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        5型腺病毒E1A基因通過調(diào)控GP73的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖的初步研究

        2019-09-27 02:26:54李棟宇魏從文宮靜鐘輝汪浩勇
        生物技術(shù)通訊 2019年4期
        關(guān)鍵詞:凝膠電泳瓊脂糖腺病毒

        李棟宇,魏從文,宮靜,鐘輝,汪浩勇

        1. 湖北工業(yè)大學(xué),湖北 武漢430068;2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所,北京100850;3. 安徽大學(xué),安徽 合肥230000

        人5 型腺病毒(adenovirus type 5,Ad5)早期區(qū)域1A(early region 1A,E1A)基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,其通過2 個(gè)外顯子的可變剪接來編碼2 種主要蛋白質(zhì),而這2 種早期病毒蛋白(長(zhǎng)度為243~289 個(gè)氨基酸殘基)可以激活或抑制幾種病毒或細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期到達(dá)抑癌作用[1-2]。Ad5E1A 還具有轉(zhuǎn)化和反式激活活性。通過直接競(jìng)爭(zhēng)RB1 蛋白上的相同結(jié)合位點(diǎn),誘導(dǎo)從RB1 中分離出E2F1 轉(zhuǎn)錄因子,E2F1 的釋放導(dǎo)致ARF 蛋白介導(dǎo)的MDM2 被抑制并導(dǎo)致TP53/p53 積累,因?yàn)樗辉偈荕DM2 介導(dǎo)的泛素化降解的目標(biāo)。反過來,TP53 的增加將阻止細(xì)胞增殖并介導(dǎo)其死亡[3]。雖然Ad5E1A 已被確定是一種有效的轉(zhuǎn)錄激活因子,但人們對(duì)其如何改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄知之甚少[4]。原發(fā)性肝癌(肝癌)惡性程度高,預(yù)后極差,手術(shù)、化療的療效均不佳,近年來基因治療和細(xì)胞治療已成為有效的新型療法。現(xiàn)有研究表明,Ad5 對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[5],但是其抑制機(jī)制尚不明確。

        高爾基蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是一種跨膜糖蛋白,2000 年由Kladney 等[6]發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn),GP73 可作為肝癌診斷的標(biāo)志物[7-8]。GP73在正常肝組織中幾乎不表達(dá),但在各種原因引發(fā)的肝臟疾病中,幾乎所有肝細(xì)胞均有表達(dá),特別是結(jié)締組織周邊和肝硬化結(jié)節(jié)部位表達(dá)尤其強(qiáng)烈[9]。70%以上的肝癌病人,GP73 蛋白在血清及肝組織中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)[10]。多篇文章報(bào)道GP73 在肝癌組織和血清中呈高表達(dá),張宏冰等發(fā)現(xiàn)mTORC1 能夠通過調(diào)節(jié)GP73 促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[11]。已有研究證實(shí)了GP73 在肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),GP73 對(duì)腫瘤微環(huán)境具有重要的調(diào)節(jié)作用。之前研究未報(bào)道Ad5E1A 與GP73 的相互作用,因此探討Ad5E1A 基因?qū)P73 的表達(dá)具有重要的科學(xué)意義。本研究中,我們?cè)诟伟┘?xì)胞HepG2 中過表達(dá)Ad5E1A 基因,并觀察其對(duì)GP73 表達(dá)水平的影響以及肝癌細(xì)胞的增殖情況,為下一步研究肝癌發(fā)生機(jī)制,開發(fā)新型治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人胚胎腎細(xì)胞HEK293T、肝癌細(xì)胞HepG2(本實(shí)驗(yàn)室保存);pcDNA3-Flag-GP73(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建);腺病毒(李山虎教授贈(zèng)與);大腸桿菌DH5α(北京擎科生物科技有限公司);限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ,T4DNA 連接酶(TaKaRa 公司);膠回收試劑盒(Promega 公司);質(zhì)粒提取試劑盒(天根公司);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 生物公司);胎牛血清(杭州四季青公司);anti-Myc 抗體、anti-Flag 抗體、anti-Tubulin 抗體(Sigma-Aldrich 公司);脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME(Polyplus 公司);100 mmol/L 青霉素(華北制藥集團(tuán));100 mmol/L 鏈霉素(山東魯抗集團(tuán));引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。

        1.2 Ad5E1A基因真核表達(dá)載體pcDNA3-Flag-Ad5E1A(Flag-Ad5E1A)的構(gòu)建

        以腺病毒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物和pcDNA3-Flag-Vetor 質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物于室溫下連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,在氨芐青霉素篩選壓力下于LB 培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆在LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增,進(jìn)行菌液PCR 鑒定及測(cè)序。通過NCBI Blast進(jìn)行序列比對(duì),序列正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及免疫印跡分析

        細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 中,轉(zhuǎn)染前24 h 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前1 h 更換一半新鮮的DMEM 培養(yǎng)基,按說明書要求配制質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合液,滴加入細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng),4~6 h 后補(bǔ)充另一半培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞,1×PBS 沖洗3 次,3000 r/min 離心3 min 后棄上清。加人適量NP-40 裂解液[10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1%NP40],冰上裂解細(xì)胞15 min,12 000 r/min 冷凍離心后取上清,加入4×SDS 緩沖液[10%甘油,2%十二 烷基 磺 酸鈉,50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8),2.5% β-巰基乙醇,0.1%溴酚藍(lán)],沸水浴10 min,12 000 r/min 離心10 min,取上清進(jìn)行SDSPAGE,半干法轉(zhuǎn)到PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h,一抗和二抗分別室溫孵育1 h,TBST 洗3 次,每次5 min,將Perkin Elmer 的ECL發(fā)光液均勻涂在PVDF 膜上,暗室顯影。

        2 結(jié)果

        2.1 pcDNA3-Flag-Ad5E1A真核表達(dá)載體的構(gòu)建

        按1.2 所述方法,首先對(duì)目的基因Ad5E1A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖1A,在750~1000 bp 處出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶,與目的片段Ad5E1A(870 bp)相符。構(gòu)建pcDNA3-Flag-Ad5E1A 真核表達(dá)載體,隨機(jī)挑選平板上的3 個(gè)單克隆菌落,分別編號(hào)為1、2、3,在含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行菌液PCR 鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1B,5-1、5-3 泳道750~1000 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶,與目的片段Ad5E1A 相符。選取5-1、5-3 號(hào)對(duì)應(yīng)的菌液測(cè)序,結(jié)果正確,命名為pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

        2.2 Flag-Ad5E1A在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

        將Flag-Ad5E1A 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞,通過免疫印跡檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá),結(jié)果如圖2,構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T 細(xì)胞中均得到表達(dá),產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量約33×103,與預(yù)期相符。

        2.3 Ad5E1A基因過表達(dá)后對(duì)HepG2細(xì)胞中GP73表達(dá)的影響

        圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Ad5E1A 基因擴(kuò)增產(chǎn)物(A),菌液PCR 鑒定插入目的基因片段(B)

        實(shí)驗(yàn)組為過表達(dá)GP73 的HepG2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ad5E1A 基 因,對(duì) 照組為 過表達(dá)GP73 的HepG2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-Vector,各組均在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),24 h 后收集細(xì)胞,用含10% β-巰基乙醇的SDS 裂解液裂解細(xì)胞,進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖3,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的GP73 表達(dá)水平明顯降低。

        2.4 pcDNA3-Flag-Ad5E1A抑制GP73表達(dá)進(jìn)而影響HepG2細(xì)胞增殖

        將HepG2 細(xì)胞均分為4 組,用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值,分析細(xì)胞增殖情況。與轉(zhuǎn)染Flag-GP73組相比,Ad5E1A 組的抑制率為17.5%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而與轉(zhuǎn)染Flag-GP73 組比,共轉(zhuǎn)Ad5E1A 和GP73 組的抑制率為37.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。因此可以看出,Ad5E1A 基因的抑制HepG2 細(xì)胞增殖作用與GP73相關(guān)。抑制率(%)=(對(duì)照組D450nm值-實(shí)驗(yàn)組D450nm值)/對(duì)照組D450nm值。

        圖2 HEK293T 細(xì)胞中Flag-Ad5E1A 蛋白的表達(dá)

        圖3 Ad5E1A 基因過表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞中GP73 表達(dá)的影響

        圖4 單獨(dú)轉(zhuǎn)染GP73 和共轉(zhuǎn)GP73、Ad5E1A 時(shí)HepG2 細(xì)胞的增殖情況

        3 討論

        肝癌作為發(fā)病率和病死率極高的癌癥之一,一直都是科研人員以及臨床工作者努力攻克的難題[12]。GP73 是維持動(dòng)物正常生存以及肝腎生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)GP73 有可能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標(biāo)志物,因此GP73 的生理和病理作用受到廣泛關(guān)注[13]。之前研究表明GP73 診斷臨床肝癌的敏感性和特異性分別高達(dá)77%和93%,說明GP73可以作為早期肝癌診斷的標(biāo)志物。早前我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)GP73 和CD206 的高表達(dá)與肝癌預(yù)后不良有關(guān),現(xiàn)有研究也已經(jīng)提供了關(guān)聯(lián)GP73和致癌作用機(jī)制的一些見解,包括基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)的激活。此外,GP73 對(duì)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有免疫依賴性。GP73 可通過下調(diào)IL-12A 的表達(dá)使抗腫瘤淋巴細(xì)胞Th1 作用減弱。人Ad5E1A 基因作為腺病毒的極早期基因,具有抑癌基因的特性,攜帶E1A 基因而E1B 和E3 基因缺陷的腺病毒可靶向性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖, 擴(kuò)大殺傷腫瘤效果,同時(shí)又不會(huì)使原代細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。Ad5E1A 基因影響轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),可以觀察到當(dāng)轉(zhuǎn)入所構(gòu)建的Ad5E1A 基因時(shí),HepG2 細(xì)胞中GP73 的表達(dá)水平顯著減低。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)過表達(dá)GP73 相比,共同過表達(dá)Ad5E1A 和GP73 時(shí)肝癌細(xì)胞增殖水平被抑制。之前報(bào)道GP73 的表達(dá)水平與肝癌有密不可分的關(guān)系,然而兩者之間的機(jī)制尚不明確。近年來靶向治療成為熱點(diǎn),因此構(gòu)建人Ad5E1A 基因表達(dá)載體,研究其與GP73 之間的關(guān)聯(lián),對(duì)于靶向治療肝癌有重要的參考價(jià)值,可為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

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