成玉,牛天慧,郭廣進(jìn),呂景晶,馬莉,趙廣,周冬梅

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;2.空軍總醫(yī)院,北京 100042;3.首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069)

白癜風(fēng)是一種進(jìn)行性脫色性疾病,以皮膚或黏膜色素減退為特征,該疾病會(huì)影響患者的外在形象,對(duì)患者的生活質(zhì)量影響較大。目前白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論,但已經(jīng)確定表皮功能性黑素細(xì)胞破壞是其主要的病理基礎(chǔ)[1]。目前臨床治療白癜風(fēng)的方法較多,主要包括糖皮質(zhì)激素治療、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑治療、光療等[2],但臨床療效不確切,治愈率還有待提高,因此探究其他高效治療白癜風(fēng)的方法具有重要的臨床意義。艾灸是一種利用點(diǎn)燃的艾絨在腧穴上熏灼的療法,艾灸治療白癜風(fēng)由來(lái)已久,是治療白癜風(fēng)有效的方法之一,我國(guó)《白癜風(fēng)中醫(yī)治療專家共識(shí)》在非藥物外治療法中也推薦了艾灸療法[3],但目前對(duì)于艾灸治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制尚處于初級(jí)研究階段。鑒于目前的研究現(xiàn)狀,本研究對(duì)豚鼠進(jìn)行艾灸治療,并在治療結(jié)束后的不同時(shí)間段采用豚鼠血清體外培養(yǎng)正常人黑素細(xì)胞,觀察艾灸血清對(duì)正常人黑素細(xì)胞的增殖、黑素含量和酪氨酸酶活性的影響,從調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞角度,探討艾灸治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制,以期為艾灸治療白癜風(fēng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組

豚鼠購(gòu)自于南京安立默科技有限公司,許可證號(hào)[SCK(蘇)2010-0002],雌雄兼?zhèn)?體重 250～350 g,雌雄分籠飼養(yǎng),隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為空白對(duì)照組、T-1 組(艾灸治療結(jié)束后即刻)、T-2 組(艾灸治療結(jié)束后1 個(gè)月)、T-3組(艾灸治療結(jié)束后2 個(gè)月)、T-4 組(艾灸治療結(jié)束后 3 個(gè)月)。各組豚鼠背部脫毛約2 cm×2 cm,除空白對(duì)照組外,其余4 組豚鼠均進(jìn)行艾灸治療,取穴為經(jīng)外奇穴“灸癜風(fēng)”和“阿是穴”?！熬鸟帮L(fēng)”取穴參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物穴位圖譜,以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)模擬定位[4]?！鞍⑹茄ā奔措嗍蟊巢棵撁珔^(qū)。穴上3 cm 處懸灸,采用溫和灸補(bǔ)法,每穴每次約10 min,灸至動(dòng)物發(fā)出嘶叫聲、不能耐受為度。每日1 次,艾灸治療療程為1 個(gè)月?？瞻讓?duì)照組僅采用同法固定,不進(jìn)行艾灸治療。

1.2 采集艾灸血清樣本

艾灸治療結(jié)束后即刻及1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月后,采集豚鼠血清。依據(jù)文獻(xiàn)[5]經(jīng)腹主動(dòng)脈采血(無(wú)菌操作),將所取動(dòng)脈血靜置 1 h 后,以 1500 r/min 轉(zhuǎn)速,離心 10 min,提取血清,0.22 μm 濾器過(guò)濾分裝后,置于-80oC 冰箱中存儲(chǔ)待測(cè)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與接種

采用M-254-500型培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司),體外培養(yǎng)人黑素細(xì)胞(北京清源昊生物科技有限公司)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑素細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105/mL,接種于96 孔板,150 μL/孔(用于細(xì)胞增殖檢測(cè));或接種于6 cm 平皿,2 mL/孔(用于細(xì)胞周期、黑素含量和酪氨酸酶活性測(cè)定)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞完全貼壁。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)(CCK-8 法)

5%、10%及 15%濃度的各組血清,分別處理人黑素細(xì)胞 24 h。棄上清,加入 100 μL CCK-8 溶液,37oC 孵育4 h,測(cè)定450 nm 吸光度值(OD 值),空白試劑作為校正。細(xì)胞增殖率(%)＝[(實(shí)驗(yàn)組平均OD 值-空白試劑平均 OD 值)/(對(duì)照組平均 OD 值-空白試劑平均 OD 值)]×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

5%濃度的各組血清,分別處理人黑素細(xì)胞 24 h。胰酶消化后收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次,加入乙醇,4oC 固定30 min,棄去上清,預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞 1 次,嚴(yán)格參照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Becton-Dickinson 公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,依次加入200 μL PBS 緩沖液和 5 μL RNA 酶,37oC 孵育 30 min,加入 0.5 mL PI 溶液(50 μg/mL),避光孵育 30 min,過(guò)濾(300 μm 尼龍網(wǎng)模)后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 黑素含量測(cè)定(NaOH 溶解法)

5%濃度的各組血清,分別處理人黑素細(xì)胞 24 h。收集細(xì)胞沉淀,1 M NaOH 溶液處理細(xì)胞,測(cè)定 450 nm吸光度值(OD 值),空白試劑作為校正。黑素含量影響率(%)＝[(實(shí)驗(yàn)組平均 OD 值-空白試劑平均 OD 值)/(對(duì)照組平均OD 值-空白試劑平均OD 值)]×100%。

1.7 酪氨酸酶活性測(cè)定(左旋多巴氧化法)

5%濃度的各組血清,分別處理人黑素細(xì)胞 24 h。收集細(xì)胞沉淀,PBS 緩沖液洗滌2 次,加入90 μL 細(xì)胞裂解液TritonX-100(10 mL/L),充分震蕩溶解后,加入10 μL 左旋多巴溶液(1%),37oC 孵育 30 min,測(cè)定450 nm 吸光度值(OD 值),空白試劑作為校正。酪氨酸酶活性增長(zhǎng)率(%)＝[(實(shí)驗(yàn)組平均OD 值-空白試劑平均OD 值)/(對(duì)照組平均OD 值-空白試劑平均OD 值)]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SAS9.2 軟件。對(duì)每組計(jì)量資料數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多種數(shù)據(jù)之間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),經(jīng)驗(yàn)證后,多組獨(dú)立樣本的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);兩組獨(dú)立樣本的比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾灸血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組5%和10%艾灸血清之間,經(jīng)單因素方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝14.677,P＝0.001;F＝8.386,P＝0.009),而各組 15%艾灸血清之間無(wú)差異(F＝0.576,P＝0.582)。

LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,艾灸血清濃度為 5%時(shí),T-1組和 T-2 組的細(xì)胞增殖均分別高于空白對(duì)照組(t＝18.326,P＝0.000;t＝20.897,P＝0.000),且 T-2 組的細(xì)胞增殖高于T-1 組(t＝5.843,P＝0.000);艾灸血清濃度為10%時(shí),T-2 組的細(xì)胞增殖高于空白對(duì)照組(t＝18.642,P＝0.000)。成組t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,T-2 組 5%艾灸血清的細(xì)胞增殖高于 T-2 組 10%艾灸血清(t＝9.415,P＝0.000)。詳見(jiàn)圖1。

依據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用5%艾灸血清24 h 進(jìn)行研究。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,艾灸血清濃度為5%時(shí),T-2 組和T-3組的S 期細(xì)胞比例均分別高于空白對(duì)照組(t＝21.534,P＝0.000;t＝16.248,P＝0.000)。詳見(jiàn)圖2A、2B。

2.2 艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞中黑素含量的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示,各組人黑素細(xì)胞中黑素含量之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝52.850,P＝0.000)。LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,T-1 組、T-2 組、T-3組和T-4 組的人黑素細(xì)胞中的黑素含量均高于空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝13.259,P＝0.000;t＝59.157,P＝0.000;t＝32.746,P＝0.000;t＝12.327,P＝0.000)。

此外,T-2 組的人黑素細(xì)胞中的黑素含量分別高于 T-1 組、T-3組和 T-4 組(t＝40.940,P＝0.000;t＝15.779,P＝0.000;t＝29.918,P＝0.000)。詳見(jiàn)圖3。說(shuō)明艾灸血清能夠增加體外培養(yǎng)人黑素細(xì)胞黑素含量,而且這種影響作用在艾灸治療結(jié)束后 3 個(gè)月均存在,尤其在艾灸治療結(jié)束后1 個(gè)月(T-2 組)的效果最為明顯。

圖1 各組不同濃度艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞活性的影響

圖2 艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞周期的影響

圖3 各組艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞黑素含量的影響

2.3 艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示,各組人黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝26.988,P＝0.000);LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,T-2 組和T3組人黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶活性均高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝59.157,P＝0.000;t＝32.746,P＝0.000),且T-2組的人黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶活性高于T-3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.653,P＝0.000)。詳見(jiàn)圖4。說(shuō)明艾灸血清可增加體外培養(yǎng)人黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性,而且這種影響作用在艾灸治療結(jié)束后 1 個(gè)月(T-2 組)最明顯。

圖4 各組艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響

3 討論

白癜風(fēng)屬中醫(yī)學(xué)“白癜”“白駁風(fēng)”“白駁”“駁白”“斑白”“斑駁”等范疇,患者皮損為局限性或泛發(fā)性的白斑片,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為局部皮損變化與臟腑氣血盛衰存在密切的關(guān)系,白色主寒證、虛證、脫血、奪氣,《靈樞·五色》：“青黑為痛,黃赤為熱,白為寒?！薄端貑?wèn)·皮部論》：“其色多青則痛,多黑則痹,黃赤則熱,多白則寒,五色皆見(jiàn)則寒熱也。”可見(jiàn)白癜風(fēng)辨證應(yīng)屬寒[6-9]。“寒者熱之,熱者寒之”是中醫(yī)學(xué)治療的重要思路,白癜風(fēng)屬寒,故應(yīng)“從寒辨治”,艾灸療法通過(guò)溫?zé)嶂桶~的功效能起到溫經(jīng)散寒、升陽(yáng)舉陷、扶陽(yáng)固脫、行氣通絡(luò)的功效,《五十二病方?白處》中就有火灸治療白癜風(fēng)的記載[10],之前的臨床研究亦顯示,艾灸治療白癜風(fēng)有確切的療效[11-14]。目前對(duì)艾灸治療白癜風(fēng)作用機(jī)制的研究較少,尚處于初級(jí)研究階段,本研究就此展開(kāi)探討。

在前期臨床試驗(yàn)中,本課題組發(fā)現(xiàn)部分多處皮損的白癜風(fēng)患者除靶皮損之外的皮損也出現(xiàn)了復(fù)色的現(xiàn)象,因此推測(cè)在艾灸治療的過(guò)程中機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一些活性物質(zhì)促進(jìn)白斑復(fù)色,且不僅僅是局部皮膚組織中存在這些活性物質(zhì),血清中可能也存在。戴歷群等[15]研究證實(shí)艾灸血清可抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 的表達(dá),這也從側(cè)面說(shuō)明了艾灸治療產(chǎn)生的活性物質(zhì)存在于血清中。皮膚和毛囊中的黑素細(xì)胞合成的黑素體轉(zhuǎn)移到周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞,進(jìn)而形成皮膚色素[16],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,在免疫、神經(jīng)精神等因素的作用下導(dǎo)致黑素細(xì)胞功能障礙或缺失是白癜風(fēng)的病理基礎(chǔ),因此黑素細(xì)胞的增殖及其活性對(duì)白癜風(fēng)患者皮膚復(fù)色起著決定性的作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),艾灸血清可促進(jìn)人黑素細(xì)胞增殖、黑素合成,且可增加酪氨酸酶活性,但對(duì)其遠(yuǎn)期的作用尚不清楚[17-18]。本研究結(jié)果顯示,艾灸治療結(jié)束后,艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞的細(xì)胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性仍有影響,且隨著時(shí)間的推移,艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞的細(xì)胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性的影響程度呈現(xiàn)出先上升后下降的峰型變化,以 T-2 時(shí)間點(diǎn)的影響最為顯著,可見(jiàn)艾灸治療白癜風(fēng)存在遠(yuǎn)期效應(yīng),在艾灸治療結(jié)束后 1 個(gè)月仍能顯著影響人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究艾灸血清對(duì)人黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性的影響,T1 組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有升高作用的趨勢(shì);T2 組開(kāi)始顯示差異,說(shuō)明艾灸對(duì)酪氨酸酶影響作用緩慢,但持久,在艾灸治療結(jié)束后仍有持續(xù)增高作用,并在艾灸治療結(jié)束后1 個(gè)月達(dá)到最高,且下降緩慢,結(jié)束艾灸2 個(gè)月與第1 個(gè)月統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異,結(jié)束艾灸治療第3 個(gè)月下降才較為明顯。因此,艾灸治療緩效,但持久,治療結(jié)束后仍有持續(xù)增高作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),艾灸血清可能是通過(guò)影響SCF/c-kit 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)起到調(diào)節(jié)人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[16]。在后續(xù)的研究中將繼續(xù)研究艾灸治療結(jié)束后艾灸血清對(duì)c-kit、SCF 蛋白表達(dá)的影響,以進(jìn)一步分析艾灸治療白癜風(fēng)存在遠(yuǎn)期效應(yīng)的可能機(jī)制。

綜上所述,艾灸血清可有效促進(jìn)人黑素細(xì)胞增殖、黑素含量和酪氨酸酶活性,而且這種影響作用在艾灸結(jié)束后3個(gè)月都存在,尤其在艾灸治療結(jié)束后1個(gè)月該效果最為明顯。提示艾灸對(duì)人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)存在遠(yuǎn)期效應(yīng)。本研究為臨床采用艾灸治療白癜風(fēng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。