李棟宇，魏從文，宮靜，鐘輝，汪浩勇

1. 湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢430068；2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100850；3. 安徽大學(xué)，安徽 合肥230000

人5 型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）早期區(qū)域1A（early region 1A，E1A）基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其通過2 個(gè)外顯子的可變剪接來編碼2 種主要蛋白質(zhì)，而這2 種早期病毒蛋白（長(zhǎng)度為243～289 個(gè)氨基酸殘基）可以激活或抑制幾種病毒或細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期到達(dá)抑癌作用[1-2]。Ad5E1A 還具有轉(zhuǎn)化和反式激活活性。通過直接競(jìng)爭(zhēng)RB1 蛋白上的相同結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)從RB1 中分離出E2F1 轉(zhuǎn)錄因子，E2F1 的釋放導(dǎo)致ARF 蛋白介導(dǎo)的MDM2 被抑制并導(dǎo)致TP53/p53 積累，因?yàn)樗辉偈荕DM2 介導(dǎo)的泛素化降解的目標(biāo)。反過來，TP53 的增加將阻止細(xì)胞增殖并介導(dǎo)其死亡[3]。雖然Ad5E1A 已被確定是一種有效的轉(zhuǎn)錄激活因子，但人們對(duì)其如何改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄知之甚少[4]。原發(fā)性肝癌（肝癌）惡性程度高，預(yù)后極差，手術(shù)、化療的療效均不佳，近年來基因治療和細(xì)胞治療已成為有效的新型療法。現(xiàn)有研究表明，Ad5 對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[5]，但是其抑制機(jī)制尚不明確。

高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）是一種跨膜糖蛋白，2000 年由Kladney 等[6]發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，GP73 可作為肝癌診斷的標(biāo)志物[7-8]。GP73在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，但在各種原因引發(fā)的肝臟疾病中，幾乎所有肝細(xì)胞均有表達(dá)，特別是結(jié)締組織周邊和肝硬化結(jié)節(jié)部位表達(dá)尤其強(qiáng)烈[9]。70%以上的肝癌病人，GP73 蛋白在血清及肝組織中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)[10]。多篇文章報(bào)道GP73 在肝癌組織和血清中呈高表達(dá)，張宏冰等發(fā)現(xiàn)mTORC1 能夠通過調(diào)節(jié)GP73 促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[11]。已有研究證實(shí)了GP73 在肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，GP73 對(duì)腫瘤微環(huán)境具有重要的調(diào)節(jié)作用。之前研究未報(bào)道Ad5E1A 與GP73 的相互作用，因此探討Ad5E1A 基因?qū)P73 的表達(dá)具有重要的科學(xué)意義。本研究中，我們?cè)诟伟┘?xì)胞HepG2 中過表達(dá)Ad5E1A 基因，并觀察其對(duì)GP73 表達(dá)水平的影響以及肝癌細(xì)胞的增殖情況，為下一步研究肝癌發(fā)生機(jī)制，開發(fā)新型治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細(xì)胞HEK293T、肝癌細(xì)胞HepG2（本實(shí)驗(yàn)室保存）；pcDNA3-Flag-GP73（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）；腺病毒（李山虎教授贈(zèng)與）；大腸桿菌DH5α（北京擎科生物科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4DNA 連接酶（TaKaRa 公司）；膠回收試劑盒（Promega 公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（天根公司）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 生物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；anti-Myc 抗體、anti-Flag 抗體、anti-Tubulin 抗體（Sigma-Aldrich 公司）；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME（Polyplus 公司）；100 mmol/L 青霉素（華北制藥集團(tuán)）；100 mmol/L 鏈霉素（山東魯抗集團(tuán)）；引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 Ad5E1A基因真核表達(dá)載體pcDNA3-Flag-Ad5E1A（Flag-Ad5E1A）的構(gòu)建

以腺病毒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物和pcDNA3-Flag-Vetor 質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物于室溫下連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素篩選壓力下于LB 培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆在LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增，進(jìn)行菌液PCR 鑒定及測(cè)序。通過NCBI Blast進(jìn)行序列比對(duì)，序列正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及免疫印跡分析

細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 中，轉(zhuǎn)染前24 h 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前1 h 更換一半新鮮的DMEM 培養(yǎng)基，按說明書要求配制質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合液，滴加入細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h 后補(bǔ)充另一半培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，1×PBS 沖洗3 次，3000 r/min 離心3 min 后棄上清。加人適量NP-40 裂解液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%NP40］，冰上裂解細(xì)胞15 min，12 000 r/min 冷凍離心后取上清，加入4×SDS 緩沖液［10%甘油，2%十二 烷基 磺 酸鈉，50 mmol/L Tris-Cl（pH6.8），2.5% β-巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)］，沸水浴10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清進(jìn)行SDSPAGE，半干法轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h，一抗和二抗分別室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min，將Perkin Elmer 的ECL發(fā)光液均勻涂在PVDF 膜上，暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3-Flag-Ad5E1A真核表達(dá)載體的構(gòu)建

按1.2 所述方法，首先對(duì)目的基因Ad5E1A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖1A，在750～1000 bp 處出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，與目的片段Ad5E1A（870 bp）相符。構(gòu)建pcDNA3-Flag-Ad5E1A 真核表達(dá)載體，隨機(jī)挑選平板上的3 個(gè)單克隆菌落，分別編號(hào)為1、2、3，在含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1B，5-1、5-3 泳道750～1000 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與目的片段Ad5E1A 相符。選取5-1、5-3 號(hào)對(duì)應(yīng)的菌液測(cè)序，結(jié)果正確，命名為pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

2.2 Flag-Ad5E1A在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

將Flag-Ad5E1A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，通過免疫印跡檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)，結(jié)果如圖2，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T 細(xì)胞中均得到表達(dá)，產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量約33×103，與預(yù)期相符。

2.3 Ad5E1A基因過表達(dá)后對(duì)HepG2細(xì)胞中GP73表達(dá)的影響

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Ad5E1A 基因擴(kuò)增產(chǎn)物（A），菌液PCR 鑒定插入目的基因片段（B）

實(shí)驗(yàn)組為過表達(dá)GP73 的HepG2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ad5E1A 基 因，對(duì) 照組為 過表達(dá)GP73 的HepG2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-Vector，各組均在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞，用含10% β-巰基乙醇的SDS 裂解液裂解細(xì)胞，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖3，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的GP73 表達(dá)水平明顯降低。

2.4 pcDNA3-Flag-Ad5E1A抑制GP73表達(dá)進(jìn)而影響HepG2細(xì)胞增殖

將HepG2 細(xì)胞均分為4 組，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，分析細(xì)胞增殖情況。與轉(zhuǎn)染Flag-GP73組相比，Ad5E1A 組的抑制率為17.5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而與轉(zhuǎn)染Flag-GP73 組比，共轉(zhuǎn)Ad5E1A 和GP73 組的抑制率為37.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。因此可以看出，Ad5E1A 基因的抑制HepG2 細(xì)胞增殖作用與GP73相關(guān)。抑制率（%）=（對(duì)照組D450nm值-實(shí)驗(yàn)組D450nm值）/對(duì)照組D450nm值。

圖2 HEK293T 細(xì)胞中Flag-Ad5E1A 蛋白的表達(dá)

圖3 Ad5E1A 基因過表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞中GP73 表達(dá)的影響

圖4 單獨(dú)轉(zhuǎn)染GP73 和共轉(zhuǎn)GP73、Ad5E1A 時(shí)HepG2 細(xì)胞的增殖情況

3 討論

肝癌作為發(fā)病率和病死率極高的癌癥之一，一直都是科研人員以及臨床工作者努力攻克的難題[12]。GP73 是維持動(dòng)物正常生存以及肝腎生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)GP73 有可能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標(biāo)志物，因此GP73 的生理和病理作用受到廣泛關(guān)注[13]。之前研究表明GP73 診斷臨床肝癌的敏感性和特異性分別高達(dá)77%和93%，說明GP73可以作為早期肝癌診斷的標(biāo)志物。早前我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)GP73 和CD206 的高表達(dá)與肝癌預(yù)后不良有關(guān)，現(xiàn)有研究也已經(jīng)提供了關(guān)聯(lián)GP73和致癌作用機(jī)制的一些見解，包括基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）的激活。此外，GP73 對(duì)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有免疫依賴性。GP73 可通過下調(diào)IL-12A 的表達(dá)使抗腫瘤淋巴細(xì)胞Th1 作用減弱。人Ad5E1A 基因作為腺病毒的極早期基因，具有抑癌基因的特性，攜帶E1A 基因而E1B 和E3 基因缺陷的腺病毒可靶向性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖, 擴(kuò)大殺傷腫瘤效果，同時(shí)又不會(huì)使原代細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。Ad5E1A 基因影響轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，可以觀察到當(dāng)轉(zhuǎn)入所構(gòu)建的Ad5E1A 基因時(shí)，HepG2 細(xì)胞中GP73 的表達(dá)水平顯著減低。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)過表達(dá)GP73 相比，共同過表達(dá)Ad5E1A 和GP73 時(shí)肝癌細(xì)胞增殖水平被抑制。之前報(bào)道GP73 的表達(dá)水平與肝癌有密不可分的關(guān)系，然而兩者之間的機(jī)制尚不明確。近年來靶向治療成為熱點(diǎn)，因此構(gòu)建人Ad5E1A 基因表達(dá)載體，研究其與GP73 之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)于靶向治療肝癌有重要的參考價(jià)值，可為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。