李莉 王應(yīng)霞 楊桂梅 尹健彬 張旋

[摘要] 目的 研究黃藤素對(duì)急性肺損傷（ALI）小鼠肺組織核因子-κB（NF-κB）表達(dá)和激活的影響。 方法 雄性SPF昆明小鼠60只按照抽簽法隨機(jī)分為6組（每組10只）：ALI組[氣管滴入5 mg/kg脂多糖（LPS）]，正常對(duì)照組（假手術(shù)處理），陽性對(duì)照組（3.3 mg/kg氫化可的松注射液+ LPS），黃藤素低、中、高劑量組（2、10 mg/kg和50 mg/kg黃藤素注射液+LPS）。陽性藥物和黃藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達(dá)與定位。采用Western blot法檢測(cè)磷酸化NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 與ALI組比較，黃藤素中、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB p65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的陽性細(xì)胞百分率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與ALI組比較，黃藤素低、中、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃藤素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有防治作用，該作用與抑制NF-κB蛋白表達(dá)和激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃藤素;急性肺損傷;脂多糖;核因子-κB;蛋白表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R563.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（a）-0007-04

Effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of NF-κB in lung tissues of mice with acute lung injury

LI Li1? ?WANG Yingxia2? ?YANG Guimei3? ?YIN Jianbin3? ?ZHANG Xuan3

1.Biotherapy Center， the 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University Tumor Hospital of Yunnan Province， Yunnan Province， Kunming? ?650106， China; 2.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming? ?650032， China; 3.School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming? ?650500， China

[Abstract] Objective To study the effect of Fibrauretin on the protein expression and activation of nuclear factor kappa B （NF-κB） in lung tissues of mice with acute lung injury （ALI）. Methods Sixty male SPF Kunming mice were randomly divided into 6 groups by drawing lots （10 mice in each group）： ALI group [（intratracheal instillation of 5 mg/kg lipopolysaccharide （LPS）]， normal control group （sham operation）， positive control group （3.3 mg/kg Hydrocortisone Injection + LPS）， low， medium and high doses of Fibrauretin groups （2， 10 mg/kg and 50 mg/kg Fibrauretin Injection + LPS）. The positive drug and Fibrauretin were given by intraperitoneal injection once a day for 3 consecutive days before establishment of ALI model. Immunohistochemistry was used to detect the expression and localization of NF-κB p65 protein in lung tissues. Western blot was used to detect the expression of phosphorylated NF-κB p65 protein in lung tissues. Results Compared with ALI group， the percentage of positive cells with the entry of NF-κB p65 protein into the nucleus in lung tissues of mice in medium and high doses of Fibrauretin groups was decreased significantly， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with ALI group， the protein expression of phosphorylated NF-κB p65 in lung tissues of mice in low， medium and high doses of Fibrauretin group was down-regulated significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Fibrauretin has preventive effect on LPS-induced acute lung injury in mice， and the effect is related to the inhibition of the protein expression and activation of NF-κB.

[Key words] Fibrauretin; Acute lung injury; Lipopolysaccharide; NF-κB; Protein expression

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種臨床常見危重病癥，發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI可由多種原因引起，如細(xì)菌感染、創(chuàng)傷、毒氣吸入、機(jī)械通氣等，其中細(xì)菌感染最多見[1-2]。ALI起病急、進(jìn)展快，嚴(yán)重危及患者生命[3]。故ALI往往需要迅速及時(shí)治療。然而，目前臨床治療措施和藥物治療效果并不理想，因此研發(fā)新型高效低毒的ALI防治藥物非常必要。

黃藤素是我國(guó)研制的純天然植物藥，成分為鹽酸巴馬汀，具有抗菌、消炎、清熱解毒等多種功效，因此被稱為“植物抗生素”[4-6]。黃藤素臨床主要用于各種炎癥和感染性疾病，如婦科炎癥、菌痢、腸炎、呼吸道及泌尿道感染等。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素能夠明顯減輕脂多糖致ALI小鼠肺組織炎性反應(yīng)[7]。然而，黃藤素抗ALI的作用機(jī)制尚不清楚。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、組織損傷、腫瘤生長(zhǎng)等多種過程[8-9]。NF-κB信號(hào)通路是重要的炎癥信號(hào)通路，而ALI的本質(zhì)是肺內(nèi)失控性炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路激活在ALI發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[10-11]。因此，本研究旨在探討黃藤素對(duì)ALI時(shí)肺組織NF-κB表達(dá)和激活的影響，初步闡明黃藤素抗ALI的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑

黃藤素注射液購自昆藥集團(tuán)股份有限公司，氫化可的松注射液購自百正藥業(yè)股份有限公司;戊巴比妥鈉購自Merk公司;脂多糖（O111：B4）購自Sigma公司;NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65多克隆抗體、GAPDH抗體購自Elabscience公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自TIANGEN公司;RIPA高效蛋白裂解液購自Solarbio公司;蛋白Marker購自Thermo公司。免疫組化試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

健康雄性SPF級(jí)昆明小鼠60只，體重18～22 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。在恒溫、恒濕環(huán)境、明暗各12 h周期的飼養(yǎng)室常規(guī)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。按抽簽法隨機(jī)分為6組：ALI組（手術(shù)暴露氣管，用微量注射器經(jīng)氣管滴入5 mg/kg脂多糖，隨后將小鼠直立旋轉(zhuǎn)2周），正常對(duì)照組（假手術(shù)處理），陽性對(duì)照組（3.3 mg/kg氫化可的松注射液+脂多糖），黃藤素低、中、高劑量組（2、10 mg/kg和50 mg/kg黃藤素注射液+脂多糖），每組10只。陽性藥物和黃藤素均在模型建立前腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。在氣管滴入脂多糖后24 h處死小鼠，取出肺組織檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。ALI模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：組織結(jié)構(gòu)上觀察到肺泡腔明顯縮小、部分肺泡塌陷，肺泡間隔增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，NF-κB免疫組化染色細(xì)胞核染為棕色，表明炎癥信號(hào)激活，發(fā)生急性肺部炎癥。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)NF-κB表達(dá)和定位

常規(guī)制作病理切片;常規(guī)脫蠟、脫水;阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶;微波抗原修復(fù);血清工作液封閉，37℃ 10 min;滴加NF-κB p65一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3×5 min;滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;滴加HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min;DAB染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核深染為棕褐色為陽性細(xì)胞，表明NF-κB激活進(jìn)入細(xì)胞核。

1.4 Western blot法檢測(cè)磷酸化NF-κB蛋白表達(dá)

常規(guī)提取蛋白;行SDS-PAGE電泳;常規(guī)轉(zhuǎn)膜;進(jìn)行免疫反應(yīng)：用0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入包被液，室溫2 h;棄包被液，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入p-NF-κBp65一抗（4℃ 12 h）。棄一抗和1% mol/L BSA，0.01 mol/L PBS分別洗膜，5 min×3次;加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2 h;棄二抗，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×3次;加入顯色液;凝膠成像儀檢測(cè)，使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度測(cè)定，以GADPH為內(nèi)參計(jì)算p-NF-κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃藤素對(duì)ALI小鼠肺組織NF-κB表達(dá)和定位的作用

與正常對(duì)照組比較，ALI組小鼠肺組織肺泡腔明顯縮小、部分肺泡塌陷，肺泡間隔增厚，免疫組化染色顯示肺組織細(xì)胞核被深染為棕色，表明NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核，NF-κB激活，肺內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)。正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，棕色著色淺，且主要分布于細(xì)胞漿，細(xì)胞核為藍(lán)色，表明NF-κB未激活;與ALI組比較，陽性對(duì)照組、黃藤素中劑量和黃藤素高劑量組小鼠肺組織棕色著色較淺，細(xì)胞核棕染的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，各組陽性細(xì)胞百分率均較正常對(duì)照組明顯降低（P < 0.01）;陽性對(duì)照組、黃藤素中劑量組陽性細(xì)胞百分率低于ALI組（P < 0.05）;黃藤素中劑量和高劑量能夠明顯減少陽性細(xì)胞百分率，與ALI組和黃藤素低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;黃藤素高劑量組陽性細(xì)胞百分率也明顯低于正常對(duì)照組及陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1～2。

A：ALI組;B：正常對(duì)照組;C：陽性對(duì)照組;D：黃藤素低劑量組;E：黃藤素中劑量組;F：黃藤素高劑量組。ALI：急性肺損傷;NF-κB：核因子-κB和核定位（免疫組化，100×）? ?與正常對(duì)照組比較，**P < 0.01;與ALI組比較，#P < 0.05;與陽性對(duì)照組比較，$P < 0.05;與低劑量組（黃藤素低劑量組）比較，&P < 0.05。ALI：急性肺損傷;NF-κB：核因子-κB

2.2 黃藤素抑制ALI小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，ALI組、陽性對(duì)照組及黃藤素低、中高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯均上調(diào)，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與ALI組比較，黃藤素低、中、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;與陽性對(duì)照組比較，黃藤素低、高劑量組小鼠肺組織磷酸化NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），但黃藤素的劑量依賴關(guān)系不明顯。見圖3～4。

3 討論

目前臨床上ALI的主要治療措施為保護(hù)性肺通氣和應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，然而療效并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，一些天然產(chǎn)物可以通過抑制炎癥信號(hào)通路發(fā)揮抗ALI的作用，如姜黃素、人參皂苷Rg5、迷迭香酸、異佛司可林等[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素能夠明顯抑制ALI小鼠肺內(nèi)炎性反應(yīng)，減輕肺損傷程度，但其抗急性肺損傷的機(jī)制尚不清楚[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路過度激活在ALI時(shí)炎癥細(xì)胞因子過度釋放中發(fā)揮重要作用[10-11]。各種引起ALI的因素均可激活NF-κB，啟動(dòng)下游多種炎癥因子過度表達(dá)，導(dǎo)致ALI[13-14]。因此，NF-κB過度激活是ALI發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制NF-κB激活能夠減輕ALI。黃藤素能否通過抑制NF-κB激活而減輕ALI呢？研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素可通過抑制TRIF依賴的NF-κB信號(hào)通路而抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[15]。據(jù)此推測(cè)，黃藤素可能通過抑制NF-κB的激活從而發(fā)揮抗ALI作用。

NF-κB一般以二聚體（主要為p50/p65）形式存在于細(xì)胞漿中，未激活時(shí)與NF-κB抑制蛋白（IκB）結(jié)合，形成無活性復(fù)合體[16-18]。IκB有多種亞型，其中IκBα最重要，抑制NF-κB作用最強(qiáng)[19]。細(xì)胞外刺激信號(hào)可通過細(xì)胞膜受體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，IκB即被磷酸華，繼而被泛素化，失去活性，釋放出游離的NF-κB，NF-κB即被磷酸化激活，隨后進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)靶基因表達(dá)[20-22]。因此，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核是NF-κB激活的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，與ALI組比較，黃藤素中劑量和高劑量組小鼠肺組織NF-κB p65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明黃藤素能夠明顯抑制NF-κB激活，有一定劑量依賴關(guān)系。

NF-κB磷酸化水平也可反映其激活情況，因此，本研究采用Western blot法檢測(cè)了磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ALI時(shí)肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示NF-κB被激活，而低、中、高劑量黃藤素均能下調(diào)肺組織磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)，表明黃藤素能夠抑制NF-κB信號(hào)通路激活，發(fā)揮抗ALI作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃藤素抑制ALI小鼠肺炎性反應(yīng)有一定劑量依賴關(guān)系[7]。但本研究中黃藤素下調(diào)磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)的劑量依賴關(guān)系不明顯，其原因可能是Western blot法檢測(cè)樣本只是整個(gè)肺組織的一部分，氣管滴入脂多糖在肺局部分布不均造成的。

綜上所述，黃藤素能夠明顯下調(diào)ALI小鼠肺組織NF-κB表達(dá)，并抑制NF-κB磷酸化水平，從而抑制NF-κB信號(hào)通路激活，發(fā)揮抗ALI的作用。本研究初步發(fā)現(xiàn)了黃藤素抗ALI作用機(jī)制之一是抑制了肺內(nèi)炎癥相關(guān)NF-κB信號(hào)通路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Butt Y，Kurdowska A，Allen TC. Acute Lung Injury：a clinical and molecular review [J]. Arch Pathol Lab Med，2016， 140（4）：345-350.

[2]? Rebetz J，Semple JW，Kapur R. The Pathogenic Involvement of Neutrophils in Acute Respiratory Distress Syndrome and Transfusion-Related Acute Lung Injury [J]. Transfus Med Hemother，2018，45（5）：290-298.

[3]? Nova Z，Skovierova H，Calkovska A. Alveolar-Capillary Membrane-Related Pulmonary Cells as a Target in Endotoxin-Induced Acute Lung Injury [J]. Int J Mol Sci，2019， 20（4）.pii：E831.

[4]? 趙武，陸榮寶，劉偉，等.黃藤素研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：267-271.

[5]? Mai CT，Wu MM，Wang CL，et al. Palmatine attenuated dextran sulfate sodium （DSS）-induced colitis via promoting mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inactivation [J]. Mol Immunol，2019，105：76-85.

[6]? 李耘，呂媛，劉健，等.黃藤素與臨床常用抗菌藥物體外聯(lián)合抗菌作用研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（7）：821-823.

[7]? 王應(yīng)霞，楊桂梅，胡艷文，等.黃藤素注射液抗脂多糖致小鼠急性肺損傷的作用[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（12）：12-15.

[8]? 孫婷，陳泉，肖繼，等.NF-κB亞基泛素化研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2018，49（3）：217-221.

[9]? 李凡，常彥青，丁軍.下丘腦核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的臨床研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28（11）：113-116.

[10]? 舒彬，劉真，賈赤宇.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華損傷與修復(fù)雜志：電子版，2016，11（2）：147-150.

[11]? 施榮，熊旭東，王倩.TRAF6-NF-κB/p38MAPK通路活性在膿毒癥致急性肺損傷中肺泡巨噬細(xì)胞過度極化的作用及炎調(diào)方干預(yù)的可能性探討[J].臨床急診雜志，2018，19（1）：37-39.

[12]? Patel VJ，Biswas Roy S，Mehta HJ，et al. Alternative and Natural Therapies for Acute Lung Injury and Acute Respiratory Distress Syndrome [J]. Biomed Res Int，2018， 2018：2476824.

[13]? Lin MH，Chen MC，Chen TH，et al. Magnolol ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats through PPAR-γ-dependent inhibition of NF-κB activation [J]. Int Immunopharmacol，2015，28（1）：270-278.

[14]? Fan Z，Yao J，Li Y，et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of curcumin on acute lung injury in a rodent model of intestinal ischemia reperfusion by inhibiting the pathway of NF-κB [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（4）：3451-3459.

[15]? Yan B，Wang D，Dong S，et al. Palmatine inhibits TRIF-dependent NF-κB pathway against inflammation induced by LPS in goat endometrial epithelial cells [J]. Int Immunopharmacol，2017，45：194-200.

[16]? Tang X，Sun L，Wang G，et al. RUNX1：A Regulator of NF-κB Signaling in Pulmonary Diseases [J]. Curr Protein Pept Sci，2018，19（2）：172-178.

[17]? 羅清，劉萌，廖俊城.NF-κB信號(hào)通路影響慢性阻塞性肺疾病進(jìn)展的研究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2019， 19（6）：124-126.

[18]? 朱慧，平鍵，徐列明.NF-κB通路在肝纖維化進(jìn)展和中藥抗肝纖維化機(jī)制中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2018， 34（4）：858-861.

[19]? Suzuki J，Ogawa M，Muto S，et al. Novel IκB kinase inhibitors for treatment of nuclear factor-κB-related disease [J]. Expert Opin Investig Drugs，2011，20（3）：395-405.

[20]? Tóbon-Velasco JC，Cuevas E，Torres-Ramos MA. Receptor for AGEs （RAGE） as mediator of NF-κB pathway activation in neuroinflammation and oxidative stress [J]. CNS Neurol Disord Drug Targets，2014，13（9）：1615-1626.

[21]? 薛鳳麟，張旋，王殿華.核因子-κB與肺疾病研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（3）：552-554.

[22]? 李恩琪，帥訓(xùn)軍，閆戰(zhàn)秋，等.Toll樣受體4/NF-κB信號(hào)通路在依達(dá)拉奉影響單肺通氣患者炎性細(xì)胞因子中的作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（32）：4-7.