王 碧，嚴(yán) 奇，趙友誼，王 鳴，劉 飛，廖盼華，王奇志*

(1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，江蘇南京210014；2. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京210014)

加拿大楊(PopuluscanadensisMoench)，又名加楊，是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)多年生落葉大喬木，分布廣泛，我國除廣東、云南、西藏外，其余省區(qū)均有栽培；枝葉茂密，樹干高大通直，適應(yīng)性強(qiáng)，能夠在干旱和鹽堿地栽培，是用材林、行道樹和防護(hù)林的優(yōu)良樹種[1]。楊樹周身是寶，除被用作木材外，還具有抗氧化、抗腫瘤、抗?jié)?、抗微生物、抗炎、?zhèn)痛等功效[2-4]；其中含有大量的酚酸類化合物，能有效降低高血壓、癌癥和糖尿病的發(fā)生率。此外，楊樹皮中還含有白楊素、高良姜素-3-甲氧基、喬松素、槲皮素-3,7-二甲氧基、鼠李素、山柰酚-3-甲氧基、芹菜素等黃酮類化合物[5]，對心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有作用[6]。白楊素具有抗腫瘤、放療增敏、抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化、防治心腦血管疾病等多種藥理作用[7]，也是合成抗菌、抗癌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥物的原料[8-11]。

楊樹皮化學(xué)成分的傳統(tǒng)提取分離方法主要是用熱水提取，或是水提液的乙酸乙酯萃取部位加入過量的堿式醋酸鉛后，分為沉淀和水溶液兩部分，沉淀脫鉛后和水溶液分別用聚酰胺柱層析法或逆流分配法進(jìn)行分離。然而，這些方法需用酸堿處理，環(huán)境污染大；其次，堿性環(huán)境易引起苯甲?；D(zhuǎn)移；并且用與不用鉛鹽處理而分離得到的成分也大致相同。此外，楊樹皮還含有豐富的低極性活性類脂類成分，如不飽和甾醇、維生素E、磷脂等[12]，具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價值，傳統(tǒng)提取方法導(dǎo)致其低極性部位流失，資源得不到充分利用。因此，開發(fā)簡便、準(zhǔn)確、環(huán)保的經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹皮總酚酸的提取方法具有重要意義。本實驗以總酚酸的含量為指標(biāo)，采用正交試驗法篩選楊樹皮總酚酸的最佳提取工藝，為加楊資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料

加拿大楊樹皮采自南京中山植物園，經(jīng)江蘇省中國科學(xué)院植物研究所袁昌齊研究員鑒定為楊柳科植物加拿大楊，粉碎成粗粉，備用。標(biāo)本現(xiàn)存放于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所藥用植物研究開發(fā)中心(標(biāo)本編號：pc20161019)。

1.1.2 儀器

TU-1221型紫外-可見分光光度計；石英比色皿(1 cm)；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Buchi公司)；LIBROR AEL-200型電子天平；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋。

1.1.3 試劑

白楊素對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號：111701-200501)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 楊樹皮總酚酸的提取

精密稱取經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹皮粉末1 g，三次分別加入4 mL，3 mL及3 mL的60%乙醇，浸泡30 min，加熱回流3次，每次2 h，過濾，合并濾液，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度。精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇定容，過濾，取濾液，即得。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取白楊素對照品5.000 mg，置50 mL棕色量瓶中，加60%乙醇溶解并定容，得白楊素貯備液(0.1000 mg·mL-1)；精密量取白楊素貯備液適量，用60%乙醇配制成系列濃度的對照品溶液，即得。

1.2.3 紫外吸收波長的測定

取2 mL對照品于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，以無水乙醇為參比液進(jìn)行基線校正，用紫外可見分光光度計在 200～800 nm 處掃描。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取白楊素對照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，于500 nm 處測定吸光度。以白楊素的濃度(C)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=6.6706C+0.0078，R2=0.9993，結(jié)果表明，白楊素在0～0.1002 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5 精密度試驗

取對照品溶液適量，于500 nm波長處測定吸光度，重復(fù)測定5次，結(jié)果平均吸光度為0.342，RSD為0.29%。表明精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液適量，于500 nm波長處測定吸光度，每隔20 min測定一次，結(jié)果平均吸光度為0.349，RSD為1.42%。表明樣品溶液顯色后在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.7 重復(fù)性試驗

稱取楊樹皮粉末6份，按2.1.2項下供試品溶液的制備方法制備，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長處測定吸光度，結(jié)果供試品的平均含量為10.40 mg·g-1，RSD為1.82%。表明重復(fù)性試驗良好。

1.2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的楊樹皮粉末6份，每份0.05 g，精密稱取，精密加入白楊素貯備液5 mL，按1.2.2項下供試品溶液的制備方法制備，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長處測定吸光度，平行操作6份，結(jié)果平均回收率為100.95%，RSD為2.49%。

1.2.9 樣品的測定

精密吸取正交試驗樣品1～3 mL，加入60%乙醇適當(dāng)稀釋，過濾，取濾液，即得供試品溶液。取供試品溶液適量，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長處測定吸光度，計算楊樹皮總黃酮及酚酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溶劑濃度的篩選

分別稱取10份楊樹皮粉末各10 g，置于圓底燒瓶瓶中，分別向其中加入20、30、40、50、60、70、80、90%的乙醇溶液100 mL，浸泡30 min，加熱回流2 h，過濾，得樣品提取液，按照1.2.9項下測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，60%乙醇溶液的提取得率最高，故選擇60%乙醇溶液作為提取溶劑，見表1。

表1 溶劑濃度的篩選Table 1 The selection of solvent concentration

2.1.2 回流次數(shù)的篩選

分別稱取5份楊樹皮粉末各10 g，分別加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分別提取1、2、3、4、5次，每次2 h，過濾，得樣品提取液，按照1.2.9項下測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與回流次數(shù)呈正相關(guān)；當(dāng)回流次數(shù)達(dá)到3時，總酚酸得率與液料比無關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)約能源的角度考慮，故選擇回流次數(shù)為3，見表2。

表2 回流次數(shù)的篩選Table 2 The selection of reflux times

2.1.3 回流時間的篩選

他喜歡把我介紹給他的朋友們，摟著我親昵地對他們說，你好，這是林林。他的朋友們也見怪不怪，男人嘛，對待這種事情，總是心照不宣。酒會啊，舞會啊，生日晚宴什么的，他都帶我參加，仿佛我就是他的正牌妻子。

分別稱取6份楊樹皮粉末各10 g，分別加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分別提取1、2、3、4、5 h，過濾，得樣品提取液，按照1.2.9項下測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與回流時間呈正相關(guān)；當(dāng)回流時間達(dá)到2 h時，總酚酸得率與液料比無關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)約能源的角度考慮，故選擇回流時間為2 h，見表3。

表3 回流時間的篩選Table 3 The selection of reflux time

2.1.4 液料比的篩選

分別稱取2份楊樹皮粉末各10 g，分別以料液比為3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1及30∶1的60%乙醇溶液回流提取，過濾，得樣品提取液，按照1.2.9項下測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與液料比呈正相關(guān)；當(dāng)液料比達(dá)到10∶1時，總酚酸得率與液料比無關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)省溶劑角度考慮，故選擇液料比為10:1，見表4。

表4 料液比的篩選Table 4 The selection ofthe liquid-solid ratio

2.2 正交試驗設(shè)計

為全面考察影響因素，基于前期單因素試驗結(jié)果，對影響提取效果的主要因素設(shè)計了4因素3水平的L9(34)正交試驗，按照1.2.9項下測定方法進(jìn)行含量測定，以白楊素提取率為指標(biāo)，對最佳提取條件進(jìn)行研究，正交試驗因素與水平見表5、試驗結(jié)果見表6、方差分析結(jié)果見表7。

表5 正交試驗因素與水平Table 5 The factors oforthogonal experimental design

2.3 正交樣品溶液的制備

分別稱取楊樹皮粉末10 g，按照L9(34)正交試驗表提取樣品，加相應(yīng)提取溶媒定容至一定體積，即得正交樣品溶液。

2.4正交試驗方法及結(jié)果

用L9(34)正交試驗表進(jìn)行正交試驗研究，試驗結(jié)果見表6，并對總黃酮及酚酸的含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

由表7能夠直觀地看出，以總酚酸含量為考察指標(biāo)，影響含量的因素依次為A>D>B>C，即乙醇濃度的影響最高，其余依次是液料比、回流次數(shù)，影響最小的是回流提取時間。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，A因素對提取的影響有顯著性差異，B和D因素對提取的影響無顯著性差異。根據(jù)表6各因素k的變化，A2>A3>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，D2>D3>D1，得出A、C和D因素應(yīng)選擇水平2，B因素應(yīng)選擇水平3，即A2B3C2D2。最終確定楊樹皮總酚酸的最佳提取工藝條件為：A2B3C2D2，即使用60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比為10∶1。

表6 正交試驗結(jié)果及分析Table 6 The results andanalysis of orthogonal experimental design

表7 方差分析結(jié)果Table 7 The results ofanalysis of variance

2.5 最佳提取工藝條件的驗證

按照上述最佳提取條件進(jìn)行3次驗證試驗，其結(jié)果見表8。由驗證結(jié)果可知，按最佳工藝條件提取得到的總酚酸提取率均高于其它各正交試驗值，三份樣品總酚酸的平均提取率為28.34%，RSD為1.37%。說明該工藝穩(wěn)定、可靠，達(dá)到了提取條件優(yōu)化的目的。

表8 驗證試驗結(jié)果Table 8 The results of verification tests

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗采用紫外分光光度法，在200～ 800 nm范圍內(nèi)對白楊素對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行掃描，于500 nm處測定吸光度，操作簡單，干擾少，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2 楊樹皮的主要成分是酚酸類化合物，以白楊素的含量為考察指標(biāo)進(jìn)行了L9(34)正交試驗，確定了最佳提取工藝條件為：以60%乙醇為溶媒，提取3次，每次2 h，總液料比為10∶1。驗證實驗表明，該提取工藝穩(wěn)定可行，適用于加拿大楊的工業(yè)化提取。

3.3 綜上所述，對于經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹皮有效成分的提取可采用較低濃度的乙醇在適當(dāng)?shù)臏囟群突亓鲿r間下進(jìn)行提取，既避免了用甲醇提取以降低毒性，又提高了提取率。因此，本實驗對于加拿大楊樹皮有效成分的提取達(dá)到了工序短、易操作和成本低的目的，改進(jìn)了加工工藝，為加拿大楊的工業(yè)化加工和生產(chǎn)提供了參考。