孫毅 張翼飛 李娜 王曉巖 祖佳寧 閆景龍*

1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150026 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081

隨著科技的發(fā)展，人類的壽命正在逐漸延長，骨質(zhì)疏松患者的人數(shù)也呈現(xiàn)逐步上升的趨勢。骨質(zhì)疏松是一種以骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身代謝性骨病[1-3]。然而，在不同的藥物治療過程中，經(jīng)?？捎^察到藥物有較大的不良反應(yīng)，這也限制了骨質(zhì)疏松治療藥物在臨床上的應(yīng)用。研究表明，BMSCs的成骨分化能力與某些基因的表達(dá)密切相關(guān)，這些基因的過表達(dá)或缺失均可改變BMSCs的成骨分化能力，進(jìn)而對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)生和治療發(fā)揮一定作用[4-6]。miRNAs 是一類長約 22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子 RNA，通過抑制靶基因 mRNA 的翻譯過程或降解靶基因的 mRNA 分子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控[5,7-10]。本研究旨在探討過表達(dá)或敲減microRNA對(duì)BMSCs向成骨分化過程的影響，進(jìn)而為臨床骨質(zhì)疏松的治療提供全新的藥物作用靶點(diǎn)和治療新策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6健康小鼠，6～8周齡，17～21 g，購買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基(美國 Hyclone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(賽業(yè)生物科技有限公司)，microRNA mimics、AMO、NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，堿性磷酸酶活性染色試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，茜素紅染色試劑盒(美國Sigma公司)；體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本 Nikon公司)，qRT-PCR儀(瑞士 Roche公司)。

1.3 小鼠骨質(zhì)疏松模型(ovariectomized，OVX)的制作及BMSCs 的分離培養(yǎng)

1.3.1小鼠 OVX 模型的制作：采用C57BL/6小鼠，去勢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松小鼠模型[11]。將小鼠隨機(jī)分為Sham組和OVX組。經(jīng)腹腔注射80 mg/kg 1.5%戊巴比妥鈉麻醉，俯臥固定，剃背毛，消毒皮膚，透過菲薄的肌膜分別行雙側(cè)卵巢切除或假手術(shù)。在無菌條件下，于卵巢部的肌膜上做一長約 1 cm 切口，取出卵巢，以絲線結(jié)扎并切除。成功的OVX模型被定義為骨質(zhì)疏松癥小鼠，設(shè)計(jì)相對(duì)的假手術(shù)組(Sham組)，與OVX組形成對(duì)照。

1.3.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法對(duì)BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)[4,12]，培養(yǎng)全程均為無菌操作。首先選取數(shù)只實(shí)驗(yàn)小鼠，分離小鼠腿部的脛骨和股骨，用75%乙醇漂洗數(shù)次，剪開兩端骨骺端。用BMSCs專用培養(yǎng)液反復(fù)從兩頭沖洗骨髓腔，直至骨壁發(fā)白，得到骨髓細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞孵化箱培養(yǎng)(95%空氣、5%CO2，37 ℃)。根據(jù)BMSCs具有貼壁生長的特性分離BMSCs。72 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，從而分離提純BMSCs，3天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)到7 d時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。本研究使用的BMSCs均是經(jīng)過3～5次傳代后的細(xì)胞。

1.3.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化：使用3～5代的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。將已經(jīng)分離的BMSCs以105個(gè)/mL的濃度轉(zhuǎn)移到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37 ℃ 5% CO2的條件培養(yǎng)24 h。細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，加入2 mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。每3天更換一次培養(yǎng)液，通常需要培養(yǎng)14 d，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及在體轉(zhuǎn)染

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，在無菌條件下進(jìn)行。首先取培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入Opti-MEM培養(yǎng)基，饑餓處理2 h。轉(zhuǎn)染開始，利用X-treme包裹，使轉(zhuǎn)染試劑更易進(jìn)入細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染過程中，miR-187-5p mimics的終濃度為50 nmol/L，miR-187-5p AMO的終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染2 h后，棄去轉(zhuǎn)染液體，加入中和培養(yǎng)液。培養(yǎng)1 d后棄去中和培養(yǎng)液，換成干細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2在體轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)事先構(gòu)建出miR-187-5p mimics與mimics NC質(zhì)粒重組體以及質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物。取實(shí)驗(yàn)所用小鼠，將30 μL質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物用900 μL OMEM培養(yǎng)基稀釋，經(jīng)尾靜脈快速注射完全部液體。

1.5 堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase，ALP)及茜素紅染色(alizarin red S，ARS)

1.5.1ALP染色：取出已經(jīng)分化完畢的BMSCs，吸出棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3次。每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定20 min，用PBS緩沖液沖洗，每孔加1 mL孵育液，37 ℃孵育4 h，棄凈孵育液，每孔加入500 μL 2%硝酸鈷，常溫孵育3～5 min。棄凈孵育液，用PBS緩沖液沖洗，每孔加入500 μL 1%硫酸銨溶液，常溫放置2 min。反應(yīng)完畢，棄去溶液，使用PBS緩沖液清洗，并用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照分析。

1.5.2ARS染色：取已經(jīng)分化完畢的BMSCs，吸出培養(yǎng)液棄去，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1～2次，之后每孔加入 500 μL 4%多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞20 min。細(xì)胞固定完畢后，再用PBS緩沖液清洗2～3次，之后每孔加500 μL茜素紅，室溫放置20 min。染色完畢，棄去進(jìn)行分析染色液，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，使用倒置顯微鏡對(duì)已染色細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.6 PCR

1.6.1RNA提取分離：BMSCs細(xì)胞棄去上清液，胰酶消化，離心(250 g，5 min)，棄去上清液。加入1 mL Trizol溶液，將細(xì)胞吹勻，轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，4 ℃放置30 min，使之充分裂解。加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置3 min后放入離心機(jī)中離心(13 500 r/min，15 min，4 ℃)。轉(zhuǎn)移上清液至EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min離心(13 500 r/min，10 min，4 ℃)。棄去上清液，加入1 mL 75%的乙醇，使沉淀懸浮，放入離心機(jī)中離心(10 600 r/min，5 min，4 ℃)。棄去上清液，置通風(fēng)處干燥EP管，加入6～10 μL DEPC，將沉淀溶解混勻，順離，并測定濃度。

1.6.2反轉(zhuǎn)錄：取已經(jīng)測好濃度的cRNA樣品，按下列體系加入20 μL于EP管內(nèi)，并放到反轉(zhuǎn)錄儀中。

1.6.3qRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄完成后的測cDNA樣及PCR試劑盒，按體系加入PCR板中，經(jīng)過變性、退火、延伸、保存。

1.6.4PCR引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均利用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，并采用單因素方差分析檢驗(yàn)差異(One-ANOVA)的顯著性，多組數(shù)據(jù)之間的顯著性采用TURKEY法比較，雙尾概率以P<0.05，P<0.01，P<0.001為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-187-5p 在骨質(zhì)疏松小鼠骨組織及BMSCs中表達(dá)下降

在成功構(gòu)建小鼠骨質(zhì)疏松模型8周后，我們應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測Sham組和OVX組小鼠的骨組織和BMSCs中miR-187-5p mRNA的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與Sham組小鼠骨組織相比，miR-187-5p在OVX組小鼠骨組織中的表達(dá)顯著降低(圖1 A)。同樣地，分別提取了兩組小鼠的BMSCs，并檢測細(xì)胞中miR-187-5p mRNA的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與Sham組小鼠BMSCs相比，miR-187-5p在OVX組小鼠BMSCs中的表達(dá)顯著降低(圖1B)。以上結(jié)果證實(shí)，miR-187-5p在骨質(zhì)疏松小鼠骨組織及BMSCs中表達(dá)下降，表明miR-187-5p參與了在小鼠的骨質(zhì)疏松進(jìn)程。這提示我們，提高組織或者細(xì)胞中miR-187-5p的表達(dá)有可能改善小鼠的骨質(zhì)疏松表型。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2.2 miR-187-5p調(diào)控BMSCs成骨分化

qRT-PCR技術(shù)檢測BMSCs中成骨分化相關(guān)基因ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN等mRNA的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與mimics-NC相比，miR-92b mimics組中成骨分化相關(guān)基因ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN mRNA表達(dá)均顯著升高，證明過表達(dá)miR-187-5p能夠促進(jìn)BMSCs向成骨分化(圖2 A)。與AMO-NC相比，miR-187-5p AMO組中成骨分化相關(guān)基因ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN mRNA表達(dá)均顯著降低，表明敲減miR-187-5p能夠顯著抑制BMSCs向成骨分化(圖2B)。

2.3 過表達(dá)miR-187-5p有效改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松表型

茜素紅染色檢測各組BMSCs向成骨分化能力，如圖3 A所示，Sham組相比于OVX組小鼠的BMSCs向成骨分化能力增強(qiáng)；Sham + miR-187-5pmimics組與Sham + mimics-NC組相比，OVX +miR-187-5p mimics組與OVX + mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-miR-187-5p mimics均可使染色程度較深，表明過表達(dá)miR-187-5p可有效促進(jìn)BMSCs向成骨分化。堿性磷酸酶染色檢測各組BMSCs向成骨分化的能力，如圖3B所示，Sham組小鼠相比于OVX小鼠的BMSCs向成骨分化能力更加顯著；Sham+miR-187-5p mimics組與Sham + mimics-NC組相比，OVX+miR-187-5p mimics組與OVX + mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-187-5p mimics的小鼠BMSCs的染色程度明顯加深，表明過表達(dá)miR-187-5p可有效促進(jìn)BMSCs向成骨分化。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-187-5p不但可以促進(jìn)正常小鼠的BMSCs向成骨分化，對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠的BMSCs向成骨分化也有一定的促進(jìn)作用。

圖1 miR-187-5p在骨質(zhì)疏松小鼠骨組織及BMSCs中表達(dá)下降A(chǔ): qRT-PCR檢測Sham組和OVX組小鼠骨組織中miR-187-5p mRNA的表達(dá)； B: qRT-PCR檢測Sham組和OVX組小鼠BMSCs中miR-187-5p mRNA的表達(dá)。與Sham組比較，*P<0.05。Fig.1 The mRNA expression of miR-187-5p decreased in bone tissues and BMSCs

圖3 過表達(dá)miR-187-5p有效改善OVX小鼠骨質(zhì)疏松表型A: 應(yīng)用茜素紅評(píng)價(jià)過表達(dá)miR-187-5p對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠的BMSCs向成骨分化的影響； B: 應(yīng)用堿性磷酸酶染色評(píng)價(jià)過表達(dá)miR-187-5p對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠的BMSCs向成骨分化的影響。Fig.3 The overexpression of miR-187-5p ameliorated the osteogenic differentiation of BMSCs in OVX mice

3 討論

骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換失衡所致，當(dāng)破骨細(xì)胞活性強(qiáng)于成骨細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致骨密度降低，繼而引發(fā)骨質(zhì)疏松[2,13-14]。BMSCs在體外特定誘導(dǎo)條件下具有分化為多種細(xì)胞的能力。近年來有大量研究表明，在一定的環(huán)境誘導(dǎo)下，可以分化為成骨細(xì)胞，而BMSCs又因其易于提取分離和在體外可大量增殖等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一類有望參與骨質(zhì)疏松臨床治療的種子細(xì)胞[13-18]。有研究證實(shí)，microRNA可以促進(jìn)BMSCs向成骨分化，例如miR-23a/b、miR-22、miR-563等[1-3,9,19-20]，同時(shí)也可以負(fù)向調(diào)控BMSCs成骨分化，例如miR-214、miR-503-5p、miR-138、miR-449c-5p、miR-93-5p等[8,16-18,21]。

在本研究中，首先檢測了假手術(shù)組小鼠和骨質(zhì)疏松模型小鼠的骨組織及BMSCs中miR-187-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松小鼠骨組織和BMSCs中miR-187-5p表達(dá)均顯著下降。提示提高miR-187-5p的表達(dá)也許可以改善骨質(zhì)疏松的癥狀。miR-187-5p是在人類、馬和小鼠等動(dòng)物的組織中廣泛表達(dá)，并且是序列高度保守的一種miRNA分子。miR-187-5p在腫瘤、免疫、感染、代謝等多個(gè)領(lǐng)域均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

我們?cè)隗w內(nèi)檢測了過表達(dá)miR-187-5p對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠BMSCs向成骨分化能力的影響。通過在體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-187-5p mimics分別轉(zhuǎn)染到骨質(zhì)疏松模型小鼠和假手術(shù)組小鼠尾靜脈。染色結(jié)果顯示，無論是假手術(shù)組小鼠還是骨質(zhì)疏松模型組小鼠的BMSCs，其成骨分化的能力均明顯提高，表明過表達(dá)miR-187-5p可有效促進(jìn)BMSCs向成骨分化。本研究雖然在體內(nèi)體外分別驗(yàn)證了小鼠BMSCs的成骨分化能力，但是并沒有確定其成骨分化的靶基因，生物預(yù)測軟件Target Scan顯示miR-187-5p共有4 000多個(gè)靶基因，因此尋找miR-187-5p成骨分化的下游靶基因是本研究接下來要完成的任務(wù)。

綜上所述，本研究成功的證明了過表達(dá)miR-187-5p對(duì)BMSCs向成骨分化具有促進(jìn)作用。通過促進(jìn)BMSCs成骨分化，進(jìn)而提高骨質(zhì)疏松患者骨密度，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的，為治療骨質(zhì)疏松提供了一種新的方案。