范筱,劉宇,鄭鵬,張英羽

(1.青島市市立醫(yī)院,青島 266011;2.福建中醫(yī)藥大學(xué),福州 350122;3.青島市西海岸新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,青島266500)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的世界性難題,其病理過程主要包括原發(fā)性脊髓損傷階段和繼發(fā)性脊髓損傷階段[1]。炎癥在 SCI 的病理反應(yīng)中扮演重要角色。持續(xù)高水平炎癥導(dǎo)致?lián)p傷處組織發(fā)生炎性浸潤、血管通透性改變、損傷區(qū)域擴(kuò)大、血小板凝集能力改變等引起組織水腫、缺血、細(xì)胞壞死和凋亡等不利于損傷修復(fù)的結(jié)果。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia, MG)是神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞,被認(rèn)為是損傷后炎癥的發(fā)動者和調(diào)控者。在生理狀態(tài)下,MG 處于靜止?fàn)顟B(tài)[2],對神經(jīng)系統(tǒng)有重要的支持和營養(yǎng)作用。一旦損傷發(fā)生,受損組織和細(xì)胞會釋放大量三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)。ATP 作為 MG 的天然激動劑,可使MG 活化而發(fā)生極化,MG 的形態(tài)及功能發(fā)生改變而參與介導(dǎo)炎癥。隨著損傷持續(xù)和加劇,MG被過度激化,引起白細(xì)胞介素 1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素 18(Interleukin-18, IL-18)等大量炎性因子釋放,高濃度的炎性因子進(jìn)一步加重?fù)p傷,形成惡性循環(huán)[3]。臨床實踐中,電針已廣泛應(yīng)用于治療脊髓損傷,對脊髓損傷引起的運動功能障礙、感覺功能障礙以及尿潴留等并發(fā)癥均具有良好的治療效果,可有效緩解SCI 后出現(xiàn)的中樞性疼痛、腸道功能障礙以及肌肉痙攣等情況[4];并且電針可有效降低SCI大鼠脊髓損傷處促炎性因子表達(dá)水平,抑制炎癥[5]。但是,電針抑制SCI 后炎癥的深入作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在研究電針是否通過抑制 MG 活化介導(dǎo)的炎癥而有利于 SCI 后神經(jīng)元修復(fù),進(jìn)一步明確電針治療 SCI的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

36 只 2 月齡 SPF 級 Sprague-Dawley 大鼠(雌雄各半),體重(220±20)g,購于上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司,許可證號[SCXK(滬)2014-0006],飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。實驗過程及方法符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會要求。采用隨機(jī)數(shù)字表法將上述大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組,每組12 只。

1.2 主要試劑及儀器

一抗,山羊抗 IBA-1 抗體(Abcam,美國)、小鼠抗ED-1 抗體(Abcam,美國)、兔抗 Caspase1(p20)抗體;二抗,驢抗山羊 Alexa Fluor 568 熒光二抗(Thermo Fisher,美國),驢抗小鼠 Alexa Fluor 488 熒光二抗(Thermo Fisher,美國);DAPI 染色液(博士德,武漢);尼氏染色液(索萊寶,北京);Triton-100(Sigma,美國);IL-1βElisa 試劑盒、IL-18 Elisa 試劑盒(西塘生物,上海)。

不銹鋼毫針(0.30 mm×25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電針儀(G6805,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);NYU 脊髓打擊器(W.M.Keck 神經(jīng)科學(xué)協(xié)作中心,美國);熒光顯微鏡(Leica DMI 4000B/DFC425C,德國);Imagelab、Image-Pro 圖像分析系統(tǒng)(BIORADHERCULES,美國)。

1.3 制備脊髓損傷模型

根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]制備SCI 模型。具體操作為,將7%水合氯醛腹腔注射,注射劑量為5 mL/kg;麻醉成功后,將大鼠背部 T9-11部位備皮,消毒;沿背部 T9-11部位中線作長約 3 cm 切口,去除棘突及橫突兩側(cè)附著的肌肉,咬骨鉗去除椎板,暴露脊髓;調(diào)整 NYU 打擊器,保證打擊桿對準(zhǔn)脊髓,固定大鼠,釋放打擊桿,使質(zhì)量為 10 g的打擊桿自12.5 mm 高度自由下落,撞擊脊髓,見大鼠后肢回縮抽搐及尾部痙攣性擺動則提示造模成功;沖洗傷口,逐層縫合。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng),注意保暖,每日人工按摩膀胱2 次。

1.4 各組大鼠處理方法

電針組和模型組采用上述方法制備SCI 模型。電針組大鼠自術(shù)后第 1 天開始給予電針干預(yù),取穴為脊髓損傷節(jié)段上下兩對夾脊穴[7],具體定位參考《實驗針灸學(xué)》[8]。進(jìn)針角度均為斜刺,深度約為 2 mm;使用 2根電線,1 號出口線正負(fù)極分別連接左側(cè)上下夾脊穴,2 號出口線正負(fù)極分別連接右側(cè)上下夾脊穴;電針儀參數(shù)為連續(xù)波,頻率為 2 Hz,電流強度為 1～3 mA,以大鼠安靜耐受、后肢及針體輕輕抖動為宜,每日 1次,每次 20 min。假手術(shù)組和模型組每日同一時間同等條件下抓取20 min 后回籠飼養(yǎng),不予任何治療。

1.5 取材

干預(yù)3 d 后進(jìn)行取材。麻醉成功后,每只大鼠采集靜脈血;每組6 只大鼠采用4%多聚甲醛灌注固定,取損傷處脊髓段約 2 cm,放入 4%多聚甲醛固定 48 h;另 6只大鼠采用直接取材,取損傷處脊髓段約 2 cm,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測方法

1.6.1 尼氏染色

將5 μm 厚石蠟組織切片采用梯度乙醇依次復(fù)溫,放入二甲苯溶液中脫蠟,梯度乙醇浸泡至水,將切片浸入尼氏染色液在60℃溫箱中染色50 min,磷酸鹽緩沖液漂洗 3 次,分色液分色 2 min,晾干,中性樹膠封片,鏡下觀察并拍片。

1.6.2 Elisa 檢測

將采集的大鼠靜脈血離心后,取血清,按照 Elisa試劑盒說明進(jìn)行操作,主要步驟依次為加樣,洗板,加入一抗工作液并反應(yīng)20 min,洗板,加入酶標(biāo)抗體工作液,洗板,加入底物工作液,加入終止液,酶標(biāo)儀450 nm檢測吸光度值,依次檢測大鼠靜脈血清中 IL-1β和IL-18 含量。

1.6.3 免疫熒光染色

將5 μm 厚石蠟組織切片采用梯度乙醇依次復(fù)溫,放入二甲苯溶液中脫蠟,梯度乙醇浸泡,漂洗后用枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù),血清封閉1 h,甩掉封閉液不洗,滴加 IBA-1 一抗(1：200)和 ED-1 一抗(1：200)混合液4℃過夜;次日復(fù)溫后,磷酸鹽緩沖溶液漂洗,避光滴加Alexa Fluor 568(1：200)和 Alexa Fluor 488 (1：200)熒光二抗混合液,室溫孵育2 h,磷酸鹽緩沖溶液漂洗,避光滴加DAPI 染色液,室溫孵育3 min,磷酸鹽緩沖漂洗,抗熒光淬滅封片劑封片,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍片。

1.6.4 Western Blot

將保存?zhèn)溆玫募顾杞M織加入裂解液,冰浴60 min。提取組織中的蛋白質(zhì),離心后 BCA 法定量蛋白,100℃加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性。蛋白變性后,將樣品于相應(yīng)濃度的SDS-PAGE 凝膠電泳分離,電壓為80 V 持續(xù)20 min,調(diào)整電壓為120 V 持續(xù)90 min。轉(zhuǎn)膜,封閉,加入Caspase1(p20) 一 抗 (1：1000)4 ℃ 過 夜 ,加 入 二 抗(1：1000)孵育 2 h。漂洗掉二抗后開始顯影。將膜置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng) 1 min,在避光條件下顯影,凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對神經(jīng)元形態(tài)的影響

假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞內(nèi)可見豐富的虎斑樣尼氏體;模型組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,部分神經(jīng)元水腫明顯,可見神經(jīng)元溶解、液化后形成的空泡樣結(jié)構(gòu),尼氏體碎裂;電針組神經(jīng)元形態(tài)較模型組改善,雖然可見少量神經(jīng)元水腫以及空泡樣結(jié)構(gòu)形成,但程度較模型組輕,尼氏體較飽滿。詳見圖1。

圖1 各組神經(jīng)元形態(tài)(×200)

2.2 電針對炎性因子表達(dá)的影響

Elisa 結(jié)果見表 1,假手術(shù)組血清中炎性因子IL-1β和 IL-18 含量較低,模型組血清中 IL-1β和IL-18 含量較高;與假手術(shù)組相比,模型組和電針組血清中IL-1β和IL-18 含量顯著增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組血清中 IL-1β和IL-18 含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組血清中l(wèi)L-1β和lL-18 含量比較 (±s,pg/mL)

表1 各組血清中l(wèi)L-1β和lL-18 含量比較 (±s,pg/mL)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別n IL-1β IL-18假手術(shù)組 6 2.26±0.18 1.74±0.21模型組 6 29.88±0.751) 19.39±0.971)電針組 6 14.37±0.561)2) 12.76±0.631)2)

2.3 電針對MG 活化的影響

由圖2 可見,IBA-1 陽性細(xì)胞呈紅色,為小膠質(zhì)細(xì)胞;ED-1 陽性細(xì)胞呈綠色,為被激活的小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞;IBA1/ED1 雙陽性細(xì)胞呈黃色,為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。陽性反應(yīng)細(xì)胞均呈樹椏狀,散在分布于脊髓中。

圖2 各組lBA1/ED1 雙陽性細(xì)胞表達(dá)情況

由表 2 可見,與假手術(shù)組比較,模型組和電針組IBA1/ED1 雙陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組IBA1/ED1 雙陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 3組免疫熒光陽性細(xì)胞計數(shù)比較 (±s)

表2 3組免疫熒光陽性細(xì)胞計數(shù)比較 (±s)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別n IBA1/ED1假手術(shù)組 6 2.83±0.83模型組 6 14.83±2.241)電針組 6 9.50±1.381)2)

2.4 電針對 cleaved-Caspase1(p20)蛋白表達(dá)的影響

由圖3 可見,假手術(shù)組cleaved-Caspase1(p20)蛋白表達(dá)量較低,模型組p20 蛋白表達(dá)量較高。

圖3 各組Caspase1(p20)蛋白表達(dá)情況

表3 各組cleaved-Caspase1(p20)蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

表3 各組cleaved-Caspase1(p20)蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別n Caspase1(p20)假手術(shù)組 6 0.34±0.03模型組 6 0.82±0.051)電針組 6 0.64±0.041)2)

由表 3 可見,與假手術(shù)組比較,模型組和電針組cleaved-Caspase1(p20)蛋白表達(dá)量顯著增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組cleaved-Caspase1(p20)蛋白表達(dá)量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

炎癥是 SCI 發(fā)生后重要的病理反應(yīng)之一,炎癥釋放的大量炎性因子以及炎性細(xì)胞浸潤、聚集是導(dǎo)致神經(jīng)元壞死、凋亡、自噬,軸突脫髓鞘,血管通透性改變和水腫等病理變化的重要原因[9-10]。MG 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細(xì)胞,在 SCI 發(fā)生后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。急性脊髓損傷發(fā)生后,脊髓中的固有MG 是損傷后大量炎性因子包括IL-1β、IL-6 和TNF-α的主要來源,從而介導(dǎo)炎癥。SCI 發(fā)生后活化小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群迅速向損傷區(qū)域聚集,在損傷后3 d 左右即可達(dá)到高峰,發(fā)揮浸潤和吞噬作用[11-12]。因此,本研究選擇損傷后3 d 作為時間點進(jìn)行觀察。SCI 發(fā)生后,破裂的細(xì)胞和損傷的組織釋放的ATP激活MG后,MG極化為M1 狀態(tài)和M2 狀態(tài)。M1 狀態(tài)的MG 主要促進(jìn)炎性介質(zhì)特別是炎性因子的釋放,而M2狀態(tài)的MG主要發(fā)揮抑制炎性介質(zhì)的作用。但是,在SCI 持續(xù)損傷的狀態(tài)下,大部分MG向M1狀態(tài)發(fā)生極化而導(dǎo)致炎癥加劇并形成惡性循環(huán)。同時,MG 活化介導(dǎo)炎癥的主要機(jī)制與MG活化后細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān)。在 ATP 的作用下,MG 細(xì)胞膜通透性改變,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈉離子、鉀離子和鈣離子失衡,進(jìn)一步活化 Caspase1,使其被剪切為具有酶切活性的 Caspase1(p20),Caspase1(p20)對IL-1β前體和IL-18 前體進(jìn)去剪切,使其成熟為具有促炎作用的炎性因子并釋放到細(xì)胞外[13]。SCI 發(fā)生后,活化 MG 參與的炎癥反應(yīng)對神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)來說是一把雙刃劍。一方面,損傷早期輕度MG 活化和炎癥反應(yīng)有利于清除壞死細(xì)胞和組織碎片,保護(hù)未損傷組織,促進(jìn)組織修復(fù)[15];另一方面,隨著損傷持續(xù)及損傷-炎癥惡性循環(huán),過度MG 活化和持續(xù)高水平炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)及細(xì)胞毒性物質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞壞死、凋亡、神經(jīng)退行性變等阻礙組織修復(fù)的病理結(jié)果[16]。由此可見,SCI后如何有效針對MG活化進(jìn)行干預(yù),通過降低MG活化程度進(jìn)而維持低水平炎癥是治療SCI 的新思路和切入點。

SCI 中醫(yī)學(xué)的病因病機(jī)為跌仆損傷致經(jīng)脈受損,氣血瘀阻,氣血運行不暢,下肢失養(yǎng)所致。治療當(dāng)以益氣活血、通督復(fù)髓為原則[17]。電針刺激具有活血通經(jīng)、調(diào)暢督脈上下的功效,因此電針治療脊髓損傷符合中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論。夾脊穴是腰背部的重要穴位,走行于督脈和足太陽膀胱經(jīng)之間。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,夾脊穴與上下、左右和前后經(jīng)脈之氣借助氣街路徑而相互聯(lián)系溝通,成為聯(lián)絡(luò)溝通督脈和足太陽膀胱經(jīng)脈氣的傳輸點。同時,從人體生理解剖方面來說,夾脊穴與脊神經(jīng)節(jié)段分布有密切關(guān)系。刺激夾脊穴可有效刺激脊神經(jīng)的前支和后支,從而影響交感神經(jīng)而調(diào)節(jié)人體臟腑功能活動與氣血運行[18]。臨床實踐中,對SCI 患者施以電針夾脊穴治療,對于改善SCI 患者肢體運動功能、感覺功能以及膀胱功能等均有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn),電針組SCI 大鼠脊髓組織中神經(jīng)元形態(tài)可見較明顯改善,同時血清中促炎性因子 IL-1β和 IL-18 含量顯著減少,這進(jìn)一步證實電針夾脊穴確能通過抑制炎癥而有利于損傷后神經(jīng)元修復(fù)。但是,關(guān)于電針抑制炎癥的機(jī)制研究尚少,電針是如何抑制SCI 后炎癥尚不十分清楚。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),電針抑制SCI后MG活化程度,同時降低具有酶切作用的 Caspase1(p20)蛋白的表達(dá);同時電針干預(yù)可有效降低SCI 大鼠血清中炎性因子IL-1β和IL-18 含量。因此,鑒于MG 活化對炎癥的重要介導(dǎo)作用以及Caspase1(p20)在MG 活化介導(dǎo)炎癥過程中對無活性IL-1β和IL-18 的重要酶切作用,推測SCI 發(fā)生后,電針干預(yù)可抑制MG 活化并抑制 Caspase1(p20)蛋白表達(dá),從而使具有促炎效應(yīng)的IL-1β和IL-18 生成較少,這可能是電針降低SCI 后IL-1β和IL-18 含量抑制炎癥的主要原因之一。因此,本研究說明電針抑制SCI后炎癥而有利于神經(jīng)元形態(tài)改善的機(jī)制與其抑制 SCI后MG 活化介導(dǎo)的炎癥有關(guān)。