鄭梅 梁廣忠 趙曉萌 孫雅娜 趙穎 楊振河

摘要：目的? 探討倒置顯微鏡下觀察狗腎上皮細(xì)胞（MDCK）分離流感病毒狀態(tài)變化，為科學(xué)防控流感提供技術(shù)支持。方法? 選取天津市津南區(qū)疾病預(yù)防控制中心流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室于2018年10月11日～20日流感病毒檢測(cè)陽(yáng)性的咽拭子樣本20例，接種到MDCK傳代細(xì)胞中，于接種后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，包括細(xì)胞腫脹、間隙增大、核固縮或破裂、細(xì)胞部分或全部脫落，用血凝實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定MDCK細(xì)胞不同分離狀態(tài)下的流感病毒滴度狀況。結(jié)果? 倒置顯微鏡可以觀察到MDCK細(xì)胞分離流感病毒狀態(tài)的變化，陰性對(duì)照與未出現(xiàn)倒置顯微鏡鏡下病變的MDCK細(xì)胞不能使人“O”型紅細(xì)胞凝集;出現(xiàn)病變的MDCK細(xì)胞可以使人“O”型紅細(xì)胞凝集，產(chǎn)生HA滴度。結(jié)論? 倒置顯微鏡在觀察MDCK細(xì)胞分離流感病毒過(guò)程中起到重要作用，可提前判斷病毒的滴度與活力，為科學(xué)防控流感提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：倒置顯微鏡;流感病毒;MDCK細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R373.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.055

文章編號(hào)：1006-1959（2019）16-0163-02

Abstract：Objective? To investigate the changes of influenza virus status in dog kidney epithelial cells （MDCK） under inverted microscope and provide technical support for scientific prevention and control of influenza. Methods? 20 cases of swallow swab samples with positive influenza virus detection were selected from the influenza network laboratory of Tianjin Jinnan District Center for Disease Control and Prevention from October 11 to 20， 2018. They were inoculated into MDCK passage cells and observed under inverted microscope after inoculation. Cell morphology changes， including cell swelling， gap enlargement， nuclear pyknosis or rupture， partial or total detachment of cells， blood clotting experiments were used to determine the influenza virus titer status of MDCK cells under different separation conditions. Results? Inverted microscope can observe the changes of MDCK cells in the state of influenza virus isolation. Negative control and MDCK cells without inverted microscopic lesions cannot agglutinate human "O" type red blood cells; MDCK cells with lesions can make human "O" type Red blood cells aggregate to produce HA titers. Conclusion? Inverted microscope plays an important role in the observation of MDCK cells in the isolation of influenza virus. It can judge the titer and vitality of virus in advance and provide technical support for scientific prevention and control of influenza.

Key words：Inverted microscope;Influenza virus;MDCK cells

流行性感冒（influenza），簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有高度傳染性，可在人群中引起流行，是第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)測(cè)的傳染性疾病，多次引起世界性大流行[1]。主要傳染源為流感患者和隱性感染者，飛沫傳播為主要傳播途徑。其臨床表現(xiàn)為急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。流感不僅會(huì)引起呼吸系統(tǒng)的損害，不及時(shí)治療還可累及心血管、神經(jīng)等系統(tǒng)。目前流感監(jiān)測(cè)主要以狗腎上皮細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney cell，MDCK）分離培養(yǎng)為主，是流感病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。流感病毒MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)的質(zhì)量直接關(guān)系到流感監(jiān)測(cè)效果，能否高效的分離流感病毒是流感監(jiān)測(cè)的工作重點(diǎn)，也是流感病毒進(jìn)行抗原分析和耐藥分析的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[3]。流感病毒MDCK細(xì)胞的分離狀態(tài)觀察主要依賴于倒置顯微鏡。本研究主要通過(guò)使用倒置顯微鏡觀察流感病毒在MDCK細(xì)胞上的分離狀態(tài)變化，為科學(xué)防控流感提供技術(shù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器? 倒置顯微鏡，品牌型號(hào)為Nikon Eclipse TS100。

1.1.2試劑? DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% EDTA胰酶、HEPES、青鏈霉素、TPCK胰酶、人“O”型紅細(xì)胞。

1.1.3細(xì)胞培養(yǎng)液成分? DMEM培養(yǎng)基，8.5%胎牛血清，青霉素、鏈霉素、HEPES終濃度分別為100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L，用 NaHCO3將pH值調(diào)整為7.0左右。

1.1.4流感病毒? 由天津市津南區(qū)疾病預(yù)防控制中心流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室2018年10月11日～20日接收的流感樣病例咽拭子樣本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的咽拭子樣本20例。

1.2方法? MDCK細(xì)胞瓶制備22瓶MDCK傳代細(xì)胞備用。將流感病毒液接種MDCK細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置于35℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)吸附2 h，吸去病毒液，用DMEM維持液洗一遍，每瓶加入5 ml DMEM維持液，置于35℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。維持液成份：MDEM培養(yǎng)基，青霉素、鏈霉素、HEPES、TPCK胰酶終濃度分別為100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L、2 μg/ml，用 NaHCO3將pH值調(diào)整為7.2左右。

1.3觀察指標(biāo)? 倒置顯微鏡下觀察MDCK細(xì)胞分離流感病毒狀態(tài)變化，分別取陰性對(duì)照、未出現(xiàn)病變的和病變出現(xiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒的血凝素抗原（HA）滴度。

2結(jié)果

2.1 MDCK細(xì)胞分離流感病毒狀態(tài)變化? 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，陰性對(duì)照（圖1）生長(zhǎng)成片的MDCK細(xì)胞，成多邊型;接種流感病毒但未出現(xiàn)病變的MDCK細(xì)胞（圖2）生長(zhǎng)狀態(tài)與陰性對(duì)照類似;接種流感病毒出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變的MDCK細(xì)胞：細(xì)胞圓縮成圓形，折光性增強(qiáng)、細(xì)胞核固縮、碎片增多，直至成片脫落，僅存少量細(xì)胞生長(zhǎng)于瓶底。病毒接種時(shí)間不同則細(xì)胞病變的程度不同。

2.2血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果? 陰性對(duì)照與未出現(xiàn)倒置顯微鏡鏡下病變的MDCK細(xì)胞不能使人“O”型紅細(xì)胞凝集;出現(xiàn)病變的MDCK細(xì)胞可以使人“O”型紅細(xì)胞凝集，產(chǎn)生HA滴度。

3討論

倒置顯微鏡能夠供高?？蒲袑?shí)驗(yàn)、醫(yī)療衛(wèi)生單位等部門使用，可以用于細(xì)胞、微生物、細(xì)菌、組織培養(yǎng)、沉淀物、懸浮體等的觀察，能夠連續(xù)觀察并拍攝記錄細(xì)菌等生物在培養(yǎng)液中繁殖分裂的過(guò)程，在免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳工程學(xué)、腫瘤學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)、工業(yè) 微生物學(xué)、植物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮十分重要的作用[4]。

流感病毒最外層是HA，能與人、豚鼠、鳥(niǎo)等動(dòng)物紅細(xì)胞表面的受體相結(jié)合引起凝血[5]，可以通過(guò)血凝實(shí)驗(yàn)判斷培養(yǎng)物中是否存在流感病毒，HA滴度與流感病毒的多少呈正相關(guān)。流感病毒主要用MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)，為溶細(xì)胞型病毒，在感染細(xì)胞后，細(xì)胞開(kāi)始凋亡，凋亡的細(xì)胞會(huì)從吸附的表面掉落，MDCK細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，大量的流感病毒釋放到培養(yǎng)上清液中，造成在血凝實(shí)驗(yàn)中測(cè)得到培養(yǎng)物上清液的良好HA滴度。HA滴度可以反映出病毒的毒力，而毒力決定其侵襲正常細(xì)胞的能力，病毒的毒力可以反映出病毒的復(fù)制能力。而流感病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡過(guò)程可以使用倒置顯微鏡觀察，根據(jù)鏡下的狀態(tài)可以預(yù)先判斷細(xì)胞分離流感病毒的狀況。

本研究通過(guò)使用倒置顯微鏡對(duì)MDCK傳代細(xì)胞進(jìn)行流感病毒接種觀察細(xì)胞狀態(tài)變化，可以驗(yàn)證MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒分離較敏感，分離過(guò)程細(xì)胞的狀態(tài)可使用倒置顯微鏡觀察，包括細(xì)胞腫脹、間隙增大、核固縮或破裂、細(xì)胞部分或全部脫落。本研究中觀察到的細(xì)胞凋亡狀況與血凝實(shí)驗(yàn)滴度結(jié)果相吻合，陰性對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)出流感病毒滴度，細(xì)胞脫落的程度與流感病毒血凝滴度的檢出成正比。

綜上所述，倒置顯微鏡在觀察MDCK細(xì)胞分離流感病毒過(guò)程中起到重要作用，可提前判斷病毒的滴度與活力，為科學(xué)防控流感提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

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[2]董曉春，李琳，徐文體，等.流感病毒MDCK細(xì)胞分離陽(yáng)性率的影響因素分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（11）：1582-1583，1587.

[3]馬萍，李欣玥.流感病毒在狗腎上皮細(xì)胞上的最優(yōu)培養(yǎng)條件[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（23）：4326-4331.

[4]崔志英.倒置顯微鏡技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)[J].科技傳播，2016，8（13）：148-149.

[5]許沙沙，田鵬，曹開(kāi)源.甲型流感病毒的研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2015，15（10）：1450-1452，1455.

收稿日期：2019-3-6;修回日期：2019-3-26

編輯/杜帆