楊娟 賈曉康 張楚天 黃云梅 黃美雅 張志恒 孫攀 吳銀生 林燕萍

福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨的細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、骨脆性增加并易于發(fā)生骨折為特點(diǎn)的全身性骨骼疾病[1]。根據(jù)國(guó)際骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)的一項(xiàng)最新研究[2]顯示，我國(guó)骨質(zhì)疏松疾病的總患病率為6.6%～19.3%，平均高達(dá)13%。據(jù)2013年人口普查結(jié)果顯示，超過(guò)60歲的老人約為2.02億，推測(cè)至2050年這一數(shù)字可能上升至4億，其中骨質(zhì)疏松癥或表現(xiàn)出骨密度低下的患者將達(dá)到2.12億[3]。生活中人們常常忽視OP的存在，直到發(fā)生骨折才被察覺(jué)，因此OP也被形象地稱作“無(wú)聲無(wú)息的疾病”。骨質(zhì)疏松癥患者早期無(wú)明顯癥狀，且缺少有效的診治方法，其引起的高骨折率導(dǎo)致了許多患者殘疾和早逝，給中老年人特別是絕經(jīng)后婦女的生活帶來(lái)了嚴(yán)重困擾。研究發(fā)現(xiàn)[4]，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發(fā)生與諸多因素有關(guān)，與女性絕經(jīng)后雌激素的缺乏關(guān)系密切。雌激素的缺乏使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能發(fā)生改變，骨轉(zhuǎn)換速度加快使得骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨密度降低，從而形成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。成骨細(xì)胞對(duì)骨形成、骨代謝和維持成年骨骼系統(tǒng)的正常狀態(tài)都發(fā)揮著重要作用[5]。因此，探討成骨細(xì)胞增殖是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重點(diǎn)方向之一。

Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，可以推動(dòng)細(xì)胞周期由G1/S檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)入S期[6-7]。前期研究表明[8-9]，成骨細(xì)胞中存在Cyclin D1、CDK4等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，成骨細(xì)胞的增殖與Cyclin D1密切相關(guān)。而健骨顆粒能調(diào)控成骨細(xì)胞G1/S期，加快細(xì)胞周期總體進(jìn)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。本研究將以Cyclin D1基因敲減為切入點(diǎn)，觀察基因敲減后各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)情況，探討健骨顆粒促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、山藥、黨參等藥物組成，原藥材購(gòu)自福建省醫(yī)藥公司，由福建中醫(yī)藥研究院中試車間負(fù)責(zé)加工制備，每克健骨顆粒含原生藥2.9 g。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體重(322±20)g，由上?？巳R實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號(hào)：2007000562039。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每籠5只，室溫、通風(fēng)良好、自然光照、自由飲食和活動(dòng)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清(美國(guó)Gbico公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(新西蘭Hyclone公司);CCK8試劑盒、β-action抗體、Cyclin D1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);Cyclin D1、 Cyclin E、CDK4、E2F1 PCR引物(上海生物工程技術(shù)有限公司);YBR Premix Ex TaqTM PCR Kit(日本TaKaRa公司);sgRNA-EGFP/sgRNA-ERFP/sgRNA-puro慢病毒顆粒、Cas9-puro慢病毒顆粒、普適型陰性對(duì)照 sgRNA-EGFP慢病毒顆粒(上海吉?jiǎng)P基因公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含藥血清的制備：將3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為健骨顆粒組、生理鹽水組，每組10只，分別以健骨顆粒2 g (kg·d)、生理鹽水2 mL灌胃7 d，于最后一次灌胃1 h后取腹主動(dòng)脈血制備成含藥血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將成骨樣細(xì)胞株UMR-106在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液一次，3 d傳代一次。

1.2.3CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲減成骨樣細(xì)胞Cyclin D1基因

1.2.3.1感染Cas9慢病毒，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株：取狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的成骨樣細(xì)胞UMR-106，通過(guò)胰酶消化法分離收集，根據(jù)公式(病毒量=MOI×細(xì)胞數(shù)量/病毒滴度)得出Cas9慢病毒體積，將病毒LV-LV-Cas9-Puro(7768-1)加入六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選以得到穩(wěn)定表達(dá)Cas9的混合克隆細(xì)胞株。

1.2.3.2感染sgRNA慢病毒，敲減Cyclin D1基因：通過(guò)胰酶消化法分離收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Cas9混合克隆細(xì)胞株，配置成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分為陰性對(duì)照組和基因敲減組。根據(jù)公式算出sgRNA慢病毒和普適型陰性對(duì)照sgRNA-EGFP 慢病毒顆粒體積(sgRNA基因序列：CTCGCAGCACCCGGTCGTTG)后將病毒加入六孔板孔中。觀察細(xì)胞并于培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，在感染120 h后收集細(xì)胞檢測(cè)或進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3Surveyor法(錯(cuò)配酶法)活性檢驗(yàn)：感染慢病毒5～7 d后，收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞混合克隆基因組，以sgRNA感染的細(xì)胞群DNA為陰性對(duì)照，以感染靶位點(diǎn)sgRNA的細(xì)胞群為實(shí)驗(yàn)組；靶序列PCR擴(kuò)增后經(jīng)過(guò)變性，退火，形成錯(cuò)配，從而被錯(cuò)配酶識(shí)別并剪切。產(chǎn)物跑電泳，比較切割條帶和未切割條帶的比例，反映出Cas9/sgRNA的活性。

1.2.3.4Western-bolt驗(yàn)證基因敲減細(xì)胞：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨樣細(xì)胞，用生理鹽水含藥血清分別干預(yù)正常成骨樣細(xì)胞、病毒載體陰性對(duì)照組、基因減除+成骨樣細(xì)胞48 h，運(yùn)用Western-bolt驗(yàn)證基因敲減細(xì)胞中Cyclin D1是否存在。

1.2.3.5成骨樣細(xì)胞增殖曲線分析：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨樣細(xì)胞、基因敲減+成骨樣細(xì)胞、陰性對(duì)照組細(xì)胞，接種于96孔板中，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8 d后每組每次取8個(gè)孔，加入CCK8溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4檢測(cè)不同濃度健骨顆粒含藥血清對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖的影響：每組設(shè)6個(gè)血清濃度，用CCK8法檢測(cè)并得出促細(xì)胞增殖的最佳含藥血清濃度。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E、CDK 2、CDK 4、Rb及E2F-1 mRNA的表達(dá)：用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，當(dāng)OD 260/OD 280值在1.8～2.0時(shí)，說(shuō)明提取的RNA純度較好。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 Cyclin D1、Cyclin E、CDK 2、CDK 4、Rb及E2F-1擴(kuò)增引物，根據(jù)兩步法標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)時(shí)熒光定量SYBR GREEN PCR法檢測(cè)擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，用參照基因GAPDH對(duì)所有樣品進(jìn)行校正，通過(guò)7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀軟件分析，得到RT-PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線，并比較組間mRNA的相對(duì)含量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 成骨樣細(xì)胞Cyclin D1基因敲減的鑒定

2.1.1觀察細(xì)胞感染效率：感染sgRNA慢病毒72 h后， 成骨樣細(xì)胞GFP熒光表達(dá)率達(dá)80%以上(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡同視野下觀察GFP表達(dá)情況(A、B均為感染sgRNA慢病毒的Cas9混合克隆細(xì)胞)Fig.1 Expression of GFP under the observation of fluorescence microscope in the same field (×100) (A, B are all Cas9 mixed cloned cells infected with sgRNA slow virus)

圖4 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4 Cell growth curves of each group

2.1.2Surveyor法(錯(cuò)配酶法)檢測(cè)sgRNA活性：由圖2可見，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期位置出現(xiàn)了切割條帶，說(shuō)明sgRNA具有活性,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Surveyor法(錯(cuò)配酶法)檢測(cè)sgRNA活性(-：對(duì)照sgRNA感染的細(xì)胞群DNA；+：感染靶位點(diǎn)sgRNA的細(xì)胞群DNA；M：Marker)Fig.2 Test of sgRNA activity by the Surveyor method (-: control of sgRNA infected cell group DNA; +: cell group DNA infected with Target point sgRNA; M: Marker)

2.1.3Western-bolt驗(yàn)證基因敲減細(xì)胞：結(jié)果顯示，正常細(xì)胞和病毒載體陰性對(duì)照組Cyclin D1表達(dá)明顯，而基因敲減細(xì)胞表達(dá)為明顯下降(圖3)。

圖3 Western-bolt 驗(yàn)證基因敲減細(xì)胞(1：正常細(xì)胞組;2：病毒載體陰性對(duì)照組;3：基因敲減組)Fig.3 Western-bolt verifies gene knock-down cells (1: normal cells; 2: virus empty vector cell group; 3: gene knock-down group)

2.2 成骨樣細(xì)胞增殖曲線分析

通過(guò)CCK8法檢測(cè)成骨樣細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，正常細(xì)胞和病毒載體陰性對(duì)照組細(xì)胞在24 h時(shí)增殖較慢，24 h后開始加速進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期；分別于第3天和第4天達(dá)到頂峰后開始緩慢生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，第7天、第8天開始出現(xiàn)增殖抑制。而基因敲減細(xì)胞組較前兩組生長(zhǎng)緩慢，無(wú)明顯增殖高峰，培養(yǎng)8 d后出現(xiàn)增殖抑制。見圖4。

2.3 不同濃度健骨顆粒含藥血清對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖的影響

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示：含藥血清干預(yù)48 h后，與正常細(xì)胞生理鹽水組相比，正常細(xì)胞健骨顆粒組增殖速度變快，病毒載體陰性對(duì)照組增殖速度無(wú)明顯差異，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組增殖速度減慢；與正常細(xì)胞健骨顆粒組相比，基因敲減+健骨顆粒組增殖速度減慢；與基因敲減+生理鹽水組相比，基因敲減+健骨顆粒組增殖速度無(wú)顯著差異。當(dāng)濃度達(dá)到10%時(shí)，細(xì)胞增殖速度明顯加快，隨著血清濃度繼續(xù)增高，增殖速度變慢。見圖5。

圖5 不同濃度健骨顆粒含藥血清對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖的影響(與正常細(xì)胞生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.01;與正常細(xì)胞健骨顆粒組比較，#P<0.05，##P<0.01)Fig.5 Effects of serum containing different concentrations of Jiangu granule on osteoblast proliferation (vs normal cells + saline group, *P<0.05，**P<0.01; vs normal cells + Jiangu granule group, #P<0.05，##P<0.01)

2.4 各組成骨樣細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、Rb及E2F-1 mRNA表達(dá)水平的熒光定量RT-PCR分析結(jié)果

熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，含藥血清干預(yù)24、48、72 h的細(xì)胞組Cyclin D1、CDK2、Rb及E2F-1的mRNA呈逐漸增高趨勢(shì)，隨時(shí)間同步增長(zhǎng)，而各細(xì)胞組CDK4、Cyclin E的mRNA表達(dá)在48 h時(shí)為最高，48 h后開始下降；組間比較顯示，各組細(xì)胞含藥血清干預(yù)24、48、72 h后，與正常細(xì)胞+生理鹽水組相比，正常細(xì)胞+健骨顆粒組Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1 mRNA表達(dá)明顯增高，病毒載體陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組Cyclin D1、CDK2、Rb及E2F-1 mRNA表達(dá)明顯降低；與正常細(xì)胞生理鹽水組相比，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組干預(yù)48 h的CDK4 mRNA表達(dá)和干預(yù)24 h的Cyclin E mRNA表達(dá)明顯降低，其他時(shí)間段無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與正常細(xì)胞健骨顆粒組相比，基因敲減+健骨顆粒組mRNA表達(dá)顯著降低；與基因敲減+生理鹽水組相比，基因敲減+健骨顆粒組mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖6 熒光定量RT-PCR分析結(jié)果(與正常細(xì)胞生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.01;與正常細(xì)胞健骨顆粒組比較，#P<0.05，##P<0.01)Fig.6 Fluorescence quantitative RT-PCR analysis results (vs normal cells + saline group, *P<0.05，**P<0.01; vs normal cells + Jiangu granule group, #P<0.05，##P<0.01)

3 討論

Cyclin D1在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[10]。在G1期初期，有絲分裂信號(hào)刺激Cyclin D蛋白合成，轉(zhuǎn)運(yùn)CDK4、CDK6進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而完成下游蛋白的調(diào)控，使細(xì)胞周期進(jìn)入S期。研究表明[11-13]，在G1期和G1/S期監(jiān)測(cè)點(diǎn)存在Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1等調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)調(diào)控這些蛋白，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響細(xì)胞增殖周期。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞UMR-106，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲減Cyclin D1基因，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示，熒光率達(dá)到80%以上，Surveyor法(錯(cuò)配酶法)活性檢驗(yàn)證明sgRNA具有活性，Western Blot法檢測(cè)Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯下降，因此可確認(rèn)Cyclin D1基因被成功敲減，可進(jìn)行后續(xù)研究。

CCK8法和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，成骨樣細(xì)胞Cyclin D1基因敲減后，增值速度明顯慢于正常成骨樣細(xì)胞和病毒載體陰性對(duì)照組細(xì)胞；而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK 2、CDK 4、Cyclin E、Rb及E2F-1的mRNA表達(dá)水平明顯低于正常成骨樣細(xì)胞，增殖速度減緩。通過(guò)結(jié)果可以推斷，成骨樣細(xì)胞Cyclin D1基因敲減降低G1期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1表達(dá)，其下游蛋白CDK 4、Cyclin E及E2F-1隨之下降，從而減緩成骨樣細(xì)胞增殖周期；證實(shí)Cyclin D1以及下游信號(hào)蛋白的調(diào)控是成骨細(xì)胞增殖周期的重要環(huán)節(jié)，Cyclin D1 是成骨樣細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵點(diǎn)；通過(guò)上調(diào)Cyclin D1以及下游信號(hào)蛋白表達(dá)，可以加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虧脾虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病基礎(chǔ)[14]，腎虛為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本，而脾虛是骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生的重要病機(jī)，以補(bǔ)腎健脾、強(qiáng)筋壯骨為治療之法，可有效防止人體骨量的丟失[15]。根據(jù)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理，近年來(lái)運(yùn)用補(bǔ)腎方藥探討骨質(zhì)疏松癥分子生物學(xué)機(jī)制成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[16-17]。在臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、提高骨密度[18]。林燕萍等[9]針對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥“腎虧脾虛”的病機(jī)特點(diǎn)，以“補(bǔ)先后天”的理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等組成補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒。前期研究結(jié)果表明[19]，補(bǔ)腎中藥健骨顆?？梢蕴岣吖墙M織中成骨細(xì)胞的數(shù)量及功能，加速骨合成代謝，從而使骨形成大于骨吸收。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)健骨顆粒能上調(diào)成骨細(xì)胞Cyclin D1和CDK4的mRNA以及蛋白的表達(dá)，下調(diào)負(fù)性因子p21表達(dá)，促使成骨細(xì)胞細(xì)胞周期加速由G1/S檢查點(diǎn)進(jìn)入S期，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。因此，本課題采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲減成骨樣細(xì)胞Cyclin D1基因，進(jìn)一步探討健骨顆粒是否能夠通過(guò)Cyclin D1及其下游蛋白組成的信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。研究結(jié)果顯示，正常細(xì)胞健骨顆粒組的Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的mRNA表達(dá)高于正常細(xì)胞生理鹽水組；而Cyclin D1基因敲減后，正常細(xì)胞健骨顆粒組mRNA的表達(dá)水平明顯高于基因敲減+健骨顆粒組，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組的mRNA沒(méi)有明顯差異。表明健骨顆?？梢蕴岣唧w外培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的表達(dá)，推進(jìn)成骨樣細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖。且Cyclin D1在成骨樣細(xì)胞增殖過(guò)程對(duì)下游信號(hào)蛋白也有著重要調(diào)節(jié)作用，Cyclin D1基因的敲減直接影響著CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的表達(dá)，進(jìn)而影響成骨樣細(xì)胞增殖，這也驗(yàn)證了健骨顆粒含藥血清可以通過(guò)調(diào)節(jié)Cyclin D1，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果表明，健骨顆粒能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Cyclin D1及其下游信號(hào)推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的。證明了補(bǔ)腎健脾中藥“補(bǔ)先后天”理論的科學(xué)性，為健骨顆粒的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。