柳 凱，宿明星，王宏飛，李秋莉

(遼寧師范大學生命科學學院 遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室 遼寧 大連116081)

轉(zhuǎn)錄因子可以與基因的啟動子結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達，對基因的表達調(diào)控具有重要作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其命名來源于矮牽牛(PetuniahybridaVilm)的NAM及擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh)的ATAF1/2和CUC2是由Souer等第一個發(fā)現(xiàn)[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育以及抵抗生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。

遼寧堿蓬(SuaedaliaotungensisKitag.)屬于黎科堿蓬屬，是一種典型的鹽生植物，其體內(nèi)存在著耐鹽適應(yīng)的復雜機制，是研究植物耐鹽堿機理的良好材料[3]。本實驗室先前已經(jīng)成功克隆得到了遼寧堿蓬SlNAC1、SlNAC2、SlNAC8基因，并將其轉(zhuǎn)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)其增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥抵抗非生物脅迫的能力[4-6]。本研究將根據(jù)遼寧堿蓬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的EST序列，獲得遼寧堿蓬SlNAC4轉(zhuǎn)錄因子基因，并對SlNAC4進行原核表達。為進一步研究遼寧堿蓬SlNAC4轉(zhuǎn)錄因子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料

遼寧堿蓬(SuaedaliaotungensisK.)采自遼寧省大連市營城子鹽場。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株

克隆載體pEASY-T1 Simple Vector購自TransGen Biotech，表達載體pGEX-4T-1為實驗室保存；大腸桿菌DH5a感受態(tài)和Rosetta菌株購自北京全式金生物有限公司。

1.1.3 實驗試劑

DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 5000、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0限制性內(nèi)切酶、T4-DNA Ligation Enzyme、RNase等購自TaKaRa，2×EasyTaq Super Mix、卡那霉素購自TransGen Biotech。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫高速離心機(美國Thermo公司)；PCR儀,(美國Bio-Rad公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；無菌超凈工作臺(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)

1.3 實驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

稱取100 mg遼寧堿蓬葉片，采用TRIZOL法提取堿蓬葉片總RNA，瓊脂糖凝膠電泳、分光光度法檢測RNA的完整性及純度。以總RNA為模板,使用PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time(Takara)試劑盒，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一條鏈。

1.2.2SlNAC4基因EST序列驗證

根據(jù)遼寧堿蓬轉(zhuǎn)錄組測序獲得的SlNAC4的EST序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性引物 4-EST-F、4-EST-R(表1)。以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物，并送至寶生物公司測序。

1.2.3SlNAC4基因3′RACE 擴增

將測序結(jié)果與已知SlNAC4 EST序列進行比對，獲得SlNAC4 EST準確序列，經(jīng)與其他NAC序列比對，發(fā)現(xiàn)SlNAC4基因的3′端缺失。根據(jù)已確認的EST序列設(shè)計物NAC4-3-Outer、NAC4-3-Inner(表1)，以cDNA為模板，采用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0試劑盒(Takara)進行3′端的擴增。將最終的Inner PCR反應(yīng)產(chǎn)物回收，送至寶生物公司測序，將獲得的序列與EST序列拼接。

1.2.4SlNAC4基因的克隆

以拼接好的序列為模板，設(shè)計引物NAC4-全長-F、NAC4-全長-R(表1)。以cDNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物回收后測序，獲得SlNAC4 cDNA序列。將SlNAC4克隆至pEASY-T1載體。

1.2.5SlNAC4基因的生物信息學分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線軟件Blast，對遼寧堿蓬SlNAC4序列進行相似性和同源性分析；用Conserved domain finder程序分析遼寧堿蓬SlNAC4保守結(jié)構(gòu)域；利用ORF Finder軟件分析其開放閱讀框；BioEdit軟件進行多重序列比對，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建NJ進化樹。

1.2.6 原核表達SlNAC4蛋白

將SlNAC4基因與表達載體pGEX-4T-1用BamHI和EcoRI同時進行雙酶切，再用DNA連接酶連接，構(gòu)建pGEX-NAC4重組表達載體。將pGEX-NAC4重組表達載體導入大腸桿菌Rosetta中，37℃、160 r/min、IPTG濃度分別為0.1mM、0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1 mM條件下誘導表達SlNAC4蛋白。

表1 PCR反應(yīng)引物，由上海生工生物有限公司合成Table 1 PCR reaction primer, synthesized by Shanghai bioindustrial biology Co.Ltd

2 實驗結(jié)果

2.1 遼寧堿蓬葉片總RNA提取

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的遼寧堿蓬RNA(圖1)，其中28SrRNA、18SrRNA條帶整齊無明顯拖尾，且?guī)瓦吘壉容^清楚，表明提取RNA沒有降解。分光光度法測定OD260/OD280值為2.0，表明提取的RNA純度較高。

2.2 SlNAC4基因EST序列驗證

以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，對已知的SlNAC4 EST序列進行驗證(圖2)，獲得了850 bp左右的片段，將測序結(jié)果與原序列比對，獲得了準確的SlNAC4 EST序列。

圖1遼寧堿蓬葉片總RNA電泳圖M: DL2000 DNA Marker; 1，2: 遼寧堿蓬葉片總RNAFig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of leaf S. liaotungensis M: DL2000 DNA Marker; 1, 2: The total RNA of S. liaotungensis

圖2 SlNAC4 EST片段電泳圖 M: DL2000 DNA Marker; 1:SlNAC4 EST片段Fig.2 The EST sequence of SlNAC4 verification electropherogram M: DL2000 DNA Marker;1: The fragment of SlNAC4 EST

2.3 SlNAC4基因 3′RACE

在確定SlNAC4 EST序列基礎(chǔ)上進行3′RACE，得到了1700 bp左右的Outer PCR產(chǎn)物和1500 bp左右的Inner PCR產(chǎn)物,經(jīng)回收測序，得到了SlNAC4基因3′端序列，3′端序列有poly(A)結(jié)構(gòu)。

圖3 SlNAC4 3’RACE瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 SlNAC4 3'RACE agarose gel electrophoresis M: DL2000 DNA Marker; 1:SlNAC4 3' RACE outer PCR; 2:SlNAC4 3' RACE inner PCR

2.4 SlNAC4基因的克隆

將SlNAC4 EST、3′端序列拼接，得到了SlNAC4基因的cDNA序列。經(jīng)PCR測序，獲得了SlNAC4基因(圖4)。

2.5 SlNAC4基因的生物信息學分析

SlNAC4基因全長1450 bp(GenBank登錄號:KJ933531)，其中開放閱讀框為996 bp，編碼331個氨基酸(圖5)。具有保守的NAM結(jié)構(gòu)域(圖6)，NJ進化樹分析結(jié)果表明SlNAC4與剛毛檉柳(TamarixhispidaWilld)ThNAC1親源關(guān)系較近(圖7)。

2.6 原核表達SlNAC4蛋白

在37℃、160 rpm/min、不同IPTG的濃度下，誘導重組蛋白表達。結(jié)果在預測的蛋白分子量大小(63 KD)處有一條較粗的條帶，且與空載對比明顯(圖8)，因此認為重組NAC4-GST融合蛋白成功表達。

圖4 SlNAC4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 M；Maker DL2000; 1：SlNAC4 cDNAPCR產(chǎn)物Fig.4 Agarose gel electrophoresis of SlNAC4 PCR product M: Maker DL2000; 1: The product of SlNAC4 cDNA PCR

圖5 SlNAC4開放閱讀框編碼的氨基Fig. 5 Amino acid sequence encoded by the SlNAC4 open reading frame

圖6 SlNAC4的預測保守結(jié)構(gòu)Fig.6 The predicted conservative structure of SlNAC4

圖7 SlNAC4進化樹Fig.7 SlNAC4 evolution tree

圖8 37℃不同IPTG濃度誘導的蛋白表達Fig.8 Protein expression induced by different IPTG concentrations M：Protein Marker(10 kDa-180 kDa)；1：SlNAC4未誘導2：SlNAC4 0.1mM IPTG誘導；3：SlNAC4 0.25mM IPTG誘導4：SlNAC4 0.5mM IPTG誘導；5：SlNAC4 0.75mM IPTG誘導；6：SlNAC4 1mM IPTG誘導；7：pGEX空載未誘導; 8：pGEX空載0.5mM IPTG誘導；

3 討論

植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及抵抗外界生物和非生物的脅迫中發(fā)揮著十分重要的作用[7-9]。目前已從很多物種中克隆出NAC基因。王立國等克隆出了陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)GhSNAC1基因，并發(fā)現(xiàn)過表達GhSNAC1可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱耐鹽能力[10]。方義生等從大豆(GlycinemaxMerr.)中克隆了GmNAC8基因，過表達GmNAC8基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱能力[11]。He等從南荻(TriarrhenalutarioripariaL.)中克隆了MlNAC10 基因，發(fā)現(xiàn)其可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性[12]。NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點為，其N端具有一個高度保守NAM結(jié)構(gòu)域[13,14]。本研究克隆了遼寧堿蓬SlNAC4基因。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，其N端具有保守的NAM結(jié)構(gòu)域，且與剛毛檉柳ThNAC1的相似度較高。認為獲得了遼寧堿蓬NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的一個新成員-SlNAC4基因。凝膠遷移實驗是在體外驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的常用方法[15]。本研究利用大腸桿菌原核表達了SlNAC4蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗，結(jié)果在目的片段大小處得到了一條較粗的條帶，且與空載對照明顯，說明已成功獲得了SlNAC4蛋白。這將為進一步分析遼寧堿蓬SlNAC4轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)控基因打下了基礎(chǔ)。遼寧堿蓬SlNAC4基因的獲得對分析NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能、理解遼寧堿蓬的耐鹽機制具有十分重要的意義。這將為進一步分析遼寧堿蓬SlNAC4轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)控基因打下了基礎(chǔ)。遼寧堿蓬SlNAC4基因的獲得對分析NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能、理解遼寧堿蓬的耐鹽機制具有十分重要的意義。