楊秀清,劉亞妮

聯(lián)苯代謝對(duì)微生物的生長(zhǎng)脅迫及分裂抑制

楊秀清*,劉亞妮

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

以聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯降解菌株R04(sp. R04)和幾種模式微生物為研究對(duì)象,利用高效液相色譜、熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡等分析微生物在聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)條件下細(xì)胞分裂和形態(tài)的變化.結(jié)果表明聯(lián)苯及其代謝產(chǎn)物對(duì)紅球菌R04和幾種模式微生物細(xì)胞的分裂有抑制作用,并對(duì)部分微生物形態(tài)有影響.與前體-聯(lián)苯及其代謝產(chǎn)物2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸相比, 2,3-二羥基聯(lián)苯對(duì)G+、G-細(xì)菌,或是酵母細(xì)胞分裂都有較強(qiáng)的抑制和形態(tài)的改變. 2,3-二羥基聯(lián)苯導(dǎo)致. R04和缺陷型. R04細(xì)胞形成不完整隔膜的比例增加;造成96.4%的大腸桿菌BL21細(xì)胞表面凹陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失,菌體體積縮小;導(dǎo)致枯草芽孢桿菌89.6%的細(xì)胞體積明顯縮小;導(dǎo)致金黃色葡萄球菌基本沒(méi)有細(xì)胞能形成完整的分裂隔膜;導(dǎo)致紅酵母細(xì)胞能進(jìn)行出芽生殖的比例從64.2%降低到19.3%,但對(duì)其細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變.聯(lián)苯代謝物2,3-二羥基聯(lián)苯對(duì)紅球菌R04及其它微生物細(xì)胞分裂和增殖的抑制作用比其前體-聯(lián)苯強(qiáng),建議在研究環(huán)境化合物與微生物互作時(shí),應(yīng)考慮環(huán)境化合物代謝的毒性效應(yīng).

聯(lián)苯代謝；紅球菌R04；細(xì)胞分裂；環(huán)境化合物

芳香烴及其衍生物是一類較為常見(jiàn)的環(huán)境化合物,其中包括聯(lián)苯和多氯聯(lián)苯(PCBs)[1],其理化性質(zhì)極為穩(wěn)定,并被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[2].然而聯(lián)苯和PCBs都有很強(qiáng)的毒性,能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在于環(huán)境中,對(duì)人類健康及生態(tài)環(huán)境具有很大的危害性[3-5].紅球菌R04(sp. R04)是一株可以有效降解聯(lián)苯/PCBs的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[6],和伯克霍爾德氏菌、假單胞菌、紅球菌RHA1等具有相同的聯(lián)苯/PCBs的代謝酶系.在聯(lián)苯/PCBs代謝過(guò)程中,聯(lián)苯首先被聯(lián)苯雙加氧酶氧化為2,3-二氫二羥基聯(lián)苯,繼而在2,3-二氫二羥基聯(lián)苯脫氫酶作用下形成2,3-二羥基聯(lián)苯(DHBP);DHBP在第二個(gè)雙加氧酶作用下產(chǎn)生黃色的開(kāi)環(huán)產(chǎn)物2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸(HOPDA),該產(chǎn)物被水解為苯甲酸;最后通過(guò)粘糠酸途徑被降解[7-9].

當(dāng)有機(jī)體接觸聯(lián)苯、PCBs等環(huán)境化合物時(shí),這些化合物對(duì)有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)造成一定程度的影響.例如PCBs會(huì)改變伯克氏菌的比表面,引起細(xì)胞輕微的質(zhì)壁分離[10],同時(shí)會(huì)抑制芽孢桿菌屬,假單胞菌屬,微球菌屬和沙雷氏菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)[11].聯(lián)苯和PCBs等化合物不僅能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng),而且對(duì)動(dòng)植物也產(chǎn)生毒副作用.有研究報(bào)道曾吃過(guò)被PCBs污染的魚(yú)類的女性分娩的兒童記憶力、注意力以及智商下降,表明這些化合物對(duì)發(fā)育中的胎兒大腦有強(qiáng)烈的副作用[12],而且Berg等[13]研究發(fā)現(xiàn),PCBs、二苯并呋喃(PCDFs)使鸕鶿的繁殖率降低,后代重量減輕.同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高含量的PCBs可使絳柳葉片白化,莖稈次生結(jié)構(gòu)受到抑制,根細(xì)胞內(nèi)含物減少,根系細(xì)胞受到不同程度的破壞[14].

本課題組前期對(duì)紅球菌R04降解聯(lián)苯/PCBs的能力做了大量研究,發(fā)現(xiàn)鹵代聯(lián)苯環(huán)上不同取代元素以及取代元素的數(shù)量、位置對(duì)其降解產(chǎn)生較大影響[15];同時(shí)發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯/PCBs代謝過(guò)程中,. R04的分裂方式?jīng)]有受到影響[16],但聯(lián)苯/PCBs會(huì)導(dǎo)致. R04細(xì)胞不能形成完整的分裂隔膜,進(jìn)而導(dǎo)致分裂受阻,細(xì)胞呈現(xiàn)絲狀化[17].目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于環(huán)境化合物本身對(duì)微生物生長(zhǎng)和分裂的影響,很少有學(xué)者研究環(huán)境化合物中間代謝物對(duì)微生物的分裂、增殖和發(fā)育是否產(chǎn)生影響,本文中. R04代謝聯(lián)苯/PCBs過(guò)程中會(huì)形成多種中間代謝物,究竟是哪種代謝物或是聯(lián)苯影響了. R04的生長(zhǎng)和分裂尚不清楚.因此,本文分別用聯(lián)苯及其代謝物DHBP和HOPDA培養(yǎng). R04、代謝酶缺陷型. R04,通過(guò)顯微和超顯微觀察細(xì)胞來(lái)確定影響. R04生長(zhǎng)和分裂的物質(zhì).其次,選擇大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母來(lái)探究聯(lián)苯及其代謝物對(duì)其它微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的影響,為探討環(huán)境化合物代謝與微生物的互作研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用的紅球菌R04、代謝酶缺陷型紅球菌R04(聯(lián)苯雙加氧酶缺失的菌株命名為. R04△A,2,3-二羥基聯(lián)苯-1,2雙加氧酶缺失的菌株命名為. R04△C,2-羥基-6-酮基-6-苯基-2,4-己二烯酸水解酶缺失的菌株命名為. R04△D)、大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母均由本實(shí)驗(yàn)室保存.所用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基.

培養(yǎng)基配方具體如下,基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基(1L): KH2PO4,2.93g;K2HPO4·3H2O,5.87g;MgSO4·7H2O,0.3g;FeSO4·7H2O,0.01g;NaCl,0.2g;(NH4)2SO4,5g;NiSO4·7H2O, 0.006g;CaCl2,0.03g;丁二酸鈉,1g;微量元素鹽溶液200μL.微量元素溶液(1L):Na3-Citrate·2H2O,0.18g; FeSO4·7H2O,0.034g;CoCl2·6H2O,0.005g;Na2MoO4·2H2O,0.005g;CuSO4·5H2O,0.004g;MnCl2·4H2O,0.002g;ZnCl2, 0.003g;H3BO3,0.002g.分別在基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基中加入葡萄糖、聯(lián)苯及其代謝物作為碳源.LB液體培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化鈉5g,加水定容至1L.YPD液體培養(yǎng)基(1L):胰蛋白胨20g,酵母膏10g,葡萄糖20g,加水定容至1L.

紅球菌R04分別接種于基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中,30℃,200r/min恒溫震蕩培養(yǎng);大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃,200r/min恒溫震蕩培養(yǎng);紅酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中30℃, 200r/min恒溫震蕩培養(yǎng).

1.2 主要試劑和儀器

聯(lián)苯購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試劑站,戊二醛購(gòu)于上海生工生物工程有限公司,DHBP購(gòu)于日本W(wǎng)ako和光純藥工業(yè)株式會(huì)社,細(xì)胞膜染料FM1-43購(gòu)于北京海德生物技術(shù)有限公司,其他化學(xué)試劑購(gòu)于太原市津海有限公司;恒溫震蕩培養(yǎng)箱2HWY-200D購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司,日立UV- 2010分光光度計(jì)購(gòu)于Hitachi Instruments公司,高效液相色譜儀Waters 2487購(gòu)于美國(guó)Waters公司,Delta Vision Deconvolution microscope購(gòu)于美國(guó)Delta Vision公司,日立掃描電子顯微鏡SU1510購(gòu)于Hitachi Instruments公司.

1.3 紅球菌R04細(xì)胞的共代謝

1.3.1 生物量測(cè)定及代謝分析,分別在10mmol/L聯(lián)苯中添加0,2,4和6mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng). R04野生型,每隔4h取培養(yǎng)液測(cè)定OD600值.取培養(yǎng)液加入等體積色譜級(jí)甲醇,混勻后離心取上清即為總代謝物.另取培養(yǎng)液通過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾除去聯(lián)苯顆粒后離心收集菌體,用磷酸緩沖液PBS(20mmol/L, pH 8.0)洗滌菌體,然后用等體積色譜級(jí)甲醇抽提,離心取上清即為胞內(nèi)代謝物.

將上述制備的待測(cè)樣品經(jīng)高效液相色譜儀分析[18],上樣量為10μL,采用外標(biāo)法定量.該檢測(cè)過(guò)程使用C18色譜柱,流動(dòng)相使用體積比9:1的甲醇與水混合液,流動(dòng)相以1.0mL/min的速度洗脫,在254nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè).

分別在基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯,DHBP, HOPDA培養(yǎng)R04△A,R04△C,R04△D,并添加1/3葡萄糖(3.3mmol/L)提供碳源和能源維持細(xì)胞的生長(zhǎng),每隔4h取樣測(cè)定OD600值,繪制生長(zhǎng)曲線.

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,胞外代謝物等于總代謝物減去胞內(nèi)代謝物.生物量測(cè)定及代謝測(cè)定實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,以3次重復(fù)平均值作為最后結(jié)果.

1.4 熒光顯微鏡觀察

將10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA作為碳源培養(yǎng)紅球菌R04、代謝酶缺陷型紅球菌R04(培養(yǎng)時(shí)添加3.3mmol/L葡萄糖維持細(xì)胞生長(zhǎng))、大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母,培養(yǎng)至指數(shù)前期取適量菌液,8000r/ min離心5min收集菌體,PBS洗滌菌體2次;重懸后加入膜染料FM1-43(終濃度為0.1 μg/mL)避光染色5min;離心棄上清,PBS洗滌菌體2次,然后用適量PBS懸浮菌體.取上述染色菌液15μL制片,通過(guò)Delta Vision去卷積熒光顯微鏡觀察.

1.5 掃描電子顯微鏡觀察

6種微生物細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)前期的方法同1.4,然后取適量菌液用2.5%戊二醛前固定,1%鋨酸后固定,乙醇逐級(jí)脫水,制片后置于60℃恒溫箱干燥,鍍膜,掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

2 結(jié)果分析

2.1 紅球菌R04聯(lián)苯代謝分析

2.1.1 聯(lián)苯培養(yǎng)下紅球菌R04的代謝分析,為了研究在葡萄糖存在的情況下,紅球菌R04是否還會(huì)降解聯(lián)苯,本文用聯(lián)苯和不同濃度葡萄糖共同培養(yǎng). R04,結(jié)果顯示:添加葡萄糖后,. R04生長(zhǎng)速率加快,但不會(huì)顯著提高其生物量(圖1a).添加葡萄糖并不會(huì)影響細(xì)胞對(duì)聯(lián)苯的代謝,4種培養(yǎng)條件下細(xì)胞外聯(lián)苯濃度均降低,細(xì)胞內(nèi)聯(lián)苯濃度呈現(xiàn)波動(dòng)但整體為下降趨勢(shì),且葡萄糖濃度對(duì)聯(lián)苯代謝速率影響不大(圖1b和c).表明葡萄糖存在時(shí). R04仍會(huì)降解聯(lián)苯,該條件可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

G為葡萄糖,BP為聯(lián)苯

2.1.2 聯(lián)苯及其代謝物培養(yǎng)下代謝酶缺陷型紅球菌R04的生長(zhǎng),代謝酶缺陷型紅球菌R04不能利用聯(lián)苯及其代謝物產(chǎn)生能量供其生長(zhǎng),所以需要添加額外的碳源.本文用1/3葡萄糖和相應(yīng)代謝物共同培養(yǎng)缺陷型. R04,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞都可以生長(zhǎng),但是. R04△C細(xì)胞的生長(zhǎng)量明顯低于. R04△A和. R04△D(圖2),說(shuō)明聯(lián)苯代謝物DHBP對(duì). R04△C的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用.

圖2 缺陷型紅球菌R04生長(zhǎng)曲線

2.2 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)紅球菌R04分裂的抑制

圖3 紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A-D, exponential phaseR04 wild type cultured with glucose, biphenyl, DHBP and HOPDA in basic mineral medium, respectively.

分別用10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA為碳源的基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌R04,取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,如圖3所示.在葡萄糖和HOPDA為碳源培養(yǎng)條件下,可以觀察到. R04細(xì)胞膜清晰,形成完整的分裂隔膜(圖3A和D);聯(lián)苯培養(yǎng)的. R04細(xì)胞分裂隔膜不完整,細(xì)胞質(zhì)中有熒光斑點(diǎn)形成(圖3B);而DHBP培養(yǎng)的. R04細(xì)胞邊界模糊,細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度基本與細(xì)胞質(zhì)相同,大量熒光斑點(diǎn)聚集在細(xì)胞質(zhì)中,看不到完整的分裂隔膜(圖3C).SEM結(jié)果顯示,聯(lián)苯培養(yǎng)的細(xì)胞(圖4B)端部或一側(cè)出現(xiàn)腫脹小結(jié),圖中紅色箭頭指示細(xì)胞出現(xiàn)腫脹小結(jié)的位置;而生長(zhǎng)于葡萄糖中的細(xì)胞(圖4A)正常分裂.. R04在代謝聯(lián)苯的過(guò)程中會(huì)生成代謝物DHBP,所以推測(cè)DHBP影響了. R04細(xì)胞分裂隔膜的形成,進(jìn)而影響細(xì)胞的正常分裂.

A and B exponential phaseR04wild type cultured with glucose and BP, respectively

圖5 紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A-D, exponential phaseR04 wild type cultured with glucose, biphenyl, DHBP and HOPDA in LB medium, respectively

分別用含10mmol/L的葡萄糖,聯(lián)苯,DHBP和HOPDA的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)紅球菌R04,取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,如圖5所示.在LB和HOPDA(圖5A和D)培養(yǎng)條件下,可以觀察到. R04細(xì)胞膜清晰完整,能形成完整的分裂隔膜,而添加聯(lián)苯(圖5B)后,細(xì)胞質(zhì)中有熒光斑點(diǎn)產(chǎn)生;而DHBP處理后的. R04細(xì)胞(圖5C)膜熒光強(qiáng)度著色不均,無(wú)法形成完整的分裂隔膜.所以推測(cè)無(wú)論在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還是LB培養(yǎng)基中,添加聯(lián)苯代謝物DHBP都會(huì)影響. R04細(xì)胞的分裂.

2.3 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)代謝酶缺陷型R. R04分裂的抑制

圖6 缺陷型紅球菌R04熒光顯微鏡圖

A and B, exponential phase. R04 △A cells cultured with glucose and biphenyl. C and D, exponential phase. R04 △C cells cultured with glucose and DHBP. E and F, exponential phase. R04△D cells cultured with glucose and HOPDA

為了進(jìn)一步研究是哪種物質(zhì)影響了紅球菌R04細(xì)胞分裂隔膜的形成,本文用相應(yīng)的代謝物培養(yǎng)紅球菌R04缺陷型(同時(shí)加入葡萄糖保持細(xì)胞生長(zhǎng)),取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察.由圖6可看出,用聯(lián)苯培養(yǎng). R04△A(圖6B)和用HOPDA培養(yǎng). R04△D(圖6F)與用葡萄糖培養(yǎng)相比(圖6A和E),. R04△A和. R04△D細(xì)胞分裂隔膜清晰可見(jiàn),能進(jìn)行正常分裂.而DHBP培養(yǎng). R04△C(圖6D)與葡萄糖培養(yǎng)(圖6C)相比差別很大,細(xì)胞邊界模糊不清,細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)著色程度相同,看不到清晰完整的分裂隔膜,細(xì)胞質(zhì)中有熒光斑點(diǎn)形成.經(jīng)過(guò)SEM觀察得出,葡萄糖培養(yǎng)的. R04△A(圖7A)和HOPDA培養(yǎng)的. R04△D(圖7D)細(xì)胞表現(xiàn)正常;當(dāng)用聯(lián)苯培養(yǎng). R04△A(圖7B)時(shí),有個(gè)別細(xì)胞端部或一側(cè)出現(xiàn)腫脹小結(jié),而用DHBP培養(yǎng). R04△C(圖7C)時(shí),出現(xiàn)腫脹小結(jié)的細(xì)胞數(shù)量增多,圖中紅色箭頭指示細(xì)胞出現(xiàn)腫脹小結(jié)的位置.結(jié)果表明DHBP為主要影響. R04細(xì)胞分裂隔膜形成的物質(zhì),進(jìn)而影響細(xì)胞的正常分裂.

A and B, exponential phase. R04△A cultured with glucose and biphenyl. C, exponential phase. R04△C cultured glucose and DHBP. D, exponential phase. R04△D cultured glucose and HOPDA. E, partial enlarged view of C

為了進(jìn)一步研究DHBP對(duì). R04△C的影響,我們選取0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1mmol/L DHBP去處理. R04△C細(xì)胞,并添加1/3葡萄糖維持. R04△C的生長(zhǎng),取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,結(jié)果如圖8所示:在葡萄糖培養(yǎng)條件下細(xì)胞分裂隔膜完整,清晰可見(jiàn)(圖8A);在0.01mmol/L DHBP作用下細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)粘附的熒光斑點(diǎn)(圖8B),隨著DHBP濃度的增大,熒光斑點(diǎn)增多,細(xì)胞絲狀化明顯,說(shuō)明低濃度DHBP也導(dǎo)致細(xì)胞不能形成完整的分裂隔膜,影響細(xì)胞的正常分裂.

圖8 R. R04△C熒光顯微鏡圖

A, exponential phase. R04△C cultured with glucose. B~F,exponential phase. R04△C cultured with glucose and 0.01、0.03、0.05、0.1、0.3mmol/L DHBP, respectively

2.4 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)其它微生物細(xì)胞分裂的影響

2.4.1 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)大腸桿菌BL21分裂的影響,選擇革蘭氏陰性細(xì)菌的代表大腸桿菌作為研究對(duì)象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP和HOPDA培養(yǎng)大腸桿菌,取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察.如圖9所示,在所有培養(yǎng)條件下大腸桿菌細(xì)胞膜著色明顯,能看到清晰并完整的分裂隔膜,但DHBP培養(yǎng)的細(xì)胞(圖9C)體積明顯小于其它3種情況.通過(guò)SEM圖可看出,生長(zhǎng)于LB和聯(lián)苯培養(yǎng)基中的大腸桿菌(圖9E和F)形態(tài)完整,為短桿狀,能明顯看出二分裂的生殖方式;經(jīng)DHBP處理后,細(xì)胞(圖9G)生長(zhǎng)受到嚴(yán)重阻滯,細(xì)胞發(fā)生凹陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失,但細(xì)胞膜相對(duì)完整,這種結(jié)果的產(chǎn)生機(jī)制目前尚不清楚,需要進(jìn)行更深入的研究.

2.4.2 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)枯草芽孢桿菌WB600分裂的影響,選擇革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌WB600作為研究對(duì)象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,如圖10所示.對(duì)照組中的枯草芽孢桿菌(圖10A)分裂正常,能形成完整的分裂隔膜;用聯(lián)苯處理后枯草芽孢桿菌(圖10B)部分細(xì)胞發(fā)生絲狀化,比正常細(xì)胞長(zhǎng)約2~3倍;而用DHBP處理后細(xì)胞(圖10C)體積明顯縮小,生長(zhǎng)緩慢,而且不能形成完整的分裂隔膜.通過(guò)SEM圖10也證明了這一結(jié)論.

E-G: Scanning electron micrograph ofBL21, exponential phase cells cultured with LB, biphenyl, DHBP, respectively

2.4.3 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌分裂的影響,選擇金黃色葡萄球菌作為研究對(duì)象,分別在LB液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,取指數(shù)前期細(xì)胞經(jīng)FM1-43染色后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察如圖11所示.對(duì)照組(圖11A)和聯(lián)苯培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌(圖11B)細(xì)胞膜著色明顯,形成完整分裂隔膜的細(xì)胞較多,而用DHBP處理后的細(xì)胞(圖11C)幾乎不能形成分裂隔膜,表明DHBP影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和分裂.SEM圖結(jié)果顯示:用DHBP處理過(guò)的金黃色葡萄球菌(圖11F)有些細(xì)胞從球狀變成了不規(guī)則的啞鈴狀;對(duì)照組(圖11D)和聯(lián)苯(圖11E)處理的金黃色葡萄球菌能形成完整的分裂隔膜,細(xì)胞能正常分裂.圖11D和E紅色箭頭指示的橢球狀細(xì)胞表示能形成完整分裂隔膜,即將進(jìn)行細(xì)胞分裂.

D-F: Scanning electron micrograph ofWB600, exponential phase cells cultured with LB, biphenyl, and DHBP, respectively

D-F: Scanning electron micrograph of, exponential phase cellswith LB, biphenyl, and DHBP, respectively

2.4.4 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)紅酵母分裂的影響,選擇紅酵母作為真菌研究對(duì)象,分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加10mmol/L聯(lián)苯,DHBP培養(yǎng)紅酵母,取指數(shù)前期細(xì)胞制片后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察.結(jié)果顯示對(duì)照組中紅酵母(圖12A)出芽生殖的細(xì)胞較多,而用DHBP處理過(guò)的紅酵母(圖12C)出芽生殖的比例明顯降低,大部分以單個(gè)細(xì)胞形式存在,生長(zhǎng)于聯(lián)苯中的細(xì)胞(圖12B)多以3~4個(gè)細(xì)胞的聚集狀態(tài)形式存在.通過(guò)SEM圖也觀察到這一現(xiàn)象.我們通過(guò)統(tǒng)計(jì)200個(gè)紅酵母細(xì)胞來(lái)說(shuō)明DHBP對(duì)細(xì)胞出芽率的影響,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:對(duì)照組中出芽生殖的細(xì)胞比例為64.2%,而未出芽的細(xì)胞比例為35.8%;實(shí)驗(yàn)組DHBP處理過(guò)的細(xì)胞出芽生殖比例降低為19.3%,未出芽的細(xì)胞比例為80.7%,說(shuō)明DHBP影響了紅酵母的生長(zhǎng)和繁殖.

D-F: Scanning electron micrograph of, exponential phase cells cultured with YPD, biphenyl, and DHBP, respectively

表1 DHBP對(duì)不同微生物細(xì)胞形態(tài)和分裂的影響

注:+越多,表示DHBP對(duì)細(xì)胞影響越大.

綜上結(jié)果可以看出,DHBP對(duì)不同微生物細(xì)胞影響不同,如表1和表2所示DHBP對(duì)大腸桿菌BL21影響作用最大,導(dǎo)致96.4%的細(xì)胞表面凹陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失,菌體體積縮小;對(duì). R04和枯草芽孢桿菌WB600細(xì)胞影響次之,導(dǎo)致. R04和缺陷型. R04細(xì)胞形成不完整隔膜的比例增加,導(dǎo)致枯草芽孢桿菌89.6%的細(xì)胞體積明顯縮小,同時(shí)無(wú)法形成完整的分裂隔膜;對(duì)金黃色葡萄球菌、紅酵母影響作用最小,導(dǎo)致金黃色葡萄球菌基本沒(méi)有細(xì)胞形成完整的分裂隔膜;導(dǎo)致紅酵母細(xì)胞能進(jìn)行出芽生殖的比例從64.2%降低到19.3%,但對(duì)其細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變.

表2 聯(lián)苯及其代謝物對(duì)不同微生物細(xì)胞形態(tài)和分裂的影響

注:對(duì)金黃色葡萄球菌的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示的是能形成完整分裂隔膜的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例;對(duì)紅酵母的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示的是能進(jìn)行出芽生殖的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例;對(duì)其他微生物細(xì)胞的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表示異常細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例.

3 討論

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)芳香化合物的降解主要研究前體物質(zhì)對(duì)微生物的影響,很少有人研究代謝物對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的影響,Yamada等[19]研究報(bào)道當(dāng)向培養(yǎng)物中加入2-羥基聯(lián)苯或3-羥基聯(lián)苯后,MV1184,PpY101和PA01細(xì)胞的分裂受到抑制,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞絲狀化; Mizukami-Murata等[20]研究表明低取代氯PCBs能夠抑制PC12細(xì)胞神經(jīng)元的伸長(zhǎng);Subramanian等[21]也發(fā)現(xiàn),雖然母體多氯聯(lián)苯和高取代氯的OH-PCBs表現(xiàn)出較低或不可檢測(cè)的毒性,但低取代氯的OH-PCBs顯著抑制了擬南芥的發(fā)芽率和植物生長(zhǎng).這些研究?jī)H僅是證明了聯(lián)苯/PCBs的某種衍生物對(duì)有機(jī)體的影響,沒(méi)有完整的分析聯(lián)苯/PCBs一系列的代謝物對(duì)有機(jī)體的影響.本文為了確定聯(lián)苯培養(yǎng)紅球菌R04過(guò)程中具體是哪種代謝物影響了紅球菌R04細(xì)胞的分裂和形態(tài),分別用聯(lián)苯及其代謝物DHBP和HOPDA培養(yǎng)R04、相應(yīng)代謝酶缺陷型R04,通過(guò)熒光顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞的分裂情況和形態(tài)變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其它代謝物培養(yǎng)相比,DHBP培養(yǎng)的R04和缺陷型細(xì)胞膜邊界模糊,看不到清晰完整的細(xì)胞分裂隔膜,只觀察到細(xì)胞質(zhì)中粘附的熒光斑點(diǎn),掃描電子顯微鏡觀察到DHBP培養(yǎng)的細(xì)胞在分裂過(guò)程中細(xì)胞一側(cè)或端部形成腫脹的小結(jié),影響了R04的正常分裂.其次本文還用聯(lián)苯及其代謝物作用了其它的微生物細(xì)胞:大腸桿菌BL21、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌、紅酵母,結(jié)果顯示與對(duì)照組、聯(lián)苯、HOPDA條件培養(yǎng)下的細(xì)胞相比,DHBP處理過(guò)的細(xì)胞發(fā)生不同程度的異常變化,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常分裂,可見(jiàn)DHBP是主要影響細(xì)胞形態(tài)和分裂隔膜形成的物質(zhì).當(dāng)在基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中添加聯(lián)苯及其代謝物時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)出類似的分裂情況，結(jié)果顯示代謝物DHBP的毒害作用大于聯(lián)苯和HOPDA,聯(lián)苯培養(yǎng)下細(xì)胞質(zhì)中有熒光斑點(diǎn)產(chǎn)生，推測(cè)是由于紅球菌R04將聯(lián)苯代謝為DHBP的結(jié)果，其聯(lián)苯自身的毒害性小于DHBP.

從化學(xué)結(jié)構(gòu)式來(lái)看,聯(lián)苯代謝物DHBP苯環(huán)上有兩個(gè)相鄰的羥基,而HOPDA苯環(huán)上含有一個(gè)羥基和一個(gè)羧基.Wang等[22]研究結(jié)果表示,影響取代芳烴化合物毒性的主要影響因素是分子量,分子量越大,化合物越穩(wěn)定,化合物的脂溶性越好,毒性越強(qiáng).同時(shí),苯環(huán)上羥基的引入可增強(qiáng)與生物體內(nèi)受體堿性基團(tuán)的結(jié)合能力,導(dǎo)致活性和毒性的增高[23].許多研究也認(rèn)為氫鍵結(jié)合是毒物與受體之間的主要作用方式之一,化合物毒性越大,在結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)更多的氫鍵供體和受體[24].本文研究的DHBP和HOPDA苯環(huán)上的取代基可能參與氫鍵的生成,因此推測(cè)DHBP造成細(xì)胞分裂過(guò)程中的異常行為可能與其苯環(huán)上兩個(gè)羥基的存在以及氫鍵結(jié)合的能力有很大相關(guān)關(guān)系.

芬頓氧化技術(shù)作為一種具有高效、廉價(jià)、選擇性小等特點(diǎn)的高級(jí)氧化技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境污染處理領(lǐng)域[25],特別是對(duì)于難以氧化的芳香類化合物及一些雜環(huán)類化合物,能夠很好的降解.本研究用DHBP處理細(xì)胞時(shí),基礎(chǔ)礦物培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基中都避免不了含有亞鐵離子,培養(yǎng)過(guò)程中與DHBP苯環(huán)上所帶有的羥基基團(tuán)發(fā)生芬頓反應(yīng),培養(yǎng)基與菌體顏色最終變?yōu)楹谏?其過(guò)程氧化掉一部分2,3-羥基聯(lián)苯,所以推測(cè)能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用的2,3-羥基聯(lián)苯的量是微小的,但微量的DHBP仍導(dǎo)致使細(xì)胞無(wú)法形成完整的分裂隔膜,影響細(xì)胞的正常分裂.同時(shí)為了驗(yàn)證低濃度的DHBP能抑制細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng),在0~1mmol/L DHBP之間選取適合濃度去處理. R04DC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)0.01mmol/L DHBP作用下細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)粘附的熒光斑點(diǎn),隨著DHBP濃度的增大,熒光斑點(diǎn)增多,而且培養(yǎng)基和菌體不會(huì)變黑色,說(shuō)明低濃度的DHBP確實(shí)對(duì)細(xì)胞有毒害作用.所以推測(cè)當(dāng)用10mmol/L的DHBP處理細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基和菌體顏色變黑的原因有可能是DHBP的濃度太高所致的.

根據(jù)革蘭氏染色法原理將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌,革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁厚,肽聚糖含量豐富,而革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖層薄,交聯(lián)松散,但其脂類含量高.細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的顯著不同,導(dǎo)致這兩類細(xì)菌在染色性、抗原性、毒性、對(duì)某些藥物的敏感性等方面存在很大差異[26].本研究中用DHBP處理革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌:紅球菌R04、枯草芽孢桿菌WB600、金黃色葡萄球菌時(shí),使紅球菌細(xì)胞無(wú)法形成完整的分裂隔膜,在熒光顯微鏡下觀察到一些粘附的熒光斑點(diǎn),掃描電子顯微鏡下也觀察到細(xì)胞一側(cè)或端部出現(xiàn)腫脹的小結(jié),導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常;用DHBP處理枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌時(shí)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌細(xì)胞體積明顯縮小,導(dǎo)致金黃色葡萄球菌形成分裂隔膜的細(xì)胞減少,掃描電子顯微鏡下觀察到有些細(xì)胞形狀變?yōu)閱♀彔?而用DHBP處理陰性菌大腸桿菌BL21時(shí),大腸桿菌生長(zhǎng)阻滯,細(xì)胞體積縮小,分裂受到抑制,掃描電子顯微鏡下觀察到大腸桿菌細(xì)胞表面凹陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失.可以說(shuō)明DHBP對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的影響比對(duì)陽(yáng)性細(xì)菌的影響作用大.有研究結(jié)果顯示,加入1g/L山梨酸鉀后革蘭氏陰性菌的菌數(shù)可減少近102~103.5CFU/mL,而革蘭氏陽(yáng)性菌的菌數(shù)只能減少近10CFU/mL,說(shuō)明山梨酸鉀對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽(yáng)性菌要高2倍以上.山梨酸鉀具有親脂性,革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁脂類物質(zhì)含量較高,因此山梨酸鉀分子易通過(guò);革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁則含有大量肽聚糖,不易通過(guò)[27]. Rundegren等[28]研究中,G-細(xì)菌經(jīng)6.4mmol/L Delmopinol處理后,其胞壁超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外形均出現(xiàn)很明顯的改變,大量囊泡和膜連接物質(zhì)被釋放出細(xì)胞外,而經(jīng)同樣方法處理的G+細(xì)菌胞壁則無(wú)明顯變化,10min后僅部分細(xì)胞周圍有球形小顆粒出現(xiàn).2,3-二羥基聯(lián)苯不溶于水,易溶于醇、丙酮等有機(jī)溶劑,具有親脂性,所以我們推測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同可能是造成2,3-二羥基聯(lián)苯對(duì)兩類細(xì)菌影響差異的主要原因.然而聯(lián)苯及其中間代謝物影響細(xì)胞生長(zhǎng)分裂的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研 究.

4 結(jié)論

4.1 添加葡萄糖不會(huì)影響紅球菌R04對(duì)聯(lián)苯的代謝,培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞外聯(lián)苯濃度均降低,細(xì)胞內(nèi)聯(lián)苯濃度呈現(xiàn)波動(dòng)但整體為下降趨勢(shì).

4.2 2,3-二羥基聯(lián)苯對(duì)紅球菌R04及其它幾種模式菌株都具有較強(qiáng)的抑制作用,影響細(xì)胞的正常形態(tài)和分裂增殖,導(dǎo)致紅球菌R04端部腫脹,大腸桿菌BL21細(xì)胞內(nèi)陷,胞質(zhì)內(nèi)容物流失,導(dǎo)致枯草芽孢桿菌WB600體積縮小,金黃色葡萄球菌無(wú)法形成正常的分裂隔膜,并導(dǎo)致酵母的出芽生殖比例從64.2%降低到19.3%,表明2,3-二羥基聯(lián)苯對(duì)革蘭氏陰性菌的毒性效應(yīng)大于革蘭氏陽(yáng)性菌.

[1] 皮文清,曲媛媛,張 強(qiáng),等.異生型化合物生物降解及調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展 [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2010,33(4):72-76.Pi W Q, Qu Y Y, Zhang Q, et al. Advance on Regulation and Metabolic Pathway in Bacterial Degradation of Xenobiotics [J]. Environmental Science & Technology, 2010,33(4):72-76.

[2] Safe S. Polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-p-dioxins (PCDDs), dibenzofurans (PCDFs), and related compounds: environmental and mechanistic considerations which support the development of toxic equivalency factors (TEFs) [J]. Crc Critical Reviews in Toxicology, 1990,21(1):51-88.

[3] Akahane M, Matsumoto S, Kanagawa Y, et al. Long-Term Health Effects of PCBs and Related Compounds: A Comparative Analysis of Patients Suffering from Yusho and the General Population [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2018,74(2):203-217.

[4] Weber R, Herold C, Hollert H, et al. Life cycle of PCBs and contamination of the environment and of food products from animal origin [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2018,25(1):16325-16343.

[5] 徐 莉,滕 應(yīng),張雪蓮,等.多氯聯(lián)苯污染土壤的植物-微生物聯(lián)合田間原位修復(fù) [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2008,28(7):646-650.Xu L, Teng Y, Zhang X L, et al. Combined remediation of PCBs polluted soil by plant and microorganism in a field trial [J]. China Environmental Science, 2008,28(7):646-650.

[6] Yang Xiuqing, Sun Yan, Qian Shijun. Biodegradation of sevenpolychlorinated biphenyls by a newly isolated aerobic bacterium(sp. R04) [J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2004,31(9):415-420.

[7] Hayase N, Taira K, Furukawa K. Pseudomonas putida KF715bphABCD operon encoding biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation: cloning, analysis, and expression in soil bacteria [J]. Journal of Bacteriology, 1990,172(2):1160-1164.

[8] 孫 艷,鈔亞鵬,錢世鈞.嗜吡啶紅球菌R04的聯(lián)苯降解途徑的研究 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2003,43(5):653-658. Sun Yan, Chao Y P, Qian S J. Study on the Degradation Pathway of Biphenyl byR04 [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2003,43(5):653-658.

[9] Bhowmik S, Horsman G P, Bolin J T, et al. The molecular basis for inhibition of BphD, a C-C bond hydrolase involved in polychlorinated biphenyls degradation: large 3-substituents prevent tautomerization [J]. Journal of Biological Chemistry, 2007,282(50):36377-36385.

[10] Parnell J J, Park J, Denef V, et al. Coping with polychlorinated biphenyl (PCB) toxicity: physiological and genome-wide responses of Burkholderiaxenovorans LB400 to PCB-mediated stress [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006,72(10):6607-6614.

[11] Bourquin A W, Cassidy S. Effect of polychlorinated biphenyl formulations on the growth of estuarine bacteria [J]. Applied Microbiology, 1975,29(1):125-127.

[12] Joseph L J, Sandra W J. Intellectual Impairment in Children Exposed to Polychlorinated Biphenyls in Utero [J]. New England Journal of Medicine, 1996,335(11):783-789.

[13] Berg M V D, Craane B L H J, Sinnige T, et al. Biochemical and toxic effects of polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-P-dioxins (PCDDs) and dibenzofurans (PCDFs) in the cormorant (phalacrocorax carbo) after in ovo exposure [J]. Environmental Toxicology & Chemistry, 2010,13(5):803-816.

[14] 李 葉,張 爽,李玉靈,等.多氯聯(lián)苯暴露對(duì)絳柳初生根及顯微結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 北方園藝, 2016,(24):55-60.Li Y, Zhang S, Li Y L, et al. Effects of Polychlorinated Biphenyls(PCBs) on the Initial Roots and Microstructure of Salix matsudana f.pendula Schneid [J]. Northern Horticulture, 2016,(24):55-60.

[15] 楊秀清,鄭 媛,李鵬麗,等.紅球菌-R04生物降解多鹵代聯(lián)苯的影響因素研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2010,30(5):694-698. Yang X Q, Zheng Y, Li PL, et al. Influencing factor for the biodegradation of polyhalogenated biphenyls bysp. R04 [J]. China Environmental Science, 2010,30(5):694-698.

[16] 楊秀清,商慧慧.紅球菌R04細(xì)胞的不對(duì)稱分裂及其在聯(lián)苯脅迫下的分裂抑制 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2018,58(5):893-906. Yang X Q, Shang H H. Asymmetric cell division of Rhodococcus sp. R04 and its division inhibition under biphenyl stress [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2018,58(5):893-906.

[17] 曹星星,楊秀清.聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯對(duì)紅球菌R04細(xì)胞形態(tài)及隔膜的影響 [J]. 山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016,39(2):287-294.Cao X X, Yang X Q. The effect of biphenyl/polychlorinated biphenyl on cell morphology and septum ofsp. R04 [J].Journal of Shanxi University(Natural Science Edition), 2016,39(2):287-294.

[18] Hayteas D L, Duffield D A. The determination by HPLC of PCB and p,p′ -DDE residues in marine mammals stranded on the Oregon Coast [J]. Marine Pollution Bulletin, 1997,34(10):844-848.

[19] Yamada T, Shimomura Y, Hiraoka Y, et al. Oxidative stress by biphenyl metabolites induces inhibition of bacterial cell separation [J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2006,73(2):452-457.

[20] Mizukami-Murata S, Fujita K, Nakano T. Effect of lower chlorinated hydroxylated-polychlorobiphenyls on development of PC12cells [J]. Environmental Science & Pollution Research, 2017,25(17):1-12.

[21] Subramanian S, Schnoor J L, Aken B V. Effects of Polychlorinated Biphenyls (PCBs) and Their Hydroxylated Metabolites (OH-PCBs) on Arabidopsis thaliana [J]. Environmental Science & Technology, 2017, 51(12):7263-7270.

[22] Wang L, Li F. Study on the Quantitative Structure-activity Relationship of Acute Toxicities of Substituted Aromatic Compounds to Daphnia magna [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(23):12542-12544.

[23] 陳景文,廖宜勇,趙元慧,等.取代氮雜環(huán)類化合物對(duì)大型蚤(Daphnia magna Straus)的定量結(jié)構(gòu)－活性關(guān)系研究 [J].農(nóng)藥, 1996,35(5):21-24.Chen J W, Liao Y Y, Zhao Y H, et al. Study on quantitative structure- activity relationship of substituted nitrogen heterocyclic compounds to Daphnia magna Straus [J]. Pesticide , 1996,35(5):21-24.

[24] Struck S, Schmidt U, Gruening B, et al. Toxicity versus potency: elucidation of toxicity properties discriminating between toxins, drugs, and natural compounds [J]. Genome informatics, 2008,20(20):231-242.

[25] Albert J O. Nitrogenremoval in constructed wetlands treating nitrified meat processing effluent [J]. Water Science and Technology, 1995,32(3):137-147.

[26] 徐文玉.細(xì)菌細(xì)胞壁的教學(xué)方案 [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1985,12(5): 44-48.Xu W Y. Teaching program of bacterial cell wall [J]. Acta Mcrobiologica Sinica, 1985,12(5):44-48.

[27] 滕 菲,郭桂萍,趙 勇,等.革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌對(duì)山梨酸鉀的耐受差異性 [J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012,31(4):417-422.Teng F, Guo G P, Zhao Y, et al. Study of the Tolerance Difference between Gram Positive and Gram Negative Bacteria to Potassium Sorbate [J]. Food Science and Biotechnology, 2012,31(4):417-422.

[28] Rundegren J, T Sj?din, Petersson L, et al. Delmopinol interactions with cell walls of gram-negative and gram-positive oral bacteria [J]. Oral Microbiology & Immunology, 1995,10(2):102-109.

致謝：感謝導(dǎo)師楊秀清老師以及師姐商慧慧提供的幫助與支持,在此表示由衷感謝.

Growth stress and division inhibition of biphenyl metabolism on microorganisms.

YANG Xiu-qing*, LIU Ya-ni

(Instiute of Biotechnology, Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)., 2019,39(9)：3941~3950

The biphenyl/polychlorinated biphenyl degrading strain R04 (sp. R04) and several model microorganisms were used as the research objects. Cell division and morphological changes of biphenyl/polychlorinated biphenyl degrading strain R04 were analyzed by high performance liquid chromatography, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy under the conditions of biphenyl and its metabolites culture. The results showed that the division ofsp. R04 and several model microbial cells were inhibited under biphenyl and its metabolites culture conditions, and some microbial cells morphology were affected. Compared with the precursor-biphenyl and its metabolite 2-hydroxy-6-keto-6-phenyl-2, 4-hexadienoic acid, 2,3-dihydroxybenzene has stronger inhibition and morphological change on G+, G-bacteria orcell division. The proportion of.R04 cells and defective.R04 cells forming incomplete septum was increased under the condition of 2,3-dihydroxybenzene culture. It caused that 96.4% ofBL21 cells surface was dented, cytoplasmic content was lost and bacterial body volume was shrunk. It caused that 89.6% ofcells was shrunk significantly. The phenomenon thathas almost no cells to form a complete septum was caused. The percentage ofcells that could germinate and reproduce was decreased from 64.2% to 19.3%, but there was no significant change in cell morphology. Biphenyl metabolite 2,3-dihydroxybiphenyl has strongly inhibitory effect on cell division and proliferation ofsp. R04 and other microorganisms than its precursor-biphenyl, and it is suggested that the toxic effect of environmental compounds metabolism should be considered when the interaction between environmental compounds and microorganisms.

biphenyl metabolism；sp. R04；cell division；environmental compounds

X703.5

A

1000-6923(2019)09-3941-10

楊秀清(1975-),男,山西代縣人,副教授,博士,主要從事微生物生物轉(zhuǎn)化與生物催化研究.發(fā)表論文50余篇.

2019-02-21

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014011030-3);山西省煤層氣聯(lián)合研究基金資助項(xiàng)目(2015012002);山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(MQ2014-03)

* 責(zé)任作者, 副教授, xiuqyang@sxu.edu.cn