李本相 衛(wèi)育良 梁萌青 徐后國 曲江波

水解魚蛋白對大菱鲆生長、體組成及肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響*

李本相1,2衛(wèi)育良2梁萌青2①徐后國2曲江波3

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司 煙臺 264006)

本實驗設(shè)計6種等氮等脂的飼料，研究水解魚蛋白對大菱鲆(L.)生長、飼料利用、體組成和肌肉纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。實驗設(shè)2個對照組，正對照組魚粉為44%，負對照組魚粉為22%；設(shè)4個實驗組，PH18A組為22%的魚粉和18%的水解魚蛋白，PH4.5A組為22%的魚粉和4.5%的水解魚蛋白，PH4.5B組為17%的魚粉和4.5%的水解魚蛋白，PH18B組為0.5%的魚粉和18%的水解魚蛋白。研究結(jié)果表明，PH4.5A組和PH18B組的特定增長率無顯著差異(>0.05)，但顯著高于PH4.5B組和負對照組(<0.05)，顯著低于正對照組和PH18A組(<0.05)；PH18A組的特定生長率顯著高于正對照組(<0.05)。正對照組和PH18A組的飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率無顯著差異(>0.05)，但依次顯著高于PH18B組、PH4.5A組和負對照組(<0.05)；攝食率的變化趨勢則相反。PH4.5B組和負對照組的粗脂肪和粗蛋白含量無顯著差異(>0.05)，顯著低于正對照組和PH18A組(<0.05)。6個處理組的大菱鲆肌肉總氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸均無顯著差異(>0.05)。PH18A組的肌纖維橫截面積顯著高于PH18B組、正對照組、PH4.5A組、負對照組和PH4.5B組(<0.05)，而PH18B組顯著高于PH4.5B組(<0.05)。PH18A組和PH18B組的肌纖維密度顯著低于PH4.5B組(<0.05)。研究表明，在高植物蛋白飼料中4.5%和18%的水解魚蛋白，均可以提高大菱鲆的飼料效率和蛋白沉積率，促進大菱鲆的生長，且18%的水解魚蛋白好于4.5%；同時，18%的水解魚蛋白促進大菱鲆肌肉纖維橫截面積的增加，促進大菱鲆的肌肉纖維密度的降低，而4.5%的水解魚蛋白對大菱鲆肌纖維的橫截面積和肌纖維的密度均無顯著的作用。

大菱鲆；水解魚蛋白；生長性能；肌肉纖維

水解魚蛋白(Fish protein hydrolysate, FPH)是將水產(chǎn)品加工下腳料在一定條件下水解后獲得的一種含游離氨基酸和不同肽鏈長度多肽的蛋白質(zhì)寡肽(Liaset, 2008; 王新星等, 2011)。目前，國內(nèi)外關(guān)于水解魚蛋白對肉食性魚類生長性能的影響開展了大量研究，相關(guān)的研究表明，將水解魚蛋白以適當(dāng)?shù)谋壤砑又粮咧参锏鞍罪暳现?，能顯著提高大部分肉食性魚類的生長和飼料利用(Espe,1999; Zheng,2012; 衛(wèi)育良等, 2014)；但對于其如何影響肌纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)卻缺乏研究。多細胞動物的基本結(jié)構(gòu)包括上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織和神經(jīng)組織4種，其中，具有收縮能力的肌肉組織是動物生存和運動的基本保障，也是水產(chǎn)品主要的可食部分，而肌纖維是肌肉的基本構(gòu)成單位，肌纖維橫截面積和肌纖維密度是描述肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的2個主要特征。有研究報道，在一定范圍內(nèi)，隨著飼料中水解魚蛋白的增加，羅非魚的肌纖維橫截面積出現(xiàn)顯著增加的趨勢(Silva, 2017)，這表明，水解魚蛋白對魚類的肌纖維可能具有重要的調(diào)控作用。因此，有必要進一步開展水解魚蛋白對肉食性魚類肌肉纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)影響的研究。

作為我國北方工廠化養(yǎng)殖重要的肉食性海水魚類，本團隊先后開展了水解魚蛋白對大菱鲆(L.)生長性能、蛋白質(zhì)代謝、脂肪沉積、非特異性免疫等方面的研究工作(衛(wèi)育良等, 2014; 牟玉超等, 2016; Wei, 2016; Xu, 2016; Zheng, 2013a)，然而，水解魚蛋白如何影響大菱鲆肌肉纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然缺乏研究。因此，本實驗以大菱鲆為研究對象，通過在飼料中添加不同水平的水解魚蛋白，研究水解魚蛋白對大菱鲆生長、體組成和肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為水解魚蛋白在大菱鲆配合飼料的應(yīng)用進一步提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水解魚蛋白的制備

水解魚蛋白的制備以太平洋狹鱈魚()為原料，參照Zheng等(2012)的方法進行制備。水解魚蛋白的化學(xué)組成及氨基酸組成見表1。

1.2 實驗飼料

本實驗飼料配方以魚粉、水解魚蛋白為主要動物蛋白源，以花生粕、大豆?jié)饪s蛋白、谷朊粉和玉米蛋白為主要植物蛋白源，以魚油和豆油為主要脂肪源；實驗設(shè)2個對照組，正對照組魚粉為44%，負對照組魚粉為22%，設(shè)4個實驗組，PH18A組為22%的魚粉和18%的水解魚蛋白，PH4.5A組為22%的魚粉和4.5%的水解魚蛋白，PH4.5B組為17%的魚粉和4.5%的水解魚蛋白，PH18B組為0.5%的魚粉和18%的水解魚蛋白。實驗飼料配方及營養(yǎng)組成見表2，實驗飼料的氨基酸組成見表3。

表1 水解魚蛋白的化學(xué)組成和氨基酸組成(%干物質(zhì))

Tab.1 The proximate chemical composition and amino acid composition of fish protein hydrolysate (% Dry matter)

首先，將所有飼料原料粉碎后過80目篩網(wǎng)，然后，根據(jù)實驗配方將原料混合均勻后制作成等氮等脂的顆粒飼料，在烘箱內(nèi)50℃烘干，存放在–20℃冷庫備用。

1.3 實驗魚及養(yǎng)殖管理

本實驗以初始體重為(11.98±0.03) g的大菱鲆為飼養(yǎng)對象，于2017年8~10月在山東煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司進行為期56 d的養(yǎng)殖實驗。實驗開始前，進行為期14 d的暫養(yǎng)實驗，使魚體適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，然后，對大菱鲆幼魚饑餓24 h，選取健康有活力的大菱鲆幼魚隨機分配到18個桶中(6個處理，3個重復(fù))，每桶25尾魚。養(yǎng)殖期間，每天早(07:30)晚(16:30)進行人工飽食投喂。

表2 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成(%干物質(zhì))

Tab.2 Formulation and proximate chemical composition of experimental diets (% Dry matter)

注：1: 礦物質(zhì)混合物(mg/kg飼料)：氟化鈉，2 mg；碘化鉀，0.8 mg；氯化鈷，50 mg；硫酸銅，10 mg；硫酸鐵，80 mg；硫酸鋅，50 mg；硫酸鎂，1200 mg；磷酸二氫鈣，3000 mg；氯化鈉，100 mg；沸石粉，5.51 g；2: 維生素混合物(mg/kg飼料)：硫胺素，25 mg；核黃素，45 mg；鹽酸吡哆醇，20 mg；維生素B12，0.1 mg；維生素K3，10 mg；肌醇，800 mg；泛酸，60 mg；煙酸，200 mg；葉酸，20 mg；生物素，1.20 mg；維生素A，32 mg；維生素D，5 mg；維生素E，120 mg；次粉3.67 g

Note: 1: Mineral premix (mg/kg) diet: NaF 2 mg; KI 0.8 mg; CoCl2·6H2O 50 mg; CuSO4·5H2O 10 mg; FeSO4·7H2O 80 g; ZnSO4·7H2O 50 mg; MnSO4·4H2O 1200 mg; Ca(H2PO4)2·2H2O 3000 g; NaCl 100 g; Mordenzeo 5.51 g; 2: Vitamin premix (mg/kg): thiamine 25 mg; riboflavin 45 mg; pyridoxine 20 mg; vitamin B120.1 mg; menadione 10 mg; inositol 800 mg; pantothenate 60 mg; tocopherol acetate 200 mg; folic acid 20 mg; biotin 1.20 mg; vitamin A 32 mg; vitamin D 5 mg; vitamin E 120 mg; wheat flour 3.67 g

實驗養(yǎng)殖條件如下：用體積為150 L的圓柱形養(yǎng)殖桶；采用深井海水，流速為5 L/min，連續(xù)充氣，溶氧高于7 mg/L，流水養(yǎng)殖模式；采用自然光照，水溫為13℃~16℃；鹽度為32，pH為7.5~8.0。

1.4 樣品采集及生化指標(biāo)測定

1.4.1 樣品采集 實驗開始時，隨機取20尾健康有活力的大菱鲆，保存于–20℃，用于后續(xù)魚體成分分析。實驗結(jié)束時，禁食24 h，稱取每桶魚的總重量，記錄每桶魚的尾數(shù)，用于計算相關(guān)生長指標(biāo)。然后，每桶取3尾大菱鲆，取背部相同位置的肌肉，分成 2份，1份放入Davison固定液中固定保存，用于肌肉組織切片的分析，1份放入液氮中速凍，于–80℃下保存，用于肌肉氨基酸的測定。最后，每桶取5尾全魚，于–20℃冰箱保存，用于魚體成分分析。

1.4.2 常規(guī)及生化指標(biāo)測定 飼料和全魚樣品在105℃烘干至恒重，采用凱氏定氮法(VELP，UDK142 automatic distillation unit，意大利)測定粗蛋白質(zhì)含量；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量(FOSS脂肪測定儀SOXTEC 2050，瑞典)，采用失重法測定灰分含量，樣品在馬福爐中灼燒16 h (550℃)。測定飼料、肌肉及水解魚蛋白中氨基酸及牛磺酸組成的前處理。首先進行冷凍干燥，然后在110℃下用6 mol/L的HCl水解22~24 h；測定飼料中游離氨基酸的前處理，采用8 %的三氯乙酸溶解，渦旋3 min，超聲波15 min，12000 r/min離心15 min，前處理完成后，所有氨基酸及?；撬峋捎萌樟-8900型氨基酸分析儀(Hitachi L-8900 automatic amino acid analyzer, Hitachi, 日本)測得。

表3 實驗飼料的氨基酸組成(%干物質(zhì))

Tab.3 The amino acid composition of experimental diets (% Dry matter)

注：AA：氨基酸；TAA：總氨基酸；FAA：游離氨基酸；EAA：必需氨基酸；NEAA：非必需氨基酸。下同

Note: AA: Amino acid; TAA: Total amino acid; FAA: Free amino acid; EAA: Essential amino acid; NEAA: Non-essential amino acid. The same as below

1.5 樣本切片制備及測量方法

1.5.1 石蠟切片的制備 肌肉樣本按常規(guī)H.E染色，石蠟包埋后用石蠟切片機切片，注意包埋時肌纖維長軸與蠟塊切片垂直，制成橫切片(厚度為6 μm)。

1.5.2 肌纖維橫截面積和密度的測定 本實驗主要針對肌纖維橫截面積和密度進行統(tǒng)計分析。于10×20倍鏡下拍照，測其肌纖維橫截面積，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)選取6條肌纖維，用Photoshop軟件根據(jù)標(biāo)尺測定肌纖維長徑(沿各個方向測定的肌纖維橫截面輪廓兩邊界間平行線之間距離的最大值)和短徑(沿各個方向測定的肌纖維橫截面輪廓兩邊界間平行線之間距離的最小值)，并根據(jù)橢圓面積計算公式(面積=0.25×π×長徑×短徑)計算肌肉纖維橫截面積。其次，將切片于10×4倍鏡下隨機選取視野，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)選取6個視野，拍照后用Photoshop軟件根據(jù)標(biāo)尺計算0.088 mm2內(nèi)肌肉纖維個數(shù)，并換算成1 mm2內(nèi)肌肉纖維的個數(shù)，得到肌肉纖維密度。

1.6 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計方法

成活率(Survival rate, SR,%)=100×實驗結(jié)束每桶魚尾數(shù)/實驗開始每桶魚尾數(shù)

特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d)= 100×[ln(終末體重)–ln(初始體重)]/實驗天數(shù)

攝食率(Feed intake, FI, %/d)=100×每尾魚攝食的飼料干物質(zhì)重/[(實驗結(jié)束時魚體重+實驗開始時魚體重)/2×養(yǎng)殖實驗天數(shù)]

飼料效率(Feed efficiency, FE)=(終末體重–初始體重)/每尾魚攝食的飼料干物質(zhì)重

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(終末體重–初始體重)/初始體重

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio, PER)=(終末體重–初始體重)/蛋白攝入量

蛋白沉積率(Protein productive value, PPV, %)= 100×[(實驗終魚體蛋白含量–實驗初魚體蛋白含量)/蛋白攝入量]

所有實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，差異顯著(<0.05)后，進行Tukey多重比較(Tukey’s multiple comparison tests)。

2 實驗結(jié)果

2.1 水解魚蛋白對大菱鲆生長性能及飼料利用的影響

不同飼料處理對大菱鲆生長及飼料利用的影響見表4。6個處理組的存活率均無顯著差異(>0.05)。與正對照組相比，除PH18A組的特定生長率顯著高于正對照組外(<0.05)，PH4.5A組、PH4.5B組和PH18B組顯著低于正對照組(<0.05)，飼料效率、蛋白質(zhì)沉積率和蛋白質(zhì)效率變化趨勢與特定生長率相似；攝食率除PH18A組和PH18B組與正對照組無顯著差異外(>0.05)，PH4.5A組和PH4.5B組的攝食率顯著高于正對照組(<0.05)。與負對照組相比，PH4.5A組、PH4.5B組、PH18A組和PH18B組的特定生長率顯著高于負對照組(<0.05)；飼料效率、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率的變化趨勢與特定生長率相似；攝食率在PH4.5B組顯著高于負對照組(<0.05)，PH4.5A組的攝食率與負對照組無顯著差異(>0.05)，PH18A組和PH18B組的攝食率均顯著低于負對照組(<0.05)。

表4 水解魚蛋白對大菱鲆生長和飼料利用的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Tab.4 The effects of fish protein hydrolysate on the growth and feed utilization of turbot (Mean±SE)

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母表示存在顯著差異(<0.05)。下同

Note: Values in the same row with different superscripts were significantly different (<0.05). The same as below

2.2 水解魚蛋白對魚體體組成及肌肉氨基酸組成的影響

不同飼料處理對大菱鲆體組成的影響見表5。與正對照組相比，除PH4.5B組的粗蛋白含量顯著低于正對照組外(<0.05)，PH4.5A組、PH18A組和PH18B組的粗蛋白與正對照組無顯著差異(>0.05)，粗脂肪變化趨勢與粗蛋白相同；除PH18A組和PH18B組的水分含量與正對照組無顯著差異外(>0.05)，PH4.5B組和PH4.5A組的水分含量顯著高于正對照組(<0.05)，灰分含量變化趨勢與水分相似。與負對照組相比，除PH4.5B組和負對照組的粗蛋白差異不顯著外(>0.05)，PH4.5A組、PH18A組和PH18B組的粗蛋白顯著高于負對照組(<0.05)；除PH18A組的粗脂肪顯著高于負對照組外(<0.05)，PH4.5A組、PH4.5B組和PH18B組的粗脂肪含量與負對照組無顯著差異(>0.05)；除PH4.5A組、PH4.5B組的水分和負對照組無顯著外(>0.05)，PH18A組和PH18B組的水分含量顯著低于負對照組(<0.05)，灰分含量變化趨勢與水分相似。

水解魚蛋白對大菱鲆肌肉氨基酸組成的影響見表6。6個處理組之間總氨基酸含量無顯著差異(> 0.05)；必需氨基酸總量也無顯著差異(>0.05)，但精氨酸在PH4.5A組的含量顯著高于PH18A組、PH18B組、正對照組和負對照組(<0.05)。非必需氨基酸總量也無顯著差異(>0.05)，但?；撬嵩赑H18B組的含量顯著低于PH4.5B組和負對照組(<0.05)，丙氨酸在PH4.5A組的含量顯著低于PH4.5B組、PH18A組、PH18B組、正對照組和負對照組(<0.05)，半胱氨酸在PH4.5A組、PH4.5B組、PH18A組、正對照組和負對照組的含量均存在顯著差異(<0.05)，由高到低依次為正對照組、PH4.5A組、PH18A組、負對照組和PH4.5B組。

表5 水解魚蛋白對大菱鲆體成分的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Tab.5 The effects of fish protein hydrolysate on body composition of turbot (Mean±SE)

表6 水解魚蛋白對大菱鲆肌肉氨基酸組成的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤) (‰干物質(zhì))

Tab.6 The effects of fish protein hydrolysate on amino acid composition of turbot muscle (Mean±SE) (‰ Dry matter)

2.3 水解魚蛋白對大菱鲆肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

水解魚蛋白對大菱鲆肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見表7。不同處理組10×4倍及10×20倍光學(xué)顯微鏡下大菱鲆肌纖維橫截面切片視野見圖1。對于大菱鲆肌肉纖維長徑和短徑，PH18A組的肌纖維長徑顯著高于PH4.5B組(<0.05)，6個處理組的肌纖維短徑無顯著差異(>0.05)。對于大菱鲆肌肉纖維的橫截面積，PH18A組顯著高于PH18B組、正對照組、PH4.5A組、負對照組和PH4.5B組(<0.05)，而PH18B組顯著高于PH4.5B組(<0.05)，與正對照組、PH4.5A組、負對照組無顯著差異(>0.05)。對于大菱鲆肌肉纖維密度，PH4.5B組顯著高于PH18A組和PH18B組(<0.05)，但與正對照組、負對照組和PH4.5A組無顯著差異(>0.05)。

表7 水解魚蛋白對大菱鲆肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Tab.7 The effects of fish protein hydrolysate on morphological structure of muscle fiber of turbot(Mean±SE)

圖1 光學(xué)顯微鏡下大菱鲆肌纖維橫截面示例圖

A：正對照組(10×4)；B：PH4.5A組(10×4)；C：PH4.5B組(10×4)；D：PH18A組(10×4)；E：PH18B組(10×4)；F：負對照組(10×4)a：正對照組(10×20)；b：PH4.5A組(10×20)；c：PH4.5B組(10×20)；d：PH18A組(10×20)；e：PH18B組(10×20)；f：負對照組(10×20)

A: Positive control group(10×4); B: PH4.5A group(10×4); C: PH4.5B group(10×4); D: PH18A group(10×4); E: PH18B group(10×4); F: Negative control group(10×4)a: Positive control group(10×20); b: PH4.5A group(10×20); c: PH4.5B group(10×20); d: PH18A group(10×20); e: PH18B group(10×20); f: Negative control group(10×20)

3 討論

3.1 水解魚蛋白對大菱鲆生長性能及飼料利用的影響

在之前水解魚蛋白影響大菱鲆生長性能的研究上發(fā)現(xiàn)，低水平水解魚蛋白替代魚粉，有利于大菱鲆生長，而高水平替代則顯著抑制大菱鲆生長(Wei, 2016; Xu, 2016)。但是，在隨后本團隊尚未發(fā)表的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料魚粉水平相同的情況下，添加18%的水解魚蛋白，與不添加和4.5%的水解魚蛋白添加組相比，生長和飼料利用顯著提高。然而，該研究是在飼料中魚粉水平相同情況下進行的，增加飼料中水解魚蛋白的水平相比對照組，相當(dāng)于用水解魚蛋白替代了飼料中的混合植物蛋白，因而，生長和飼料利用的提高可以認為主要是大菱鲆對水解魚蛋白的利用優(yōu)于混合植物蛋白，而不一定是高水平水解魚蛋白促進了大菱鲆的生長。因此，為進一步研究水解魚蛋白對大菱鲆生長的作用規(guī)律，本實驗設(shè)計了魚粉相同條件下，設(shè)計4.5%和18%的水解魚蛋白添加入飼料中及4.5%和18%水解魚蛋白替代相同蛋白的魚粉 2種情況開展研究。結(jié)果顯示，在魚粉含量相同(22%魚粉)的條件下，將添加4.5%的水解魚蛋白的PH4.5A組、18%水解魚蛋白的PH18A組和未添加水解魚蛋白的負對照組大菱鲆的生長及飼料利用進行對比， 3組的生長和飼料利用依次為PH18A組>PH4.5A組>負對照組且均產(chǎn)生顯著差異，這與本團隊尚未發(fā)表的在相同魚粉條件下，添加水解魚蛋白對大菱鲆生長的研究結(jié)果相似。在水解魚蛋白替代等蛋白的魚粉時，即在魚粉為22%的負對照組中，用4.5%和18%的水解魚蛋白分別替代5%和21.5%的等蛋白魚粉PH4.5B組和PH18B組，將這2組的生長結(jié)果及飼料利用與負對照組進行對比，結(jié)果顯示，PH4.5B組和PH18B組的生長和飼料利用相比負對照組均顯著提高。同樣，在魚粉為44%的正對照組中，用水解魚蛋白替代22%的魚粉PH18A組，也有相似的結(jié)果，這進一步表明18%和4.5%的水解魚蛋白對大菱鲆的生長、飼料利用可能均具有顯著促進作用。此外，本實驗中水解魚蛋白的添加量18%雖然已經(jīng)超過之前認為的12%高水平水解魚蛋白組的抑制大菱鲆生長的添加量，但是卻沒有發(fā)現(xiàn)對大菱鲆生長和飼料利用有明顯的抑制作用。這一結(jié)果不但與之前在大菱鲆上的研究結(jié)果相反(Wei, 2016; Xu, 2016)，而且也與在牙鲆() (Zheng, 2012; Zheng, 2013b; 許團輝等, 2012)、大西洋鱈魚()(Aksnes, 2006a; Bakke, 2010)、虹鱒() (Aksnes, 2006b)、大西洋鮭() (Espe, 2012; Hevr?y, 2005; Refstie,2004; Kousoulaki, 2009)、軍曹魚() (Mach, 2011)等肉食性魚類上的研究結(jié)果相反。高水平水解魚蛋白之所以會顯著抑制魚類的生長，其主要原因是水解魚蛋白中含有大量的游離氨基酸，這些游離氨基酸在腸道的吸收利用上與完整蛋白不同步，這樣導(dǎo)致大量的氨基酸被用于分解提供能量，而不是用于蛋白質(zhì)合成，從而降低了肉食性魚類對含高水平水解魚蛋白飼料中蛋白質(zhì)的吸收和利用(Espe, 1999; Hevr?y, 2005)。但是，對于大菱鲆，Peres等(2005)報道，飼料中添加13.8%的晶體氨基酸，相比無添加的魚粉組，大菱鲆的生長和飼料利用均無顯著差異，這表明大菱鲆可以耐受較高的晶體氨基酸。而Wei等(2016)在對比添加晶體氨基酸和高水平水解魚蛋白的生長結(jié)果后猜測，高水平水解魚蛋白抑制大菱鲆生長的原因，可能并不主要是因為水解魚蛋白中含有高比例的游離氨基酸。因此，由于本實驗所用水解魚蛋白的制作方法與之前的完全一致(Xu, 2016)，而本實驗出現(xiàn)18%的水解魚蛋白仍促進魚類的生長，一方面可能是大菱鲆本身對水解魚蛋白中的晶體氨基酸具有較強的適應(yīng)能力；另一方面，2次實驗所用的大菱鲆可能因為來源不同，存在品種的差異，而18%的水解魚蛋白可能仍然是本實驗所用大菱鲆的適宜含量，而不會產(chǎn)生抑制作用。因此，接下來需要再次通過更高水平的水解魚蛋白驗證這一假設(shè)。

3.2 水解魚蛋白對大菱鲆體組成及肌肉氨基酸組成的影響

魚類在食物不充足的條件下，為維持生命活動，不同程度消耗脂肪、糖原和蛋白質(zhì)3類貯能物質(zhì)，而多數(shù)魚類優(yōu)先消耗糖原和脂肪，其次消耗蛋白質(zhì)(Stirling, 1976; Kutty, 1978)，隨著魚體大量消耗貯能物質(zhì)，水分的相對含量增加(Love, 1970)。由大菱鲆體成分相關(guān)數(shù)據(jù)表分析可知，對比PH18B組、PH4.5B組與負對照組，粗蛋白和粗脂肪的變化趨勢由高到低為PH18B組、PH4.5B組與負對照組，水解魚蛋白提高了大菱鲆體內(nèi)粗脂肪和粗蛋白的含量，促進了大菱鲆的生長。對比正對照組與PH18A組魚體組成數(shù)據(jù)，在低植物蛋白飼料中，18%的水解魚蛋白促進大菱鲆的生長，卻未改變大菱鲆體成分，這表明18%的水解魚蛋白和22%的魚粉不但對大菱鲆生長產(chǎn)生的相似的作用效果，而且不影響魚體的營養(yǎng)組成。

本實驗在對肌肉18種氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸中除精氨酸，非必需氨基酸中除牛磺酸、丙氨酸、半胱氨酸有顯著差異外，其他氨基酸成分、總氨基酸、必需氨基酸總量均無顯著差異，這與衛(wèi)育良等(2014)的研究結(jié)果相似。這說明本實驗中的飼料由于采用復(fù)合植物蛋白源，大部分的必需氨基酸含量可能已經(jīng)能滿足大菱鲆對飼料中必需氨基酸的需要, 因而在添加水解魚蛋白的處理組并未引起魚體大部分氨基酸含量的顯著變化(衛(wèi)育良等, 2014)。

3.3 水解魚蛋白對大菱鲆肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

肌肉是動物的基本結(jié)構(gòu)組織，肌肉根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同，可以分為心肌、平滑肌和橫紋肌，大菱鲆作為一種經(jīng)濟魚類，具有很高的食用價值，因此，其橫紋肌的肌纖維成為本次實驗的研究重點。肌纖維橫截面積是描述肌肉組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，營養(yǎng)狀況和運動量對肌纖維橫截面積的大小有重要影響(Johnston,2000a、2000b、2003)。大菱鲆作為底棲冷水性生物，運動量較少，因此，在本實驗中，飼料營養(yǎng)組成成為影響其肌肉纖維橫截面積的一個主要因素。大菱鲆的肌纖維呈橢圓或多邊形等不規(guī)則形狀，本實驗以肌纖維形狀最多的橢圓形為標(biāo)準(zhǔn)，計算其橫截面積。結(jié)果顯示，添加18%水解魚蛋白的PH18B組和PH18A組的肌纖維橫截面積比PH4.5B組、PH4.5A組、正對照組、負對照組明顯增大，說明18%水解魚蛋白在促進大菱鲆生長的同時，也促進了肌纖維增粗；添加4.5%水解魚蛋白PH4.5B組和PH4.5A的肌纖維橫截面積與不添加水解與蛋白的負對照組的肌纖維橫截面積無顯著差異，說明在高植物蛋白飼料中，4.5%水解魚蛋白對大菱鲆肌肉的肌纖維橫截面積無顯著影響。

畜禽動物出生的最初階段，其肌纖維增生過程占據(jù)其主導(dǎo)地位，即其肌纖維總數(shù)量在后期生長發(fā)育過程中變化不大(de Almeida, 2010)，然而，在魚類上，Silva等(2017)在對羅非魚的研究中認為，營養(yǎng)素等因素會影響魚類整個生長過程中的肌纖維增生機制，進而影響肌纖維總數(shù)量。在無其他外界條件影響下，動物出生后肌肉體積的增加主要是由于已經(jīng)存在的肌纖維體積的增大，隨著肌纖維的增粗，肌肉間結(jié)締組織與脂肪組織的增加，肌纖維密度下降，即隨著機體體重的增加，肌纖維橫截面積增大，肌纖維密度降低(Macintosch,2006; 秦召等, 2006; Johnston,2000a、2000b、2003)。研究表明，魚體的生長與肌纖維橫截面積成正比例關(guān)系，與肌纖維密度成反比例關(guān)系(Johnston,2000a、2000b、2003)。在本實驗中，添加18%水解魚蛋白的PH18B組和PH18A組的肌纖維密度比PH4.5B組、PH4.5A組、正對照組和負對照組明顯降低，說明18%水解魚蛋白在促進大菱鲆生長的同時，降低了肌纖維密度。而添加4.5%水解魚蛋白PH4.5B組和PH4.5A的肌纖維密度與不添加水解魚蛋白的負對照組的肌纖維橫密度無顯著差異，說明在高植物蛋白飼料中，4.5%水解魚蛋白具對肌肉的肌纖維密度也無顯著影響。

4 結(jié)論

在高植物蛋白飼料中添加18%和4.5%的水解魚蛋白，均可以提高大菱鲆的飼料效率和蛋白沉積率，促進其生長，且18%的水解魚蛋白優(yōu)于4.5%；18%的水解魚蛋白促進了大菱鲆肌肉纖維橫截面積增加，降低了大菱鲆的肌肉纖維密度，而4.5%的水解魚蛋白在高植物蛋白飼料中，對大菱鲆肌纖維橫截面積和肌纖維密度均無顯著的影響。

Aksnes A, Hope B, H?stmark ?,. Inclusion of size fractionated fish hydrolysate in high plant protein diets for Atlantic cod,. Aquaculture,2006a, 261(3): 1102–1110

Aksnes A, Hope B, J?nsson E,. Size-fractionated fish hydrolysate as feed ingredient for rainbow trout () fed high plant protein diets. I: Growth, growth regulation and feed utilization. Aquaculture2006b, 261(1): 305–317

de Almeida FLA, Pessotti NS, Pinhal D,. Quantitative expression of myogenic regulatory factors MyoD and myogenin in pacu () skeletal muscle during growth. Micron2010, 41(8): 997–1004

Bakke S, Jordal AEO, Gomez-Requeni P,. Dietary protein hydrolysates and free amino acids affect the spatial expression of peptide transporter PepT1 in the digestive tract of Atlantic cod (). Comparative Biochemistry and Physiology, Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 156(1): 48–55

Espe M, Sveier H, Hogoy I,. Nutrient absorption and growth of Atlantic salmon (L.) fed fish protein concentrate. Aquaculture, 1999, 174(1–2): 119–137

Espe M, Ruohonen K, El-Mowafi A. Hydrolysed fish protein concentrate (FPC) reduces viscera mass in Atlantic salmon () fed plant-protein-based diets. Aquaculture Nutrition,2012, 18(6): 599–609

Hevr?y EM, Espe M, Waagb? R,. Nutrient utilization in Atlantic salmon (L.) fed increased levels of fish protein hydrolysate during a period of fast growth. Aquaculture Nutrition, 2005, 11(4): 301–313

Johnston IA, Alderson R, Sandham C,. Patterns of muscle growth in early and latematuring populations of Atlantic salmon (L.). Aquaculture, 2000a, 189(3–4): 307–333

Johnston IA, Alderson R, Sandham C,. Muscle fibre density in relation to the colour and texture of smoked Atlantic salmon (L.). Aquaculture, 2000b, 189(3–4): 335–349

Johnston IA, Manthri S, Alderson R,. Freshwater environment affects growth rate and muscle fibre recruitment in seawater stages of Atlantic salmon (L.). Journal of Experimental Biology, 2003, 206(8): 1337–1351

Kousoulaki K, Albrektsen S, Langmyhr E,. The water soluble fraction in fish meal (stickwater) stimulates growth in Atlantic salmon (L.) given high plant protein diets. Aquaculture2009, 289(1–2): 74–83

Kutty MN. Ammonia quotient in sockeye salmon (). Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1978, 35(7): 1003–1005

Liaset B, Espe M. Nutritional composition of soluble and insoluble fractions obtained by enzymatic hydrolysis of fish-raw materials. Process Biochemistry, 2008, 43(1): 42–48

Love M. The chemical biology of fishes. Quarterly Review of Biology, 1970

Mach DTN, Nortvedt R. Free amino acid distribution in plasma and liver of juvenile cabia () fed increased levels of lizardfish silage. Aquaculture Nutrition, 2011, 17(2): 644–656

Macintosch R, Gardiner F, Mccomas J. Skeletal muscle: Form and function. Champaign: Human Kinetics, 2006

Mu YC, Liang MQ, Zheng KK,. Effects of small molecule weight fish protein hydrolysate in high plant protein diets on the expression of liver IGF-I receptor and the growth of juvenile turbot (L.). Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(3): 50–57 [牟玉超, 梁萌青, 鄭珂珂, 等. 高植物蛋白飼料中不同水平低分子水解魚蛋白對大菱鲆(L.) 幼魚生長及肝臟IGF-I受體表達的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2016, 37(3): 50–57]

Peres H, Oliva-Teles A. The effect of dietary protein replacement by crystalline amino acid on growth and nitrogen utilization of turbotjuveniles. Aquaculture, 2005, 250(3–4): 755–764

Qin Z, Kang XT, Li GX. Relationship between histological characteristics of muscle fiber and meat quality. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2006, 34(22): 5872–5873, 5878 [秦召, 康相濤, 李國喜. 肌纖維組織學(xué)特性與肌肉品質(zhì)的關(guān)系.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(22): 5872–5873, 5878]

Refstie S, Olli JJ, Standal H. Feed intake, growth, and protein utilization by post-smolt Atlantic salmon () in response to graded levels of fish protein hydrolysate in the diet. Aquaculture, 2004, 239(1–4): 331–349

Silva TCD, Rocha JDAM, Moreira P,. Fish protein hydrolysate in diets for Nile tilapia post-larvae. Pesquisa Agropecuária Brasileira,2017, 52(7): 485–492

Stirling HP. Effects of experimental feeding and starvation on the proximate composition of the European bass. Marine Biology, 1976, 34(1): 85–91

Wang XX, Kong FH, Xu TH,. Evaluation on the nutritional composition of fish protein hydrolysate. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(3): 104–110 [王新星, 孔凡華, 許團輝, 等. 水解魚蛋白營養(yǎng)組成及評價. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2011, 32(3): 104–110]

Wei YL, Liang MQ, Mu YC,. The effect of ultrafiltered fish protein hydrolysate level on growth performance, protein digestibility and mRNA expression of PepT1 in juvenile turbot (L.). Aquaculture Nutrition, 2016, 22: 1006–1017

Wei YL, Liang MQ, Zheng KK,. The effects of fish protein hydrolysate on the digestibility of juvenile turbot (L.). Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(5): 910–920 [衛(wèi)育良, 梁萌青, 鄭珂珂, 等. 水解魚蛋白對大菱鲆幼魚消化率的影響. 水生生物學(xué)報, 2014, 38(5): 910–920]

Xu HG, Mu YC, Zhang Y,. Graded levels of fish protein hydrolysate in high plant diets for turbot (): Effects on growth performance and lipid accumulation. Aquaculture, 2016, 454: 140–147

Xu TH, Gao XP, Liang MQ,. Effects of small size-fractionated fish protein hydrolysate substitution of fish meal in high plant protein diets on the growth performance and non-specific immunity of Japanese flounder,. Progress in Fishery Sciences, 2012, 33(3): 60–69 [許團輝, 高湘萍, 梁萌青, 等. 高植物蛋白飼料中以低分子水解蛋白替代魚粉對牙鲆生長性能及非特異性免疫的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2012, 33(3): 60–69]

Zheng KK, Liang MQ, Yao HB,. Effect of dietary fish protein hydrolysate on growth, feed utilization and IGF-I levels of Japanese flounder (). Aquaculture Nutrition, 2012, 18(3): 297–303

Zheng KK, Liang MQ, Yao HB,. Effect of size-fractionated fish protein hydrolysate on growth and feed utilization of turbot (L.). Aquaculture Research, 2013a, 44(6): 895–902

Zheng KK, Xu TH, Qian CS,. Effect of low molecular weight fish protein hydrolysate on growth performance and IGF-I expression in Japanese flounder () fed high plant protein diets. Aquaculture Nutrition, 2013b, 20(4): 372–380

The Effects of Fish Protein Hydrolysate on the Growth, Body Composition and Morphological Structure of Muscle Fiber of Turbot (L.)

LI Benxiang1,2, WEI Yuliang2, LIANG Mengqing2①, XU Houguo2, QU Jiangbo3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Yantai Tianyuan Aquatic Product Co., Ltd. Yantai 264006)

This experiment was to investigate the effects of fish protein hydrolysate on growth, feed utilization, body composition, and morphological structure of muscle fibers in turbot (L.). Six isonitrogenous and isolipidic diets were formulated and fed to fish. The experimental diets contained two control groups with no fish protein hydrolysate, positive control group including 44% fish meal, negative control group including 22% fish meal. Four experimental groups with different levels of fish protein hydrolysate and fish meal, PH4.5A group contained 22% fish meal and 4.5% fish protein hydrolysate, PH4.5B group contained 17% fish meal and 4.5% fish protein hydrolysate, PH18A group contained 22% fish meal and 18% fish protein hydrolysate, and PH18B group contained 0.5% fish meal and 18% fish protein hydrolysate. The results showed that there were no significant differences in the weight gain rate and specific growth rate between PH4.5A and PH18B groups (>0.05), while PH4.5A group and PH18B group were significantly higher than that of PH4.5B group and negative control group (<0.05) and significantly lower than that of PH18A and positive control groups (<0.05). There were no significant differences in the feed efficiency, protein efficiency and protein retention efficiency between PH18A and positive control groups (>0.05), while PH18A and positive control groups were significantly higher than that of PH18B, PH4.5A and negative control group (<0.05). Contrary to feed efficiency, there were no significant differences in the feed intake among PH18A，PH18B and positive control groups (>0.05), while these groups were significantly lower than that of PH4.5A, PH4.5B and negative control groups (<0.05). There were no differences in the contents of crude protein and crude lipid between PH4.5B and negative control groups (>0.05), while these groups were significantly lower than that of PH18A and positive control groups (<0.05). There were no significant differences in total amino acids, essential amino acids and non-essential amino acids in the muscles among six groups (>0.05). The muscle fiber cross-sectional area in PH18A group was significantly higher than that of PH18B, positive control, PH4.5A, negative control, PH4.5B groups (<0.05), and PH18B group was significantly higher than PH4.5B group (<0.05). The muscle fiber density of PH18A group and PH18B group was significantly lower than that of PH4.5B group (<0.05). The above results show that both 18% and 4.5% fish protein hydrolysate added to high plant protein feeds can promote the growth of turbot and increase the feed efficiency and protein deposition rate of turbot, and growth and feed utilization in fish given 18% fish protein hydrolysate diet showed better than that of fish given 4.5% fish protein hydrolysate diets. For the morphological structure of muscle fiber, 18% fish protein hydrolysate in diets can increase the cross-sectional area of muscle fiber and reduce the muscle fiber density, while 4.5% of the fish protein hydrolysate did not affect significantly the cross-sectional area of the muscle fiber and the fiber density.

Turbot; Fish protein hydrolysate; Growth performance; Muscle fiber

LIANG Mengqing, E-mail: liangmq@ysfri.ac.cn

* 中國博士后科學(xué)基金(2018M632751)、國家自然科學(xué)基金(31672663)和青島市博士后應(yīng)用研究項目共同資助 [This work was supported by China Postdoctoral Science Foundation (2018M632751), National Natural Science Foundation of China (31672663), and Applied Research Program for Post-Doctoral in Qingdao]. 李本相，E-mail: 1005786450@qq.com

梁萌青，研究員，E-mail: liangmq@ysfri.ac.cn

2018-07-09,

2018-09-05

S963

A

2095-9869(2019)05-0155-11

10.19663/j.issn2095-9869.20180709002

http://www.yykxjz.cn/

李本相, 衛(wèi)育良, 梁萌青, 徐后國, 曲江波. 水解魚蛋白對大菱鲆生長、體組成及肌纖維組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2019, 40(5): 155–165

Li BX, Wei YL, Liang MQ, Xu HG, Qu JB. The effects of fish protein hydrolysate on the growth, body composition and morphological structure of muscle fiber of turbot (L.). Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(5): 155–165

(編輯 陳輝)