌是婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤第三位，死亡率位居第一位。其惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，極大影響女性生存質(zhì)量[1]。鑒于其生理學(xué)特性，卵巢位于盆腔深部，早期缺乏特異性癥狀，且缺乏有效篩查途徑，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期。卵巢癌治療效果差，生存率低，化療易產(chǎn)生耐藥性和復(fù)發(fā)，所以對(duì)卵巢癌的治療是臨床研究的一個(gè)重要問(wèn)題。近年來(lái)，有研究數(shù)據(jù)提示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[2]，發(fā)現(xiàn)miRNA參與多種生物過(guò)程，并與人類(lèi)眾多癌癥息息相關(guān)[3]。miRNA在卵巢癌中具有特異性表達(dá)的特征，可作為腫瘤的標(biāo)志物；且miRNA通過(guò)介導(dǎo)靶基因表達(dá)在實(shí)體腫瘤中發(fā)揮重要作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin的表達(dá)可提示腫瘤的進(jìn)展[4，5]。本研究主要對(duì)miR-26b-5p介導(dǎo)HMGA1基因參與卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制進(jìn)行研究，為卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化提供分子學(xué)作用機(jī)制，促進(jìn)卵巢癌分子靶向治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 卵巢癌細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；Western blot抗體購(gòu)于Abcam(Cambridge，UK)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司，USA)；BCA試劑盒(碧云天，中國(guó))。

1.2 組織樣本收集 收集我院病理科40例卵巢癌患者卵巢上皮組織及40例健康人正常卵巢上皮組織。采用HE染色確認(rèn)標(biāo)本組織類(lèi)型。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核并獲組織提供者同意。

1.3 方法

1.3.1 miR-26b-5p靶基因預(yù)測(cè) 利用disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)卵巢癌靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用miRDB對(duì)靶基因miR進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.2 卵巢上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng) 以原代培養(yǎng)的正常卵巢上皮細(xì)胞作為內(nèi)參。正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3均置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合到80%時(shí)常規(guī)胰酶消化、傳代，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 qRT-PCR 按照Trizol法提取組織和細(xì)胞RNA。取5 μl RNA樣品稀釋?zhuān)y(cè)定RNA的濃度和純度。參照標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)程序，應(yīng)用ABI7500定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。每對(duì)引物設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.4 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 卵巢癌細(xì)胞分別進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，卵巢癌細(xì)胞分別改變miR-26b-5p表達(dá)(miR-26b-5p mimic)、HMGA1表達(dá)(sh-HMGA1)以及共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1)。初步檢測(cè)確定miR-26b-5p和MGA1表達(dá)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組：(1)為探究miR-26b-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，分為miR-26b-5p mimic內(nèi)參(negative control)組和miR-26b-5p mimic組；(2)為研究HMGA1是miR-26b-5p的功能性靶基因，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建組別包括：mimic NC組、miR-26b-5p mimic組、inhibitor NC組、miR-26b-5p inhibitor組；(3)為研究MGA1調(diào)控卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建組別為：sh-HMGA1內(nèi)參組和sh-HMGA1組；(4)為探究miR-26b-5p靶向HMGA1對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，將進(jìn)一步構(gòu)建miR-26b-5p inhibitor內(nèi)參組及miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn) RIPA裂解提取待測(cè)組織和細(xì)胞的總蛋白。使用BCA法測(cè)蛋白濃度；上樣、電泳、蛋白分離并轉(zhuǎn)膜，隨后封閉。加入一抗兔多克隆抗體：HMGA1、E-cadherin、Vimentin和GAPDH；處理后加入加辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育。TBST洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光，圖片掃描，應(yīng)用ImageJ分析軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) (1)取合適細(xì)胞接種至6孔板，移液槍小心劃線，并測(cè)量細(xì)胞遷移距離并記錄；(2)在Transwell上室中加入稀釋Matrigel，37 ℃孵育；(3)消化、計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，加入Transwell小室。所有步驟均按劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)miR-26b-5p和HMGA1表達(dá) HE染色證實(shí)標(biāo)本組織分別為卵巢癌組織和正常卵巢上皮組織，如圖1所示。采用qRT-PCR檢測(cè)卵巢組織中miR-26b-5p和HMGA1的表達(dá)。結(jié)果提示：與正常卵巢上皮組織相比，miR-26b-5p在卵巢癌組織中低表達(dá)(7.18±0.66vs4.33±0.28)，HMGA1在卵巢癌組織中高表達(dá)(0.92±0.15vs2.71±0.40；P<0.05)。

進(jìn)一步檢測(cè)正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中miR-26b-5p和HMGA1的表達(dá)。結(jié)果提示：與正常卵巢上皮組織相比，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中miR-26b-5p為低表達(dá)(0.85±0.21vs0.33±0.10)；HMGA1在癌細(xì)胞中高表達(dá)(0.46±0.20vs1.44±0.37；P<0.05)。

圖1 卵巢組織病理圖片(HE，×100)

2.2 miR-26b-5p靶向抑制HMGA1表達(dá) qRT-PCR結(jié)果提示：分別與mimic NC組和inhibitor NC組相比，miR-26b-5p在miR-26b-5p mimic組和miR-26b-5p inhibitor組分別呈顯著上調(diào)和顯著下調(diào)趨勢(shì)，而HMGA1的mRNA和蛋白表達(dá)分別呈顯著下調(diào)和顯著上調(diào)趨勢(shì)(均P<0.05，表1)，而mimic NC組和inhibitor NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中miR-26b-5p和HMGA1的表達(dá)

注：與mimic NC組比較，①P<0.05；與inhibitor NC組比較，②P<0.05

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理對(duì)E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)的影響(表2)。結(jié)果提示：與miR-26b-5p mimic內(nèi)參組相比，miR-26b-5p mimic組E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)均呈顯著下調(diào)趨勢(shì)(均P<0.05)。且與sh-HMGA1內(nèi)參組相比，sh-HMGA1組E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，而Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。

而與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，而Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加(均P<0.05，表2)。

表2 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)

注：與miR-26b-5p mimic內(nèi)參組相比，①P<0.05；與sh-HMGA1內(nèi)參組比較，②P<0.05；與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，③P<0.05

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的影響 與miR-26b-5p mimic內(nèi)參組相比，miR-26b-5p mimic組癌細(xì)胞侵襲和遷移均呈顯著降低趨勢(shì)(均P<0.05)。同時(shí)，與sh-HMGA1內(nèi)參組相比，sh-HMGA1組癌細(xì)胞侵襲和遷移均顯著降低(均P<0.05，表3)。與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組癌細(xì)胞侵襲和遷移均顯著增加(均P<0.05)。

表3 細(xì)胞侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移變化

注：與miR-26b-5p mimic內(nèi)參組相比，①P<0.05；與sh-HMGA1內(nèi)參組比較，②P<0.05；與miR-26b-5p inhibitor+NC組相比，③P<0.05

3 討 論

本研究作為一項(xiàng)分子機(jī)制研究，關(guān)注miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的小分子RNA在卵巢癌中的潛在功能。通過(guò)采集卵巢癌患者的癌組織及體檢人群正常卵巢上皮組織，檢測(cè)miR-26b-5p和HMGA1的表達(dá)情況，并通過(guò)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)趨勢(shì)。基于此，本研究進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞系試驗(yàn)中通過(guò)不同研究目的和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建組別，逐一研究miR-26b-5p和HMGA1分別與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)聯(lián)，并在前述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確認(rèn)miR-26b-5p靶向調(diào)控HMGA1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究納入40例卵巢癌組織及40例正常卵巢上皮組織，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p在卵巢癌組織中低表達(dá)，HMGA1在卵巢癌組織中高表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞系SKOV3趨勢(shì)一致，為后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。與此同時(shí)，為驗(yàn)證生物數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證HMGA1是miR-26b-5p的功能性靶基因。miR-26b-5p在miR-26b-5p mimic組和miR-26b-5p inhibitor組分別呈顯著上調(diào)和顯著下調(diào)趨勢(shì)，而HMGA1分別呈顯著下調(diào)和顯著上調(diào)趨勢(shì)，表明miR-26b-5p能夠靶向抑制HMGA1表達(dá)。進(jìn)而，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)miR-26b-5p mimic轉(zhuǎn)染和sh-HMGA1轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)分別上調(diào)和抑制miR-26b-5p和HMGA1的表達(dá)，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，Vimentin表達(dá)顯著降低。此結(jié)果提示，miR-26b-5p高表達(dá)和沉默HMGA1表達(dá)能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并抑制細(xì)胞侵襲和遷移。

本研究結(jié)果基本驗(yàn)證，miR-26b-5p和HMGA1表達(dá)的調(diào)控可影響卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的假設(shè)。實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵在于進(jìn)一步確認(rèn)miR-26b-5p是否可靶向調(diào)控HMGA1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建miR-26b-5p inhibitor內(nèi)參組及miR-26b-5p inhibitor+sh-HMGA1組，通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)E-cadherin和Vimentin表達(dá)。結(jié)果提示：下調(diào)miR-26b-5p表達(dá)(即miR-26b-5p inhibitor)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)提高細(xì)胞侵襲和遷移能力，而共轉(zhuǎn)染miR-26b-5p inhibitor和sh-HMGA1后，下調(diào)HMGA1表達(dá)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)，因此推測(cè)下調(diào)miR-26b-5p表達(dá)能夠通過(guò)靶向作用促進(jìn)HMGA1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-26b的表達(dá)，可在卵巢癌細(xì)胞發(fā)揮抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用；而HMGA1表達(dá)顯著上升[6-8]，那么抑制其表達(dá)，同樣可發(fā)揮抑癌作用。本文機(jī)制探索為腫瘤靶向治療提供新視角，例如，既往有研究報(bào)道，miR-26b-5p模擬物轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞可抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡，而用miR-26b-5p抑制劑轉(zhuǎn)染槐耳(草本天然菌)處理A549細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)槐耳抗腫瘤作用，提示可通過(guò)探索腫瘤分子機(jī)制通路，采用特定藥物進(jìn)行腫瘤靶向治療[9]。眾所周知，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是引發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖侵襲的重要進(jìn)程[10]，可導(dǎo)致細(xì)胞極性的喪失，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲和抗凋亡能力。通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，基本可推測(cè)miR-26b-5p靶向調(diào)控HMGA1表達(dá)調(diào)控卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制：上調(diào)miR-26b-5p表達(dá)和沉默HMGA1基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)且抑制Vimentin表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞侵襲和遷移[11]。本研究結(jié)果提示，miR-26b-5p具有逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力，進(jìn)一步降低細(xì)胞侵襲和遷移能力。與此同時(shí)，基于本研究探索可知，miRNA與靶基因關(guān)聯(lián)復(fù)雜多樣，單個(gè)miRNA可靶向多個(gè)靶基因且單個(gè)靶基因亦可受多個(gè)miRNA調(diào)控[12]；此種復(fù)雜的靶向和調(diào)控關(guān)系，提示卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化還存在其他機(jī)制性靶點(diǎn)[13，14]，從而影響卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，可為卵巢癌及其他腫瘤的分子靶向治療提供幫助。

綜上所述，miR-26b-5p在卵巢癌中低表達(dá)，HMGA1高表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-26b-5p抑制卵巢癌細(xì)胞中HMGA1和Vimentin表達(dá)并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，降低細(xì)胞侵襲和遷移，從而抑制卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但其意義是否顯著還有待進(jìn)一步探究。