陳佳麗，楊勝濤，蕭振邦，千忠吉,3

羅非魚魚皮肽的體外ACE抑制活性、消化性及分子對(duì)接對(duì)比

陳佳麗1，楊勝濤1，蕭振邦2，千忠吉2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

【】分析羅非魚魚皮多肽LSGYGP的ACE抑制活性、胃腸道消化穩(wěn)定性以及與降壓藥卡托普利在分子對(duì)接的對(duì)比。用HHL法測(cè)定多肽的IC50值和抑制模式，測(cè)定多肽在模擬胃腸道消化中的穩(wěn)定性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Western blot法檢測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等蛋白表達(dá)情況，將多肽、卡托普利分別與ACE進(jìn)行分子對(duì)接對(duì)比分析。LSGYGP的半抑制率（IC50）值為2.57 μmol/L，表現(xiàn)為混合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，4 h內(nèi)模擬胃腸道消化較為穩(wěn)定；MTT法驗(yàn)證多肽LSGYGP對(duì)HUVEC細(xì)胞無毒性作用（> 0.05），且能明顯提高Ang II誘導(dǎo)組的HUVEC細(xì)胞活力（< 0.01）；與對(duì)照組相比，隨實(shí)驗(yàn)組多肽濃度增加，iNOS、COX-2和ET-1的表達(dá)明顯逐漸減少（< 0.001）。對(duì)接結(jié)果表明，氫鍵是LSGYGP與ACE結(jié)合結(jié)構(gòu)中的支撐力，而卡托普利通常與ACE的Zn2+離子形成緊密結(jié)合的相互作用。消化穩(wěn)定的羅非魚魚皮多肽可明顯抑制血管收縮因子和炎癥因子的表達(dá)，展現(xiàn)了較好ACE抑制活性，LSGYGP與卡托普利的活性差異可能是由于ACE分子對(duì)接的作用力不同，這些可作為研發(fā)少副作用ACE抑制劑的藥理基礎(chǔ)。

羅非魚魚皮多肽；HUVEC；模擬胃腸道消化；分子對(duì)接

高血壓作為導(dǎo)致高死亡的心血管疾病之一，它會(huì)影響動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞以及其他心血管疾病的發(fā)病率及發(fā)病過程，從而影響患者的行為能力和生活質(zhì)量[1]。原發(fā)性高血壓作為病因尚未明確的一類高血壓，有研究發(fā)現(xiàn)它可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制相關(guān)[2]，目前一些公認(rèn)療效較好的抗高血壓藥物被發(fā)現(xiàn)存在抗氧化和抗炎活性[3]。如今，高血壓最常見的治療方式是ACE抑制劑，它已成為主要靶點(diǎn)[4]。以卡托普利為代表的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）是市面上常用的降壓藥，降壓效果顯著，對(duì)血脂和血糖的代謝沒有影響，但卻有咽癢干咳、心悸、腎損害等不良反應(yīng)[5]，因此從其他來源尋找天然少副作用的藥物替代品是現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。

在我國羅非魚（）產(chǎn)量逐年增加，但在羅非魚片加工過程中存在大量的廢物，魚骨和皮膚中約有80％的蛋白質(zhì)未得到充分利用[6]。特別是羅非魚的鱗片和皮膚中的明膠和膠原蛋白，它可以水解成優(yōu)良的生物活性肽和營養(yǎng)食物資源。生物活性肽（2~50個(gè)氨基酸殘基）已逐漸成為重要的食藥資源，文獻(xiàn)報(bào)道羅非魚魚骨和皮膚中的2種蛋白質(zhì)可能是抗高血壓肽的前體[7]，且羅非魚肽具有抗氧化[8]、抗高血壓[9]、抗光老化[10]等活性。羅非魚魚皮明膠多肽Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Pro（LSGYGP）在之前研究[10]中已被分離純化，其分子質(zhì)量為592.26 u，但其降壓活性和機(jī)理尚未見報(bào)道。因此，本研究通過HHL法測(cè)定ACE抑制率、Western blot法檢測(cè)相關(guān)血管收縮因子表達(dá)情況，分析LSGYGP的ACE抑制活性，并對(duì)多肽進(jìn)行模擬胃腸道消化研究，將多肽與降壓藥卡托普利進(jìn)行分子對(duì)接對(duì)比，以期為新型降壓藥物的設(shè)計(jì)、合成與發(fā)展提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為開發(fā)高附加值羅非魚產(chǎn)品開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與細(xì)胞株 人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE，EC 3.4.15.1）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）、卡托普利、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于美國Sigma公司；胃蛋白酶（源于豬胃）、α-胰凝乳蛋白酶（源于豬胰臟）購于上海阿拉丁有限公司。羅非魚魚皮多肽LSGYGP由丹港生物科技公司合成，其純度為98%，保存溫度≤-20 ℃。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購于美國Hyclone公司；胎牛血清FBS購于美國Gibco公司。BCA蛋白試劑盒、預(yù)染蛋白marker購于上海Thermo Scientific有限公司；細(xì)胞裂解液、PMSF、5X蛋白上樣緩沖液等購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗鼠源iNOS、COX-2、ET-1、二抗羊抗鼠IgG購于Santa Cruz生物技術(shù)公司；0.22 μm硝酸纖維素膜NC膜和ECL化學(xué)發(fā)光液購于GE Amersham公司。

1.1.2 儀器和設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；超凈工作臺(tái)，蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司；倒置顯微鏡，廣州吉迪有限公司；酶標(biāo)儀，Bioteck儀器公司；小型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽，Bio-Rad公司；搖床，SCILOGEX公司；金屬浴，上海一恒公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HHL法測(cè)定ACE抑制率 ACE抑制率的測(cè)定使用修改后的Cushman等[11]方法。將各種濃度的LSGYGP溶液（0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 μmol/L，各50 μL）和ACE溶液（25×10-3U/mL，50 μL）在37 ℃下水浴10 min，然后加入150 μL 25 mmol/L HHL底物在37 ℃下水浴反應(yīng)1 h，加入250 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。用500 μL乙酸乙酯震蕩提取生成的馬尿酸，以3 000 r/min條件離心10 min，將200 μL上清液置于110 ℃的干燥烘箱中直至溶液完全蒸發(fā)。將殘余物溶解在1 mL蒸餾水中，并使用酶標(biāo)儀在228 nm下測(cè)量其UV光譜密度。ACE抑制率（％）通過以下等式計(jì)算：

ACE抑制率=（C-）/（C-B）×100%，

其中，C是無樣品的光密度，是ACE和樣品存在時(shí)的光密度，B是空白（在HHL之前加入鹽酸以提前終止反應(yīng)）的光密度。

1.2.2 ACE抑制模式的測(cè)定 根據(jù)Bush等[12]的方法稍作修改，將不同濃度（0.25、0.50、1.00、2.50和5.00 μmol/L）的LSGYGP添加到混合物中測(cè)量抑制率，用GraphPad Prism 5.0軟件制作Lineweaver-Burk圖[13]，從而分析LSGYGP的抑制模式。

1.2.3 模擬胃腸道消化 根據(jù)前人方法[14]，將酶與底物質(zhì)量比為1∶100的胃蛋白酶加入到含有20 mg/mL的羅非魚魚皮多肽的緩沖溶液中（pH 2.00）?；旌虾笤?7 ℃下振蕩孵育2 h，用飽和NaHCO3溶液將pH值調(diào)節(jié)至5.30，加入α-胰凝乳蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比1∶100），用1 mol/L NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.00，混合后再次在37 ℃下振蕩孵育2 h。最后，將肽消化液在沸水中加熱10 min致酶失活。收集肽消化溶液用于進(jìn)一步測(cè)定蛋白質(zhì)水平，按照BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒的說明進(jìn)行操作。水解度DH（％）通過以下等式計(jì)算：

DH =[1 -（C-）/C]×100％，

其中，C是未加酶的消化液光密度值，是肽和酶存在下消化液的光密度值。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HUVEC細(xì)胞放在體積分?jǐn)?shù)10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM中于37 ℃、CO2氣體百分比為5%的空氣環(huán)境中培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞設(shè)置空白組（B：細(xì)胞+培養(yǎng)基）、對(duì)照組（C：細(xì)胞+培養(yǎng)基+ 1 μmol/L Ang II）、實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+ 1 μmol/L Ang II+不同濃度LSGYGP）。

1.2.5 MTT法檢測(cè)樣品毒性 通過MTT法測(cè)定評(píng)估細(xì)胞毒性，HUVEC細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1×104/孔接種于96孔板中貼壁后，加入1、2、5、10 μL的1 mmol/L LSGYGP（使其在100 μL培養(yǎng)基中的終濃度為10、20、50、100 μmol/L）孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL 1 mg/mL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h。小心吸取MTT溶液，然后再向每孔加入100 μL DMSO溶液（純度 > 99.50%），搖床上避光搖晃10 min以充分溶解生成的甲瓚晶體，使用酶標(biāo)儀測(cè)定（540 nm）。

1.2.6 LSGYGP對(duì)Ang II誘導(dǎo)HUVEC的保護(hù)作用 通過MTT法測(cè)定評(píng)估細(xì)胞毒性，HUVEC細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)1×104/孔接種于96孔板中貼壁后，加入1、2、5、10 μL的1 mmol/L LSGYGP（使其在100 μL培養(yǎng)基中的終濃度為10、20、50、100 μmol/L）預(yù)處理1 h，后加入1 μL 1 mmol/L Ang II孵育24 h[15]。棄去培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL 1 mg/mL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h。吸取MTT溶液，向每孔加入100 μL DMSO溶液（純度 > 99.50%），搖床上避光搖晃10 min以充分溶解生成的甲瓚晶體，使用酶標(biāo)儀測(cè)定（540 nm）。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 調(diào)整六孔板中HUVEC細(xì)胞密度為5×106個(gè)/孔，細(xì)胞分組處理同上。24 h后，棄培養(yǎng)液，用50~100 μL RIPA細(xì)胞裂解液（內(nèi)含10 mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF）于離心管中裂解刮下來的細(xì)胞，充分吹打細(xì)胞，移取上清液。檢測(cè)蛋白濃度后，分別用不同體積分?jǐn)?shù)的SDS-PAGE凝膠分離蛋白（體積分?jǐn)?shù)8%的膠分離130 ku的iNOS；體積分?jǐn)?shù)10%的膠分離72 ku的COX-2、42 ku的β-actin和24 ku的ET-1），根據(jù)所測(cè)的蛋白濃度調(diào)整蛋白上樣量為20~40 μg，加入上樣緩沖液95 ℃加熱10 min使得蛋白變性。上樣后調(diào)節(jié)電壓為80 V電泳20 min，后調(diào)節(jié)電壓120 V電泳80 min。采用濕轉(zhuǎn)法電流恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。將NC膜轉(zhuǎn)移至孵育盒，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉，室溫封閉2 h，用TBST溶液洗滌NC膜3次，每次10 min，按照1∶1000比例稀釋一抗，過夜孵育。吸棄一抗，再洗3次，按照1∶5000比例稀釋二抗。吸棄二抗，用TBST溶液洗膜3次。將ECL化學(xué)發(fā)光液試劑盒中的A、B液按1：1均勻混合，用Tanon化學(xué)發(fā)光工作站進(jìn)行拍照。

1.2.8 分子對(duì)接模擬 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http:// www.rcsb.org）下載ACE的天然晶體結(jié)構(gòu)（PDB代碼：1O8A）和卡托普利（PDB代碼：1UZF）的晶體復(fù)合結(jié)構(gòu)。用Discovery Studio 3.5 模塊CDOCKER將配體分子與受體活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。首先采用高溫動(dòng)力學(xué)方法隨機(jī)搜索小分子構(gòu)象，然后通過模擬退火方法優(yōu)化受體活性位點(diǎn)區(qū)域的各構(gòu)象，使對(duì)接結(jié)果更加準(zhǔn)確；導(dǎo)入多肽模型，并進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化（加氫，加CHAEMm力場(chǎng)和Momany-Rone電荷，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化）；對(duì)受體1O8A進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化（加氫，加CHAEMm力場(chǎng)和Momany-Rone電荷，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化），通過軟件識(shí)別活性中心并進(jìn)行定義；進(jìn)行CDOCKER對(duì)接研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行實(shí)驗(yàn)3次。數(shù)據(jù)處理分析和作圖使用Graphpad Grism 5.0、Image J軟件，測(cè)定結(jié)果以平均值 ± SD表示，顯著性使用ANOVA及t-test分析。#表示與空白組比較，< 0.001；與對(duì)照組比較，*表示< 0.05，**表示< 0.01，***表示< 0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE抑制活性及IC50值

圖1中由HHL實(shí)驗(yàn)可以得知，LSGYGP的ACE抑制率隨其濃度的增加呈劑量依賴性趨勢(shì)，且IC50值經(jīng)過計(jì)算為2.57 μmol/L。

2.2 ACE抑制模式

由圖2可以看出，三條直線的交點(diǎn)既不在軸也不在軸上，隨著LSGYGP的濃度增加，m（軸截距的倒數(shù)）增加而最大反應(yīng)速率降低。這表示LSGYGP屬于混合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模式，且與Heo等[16]研究一致。

2.3 不同時(shí)間下LSGYGP胃腸道消化結(jié)果

圖3表明在4 h的胃腸道消化過程中，隨著時(shí)間增加經(jīng)過胃酶和胰酶處理，樣品肽的水解度整體增高但不高于25%。這說明LSGYGP在4 h的胃腸道消化中較為穩(wěn)定，具有良好的消化穩(wěn)定性。

圖1 LSGYGP的ACE抑制率及IC50值

圖2 雙倒數(shù)曲線圖分析LSGYGP的ACE抑制模式

圖3 不同時(shí)間處理對(duì)LSGYGP消化的影響

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，不同濃度處理組的LSGYGP對(duì)HUVEC細(xì)胞活力無明顯影響（> 0.05），說明羅非魚魚皮多肽LSGYGP在10~100 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)HUVEC細(xì)胞無毒性作用，可選擇該范圍的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同濃度LSGYGP對(duì)HUVEC細(xì)胞相對(duì)活力的影響

2.5 LSGYGP對(duì)Ang II誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用

圖5所示，與空白組相比，Ang II的刺激明顯降低細(xì)胞活力（< 0.001），20 μmol/L LSGYGP的加入可明顯提升細(xì)胞活力（< 0.05），50 μmol/L以上的LSGYGP可使細(xì)胞相對(duì)活力顯著提高（< 0.01）且呈濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在10~100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，羅非魚魚皮多肽對(duì)Ang II誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞表現(xiàn)了明顯保護(hù)作用。

#表示與空白組比較，P < 0.001；與對(duì)照組比較，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01

2.6 LSGYGP對(duì)Ang II誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞血管收縮因子的表達(dá)情況

由圖6、7可知，分析各組條帶灰度，與空白組相比，Ang II的刺激明顯增加了iNOS、COX-2和ET-1的表達(dá)，隨著10、50、100 μmol/L LSGYGP濃度處理，其表達(dá)顯著性下調(diào)（< 0.001）。

圖6 Ang II誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞iNOS、COX-2、ET-1的表達(dá)

#表示與空白組比較，P < 0.001；與對(duì)照組比較，***表示P < 0.001

2.7 LSGYGP卡托普利的分子對(duì)接對(duì)比

圖8（上）所示關(guān)于ACE-LSGYGP對(duì)接的CDOCKER結(jié)果結(jié)合能為-90.50 kcal/mol。如圖9（上）所示，LSGYGP與Asn66、Glu143、Tyr523和Gln281產(chǎn)生4個(gè)氫鍵，鍵長為2.75×10-10m、2.15×10-10m、2.37×10-10m和2.69×10-10m。圖8（上）中卡托普利與ACE顯示出結(jié)合能值為-31.09 kcal/mol，如圖9（下）所示，卡托普利與Arg522、Arg522和His387產(chǎn)生3個(gè)氫鍵，鍵長為6.23×10-10m、6.24×10-10m和6.04×10-10m。

上：LSGYGP，下：卡托普利

Top: LSGYGP; Bottom: Captopril

圖8 LSGYGP和卡托普利與ACE對(duì)接

Fig. 8 The interaction poses after automated docking with ACE active site

上：LSGYGP，下：卡托普利

Top: LSGYGP; Bottom: Captopril.

圖9 配體與ACE作用的2維圖

Fig. 9 Bi-dimensional（2D）diagrams between ligand and ACE amino acid residues

3 討論

血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶（ACE）作為心血管系統(tǒng)中的一種重要轉(zhuǎn)換酶，可通過去除血管緊張素I羧基末端二肽His-Leu分解為血管緊張素II（Ang II），以控制強(qiáng)血管收縮因子Ang II的生成[17]。而Ang II作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的關(guān)鍵活性肽，可導(dǎo)致血管外周阻力增加，同時(shí)使具有血管舒張作用的緩激肽失活，使血管壓力升高，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)羅非魚魚皮肽LSGYGP（IC50= 2.57 μmol/L）顯示出較好的ACE抑制作用，且Lineweaver-Burk圖中發(fā)現(xiàn)其屬于混合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Mantaka等[19]在羅非魚魚皮水解物中發(fā)現(xiàn)IC50為760 μmol/L的ACE肽，Tidarat等[20]在羅非魚魚皮水解物中發(fā)現(xiàn)IC50為0.12 μmol/L的ACE肽（MILLLFR），Zhang等[21]在羅非魚魚皮明膠中發(fā)現(xiàn)IC50分別為4.61 μg/mL、6.45 μg/mL的ACE肽Glu-Gly-Leu（317.33 u）、Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr（645.21 u）。有文獻(xiàn)總結(jié)海洋魚類中的ACE 抑制肽N 端大多含有疏水性氨基酸（如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）或堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸、組氨酸）[22]，研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)低分子量且含有疏水性氨基酸的肽顯現(xiàn)了較好ACE活性，而競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑卡托普利的IC50為9.48 nmol/L[23]，這可能與化學(xué)結(jié)構(gòu)和測(cè)量方法的不同有關(guān)，更有必要探討ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系。

Ang II可以通過血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)來誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，并且誘導(dǎo)產(chǎn)生另一種與Ang II類似的血管收縮因子ET-1，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[24]。而這些因子又可以促進(jìn)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮炎癥損傷、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化[25]。本研究結(jié)果中iNOS、COX-2、ET-1經(jīng)過LSGYGP處理后降低了由Ang II誘導(dǎo)的高表達(dá)，證實(shí)了這一點(diǎn)。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)中卡托普利的半衰期為2~3 h[26]，胃腸道消化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LSGYGP在4 h模擬胃腸道消化中較為穩(wěn)定，這進(jìn)一步表明LSGYGP與卡托普利一樣可經(jīng)歷至少2 h以上的人體消化。

研究發(fā)現(xiàn)具有疏水性氨基酸的ACEIP比親水性更具有活性優(yōu)勢(shì)[27]。LSGYGP通過多個(gè)氫鍵與ACE較為穩(wěn)定地對(duì)接，其疏水性氨基酸（Leu和Pro）可能是表現(xiàn)ACE抑制活性的原因，這與Kobayashi之前的研究理論一致[28]。S1、S2和S1′是ACE中的主要活性位點(diǎn)[29]，它們具有不同的殘基：S1口袋（Ala354、Glu384和Tyr523殘基），S2口袋（Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520殘基），S1′（Glu162）[30]。ACE活性位點(diǎn)的四個(gè)殘基（S1口袋的Asn66、Glu143、Tyr523和S2口袋中的Glu281）[31]極大地促進(jìn)了ACE與LSGYGP的相互作用。而卡托普利的硫醇基團(tuán)在酶的活性位點(diǎn)與催化Zn2+離子形成Pi-硫相互作用，從而呈現(xiàn)出ACE抑制作用。LSGYGP表現(xiàn)出有效的ACE抑制作用，其疏水性氨基酸（Leu和Pro）與ACE產(chǎn)生的氫鍵與卡托普利通過Zn2+形成Pi-硫相互作用來抑制ACE略有不同，可能是兩者活性和抑制模式差異的原因，同時(shí)這也是未來研發(fā)該ACE抑制肽同時(shí)避免傳統(tǒng)降壓藥干咳等副作用的關(guān)鍵點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究證明魚皮明膠多肽LSGYGP以混合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制展示較好的ACE抑制作用，體外實(shí)驗(yàn)中LSGYGP可降低血管收縮因子和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，分子對(duì)接表明氫鍵是LSGYGP與ACE結(jié)合的結(jié)構(gòu)中的支撐力，而卡托普利通常與催化的Zn2+離子形成緊密結(jié)合的相互作用。在羅非魚高值化利用背景下，這些結(jié)果有助于結(jié)合或設(shè)計(jì)新靶向的ACE抑制劑，可被用于新一代的抗高血壓藥物。

[1] 國家衛(wèi)生計(jì)生委合理用藥專家委員會(huì). 高血壓合理用藥指南(第2版)[J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志: 電子版, 2017, 9(7): 28-126.

[2] MONTEZANO A C, AURELIE N D C, RIOS F J, et al. Angiotensin II and Vascular Injury[J]. Current Hypertension Reports, 2014, 16(6): 431.

[3] SITI H N, KAMISAH Y, KAMSIAH J. The role of oxidative stress, antioxidants and vascular inflammation in cardiovascular disease (a review)[J]. Vascular Pharmacology, 2015, 71: 40-56.

[4] FRAGASSO G, MARANTA F, MONTANARO C, et al. Pathophysiologic therapeutic targets in hypertension: a cardiological point of view[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 2012, 16(2): 179-193.

[5] FITZGERALD R J, MURRAY B A, WALSH D J. Hypotensive peptides from milk proteins[J]. Journal of Nutrition, 2004, 34(4): 980S.

[6] HUANG B B, LIN H C, CHANG Y W. Analysis of proteins and potential bioactive peptides from tilapia (spp.) processing co-products using proteomic techniques coupled with BIOPEP database[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 19: 629-640.

[7] ZHUANG Y L, HOU H, ZHAO X, et al. Effects of collagen and collagen hydrolysate from jellyfish () on mice skin photoaging induced by UV irradiation[J]. Journal of Food Science, 2010, 74(6): H183-H188.

[8] CHAROENPHUM N, YOURAVONG W, CHEIRSILP B. Determination of reaction kinetics of hydrolysis of tilapia ()protein for manipulating production of bioactive peptides with antioxidant activity, angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity and Ca-binding properties[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(2): 419-428.

[9] LEE J K, JEON J K, BYUN H G. Antihypertensive effect of novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from chum salmon () skin in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Functional Foods, 2014, 7: 381-389.

[10] SUN L, ZHANG Y, ZHUANG Y L. Antiphotoaging effect and purification of an antioxidant peptide from tilapia () gelatin peptides[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(1): 154-162.

[11] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting engyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[12] BUSH K, HENRY P R, SLUSARCHYK D S. Muraceins-muramyl peptides produced by Nocardia orientalis as angiotensin-converting enzyme inhibitors. I. Taxonomy, fermentation and biological properties[J]. Journal of Antibiotics, 1984, 37(4): 330-335.

[13] 李麗, 施展, 錢春香. 酶動(dòng)力學(xué)模塊軟件求解米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 洛陽理工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2009, 19(4): 1-3.

[14] SAMARANAYAKA A G P, KITTS D D, LI-CHAN E C Y. Antioxidative and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory potential of a pacific hake () fish protein hydrolysate subjected to simulated gastrointestinal digestion and Caco-2 cell permeation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(3): 1535-1542.

[15] 劉國艷, 孫貝貝, 張潔, 等. AngⅡ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立高血壓損傷模型[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(13): 174-181.

[16] HEO S Y, KO S C, KIM C, et al. A heptameric peptide purified fromsp. gastrointestinal hydrolysate inhibits angiotensin I-converting enzyme and angiotensin II-induced vascular dysfunction in human endothelial cells[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2017, 39(3): 1072-1082.

[17] 李銳, 鄒茜, 孫玉林, 等. 克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產(chǎn)物中ACE抑制肽的分離純化與鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2018, 45(6): 139-146.

[18] MEHTA P K, GRIENDLING K K. Angiotensin II cell signaling: physiological and pathological effects in the cardiovascular system[J]. American Journal of Physiology-cell Physiology, 2007, 292(1): C82-C97.

[19] THUANTHONG M, DE G C, SIRINUPONG N, et al. Purification and characterization of angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides from Nile tilapia () skin gelatine produced by an enzymatic membrane reactor[J]. Journal of Functional Foods, 2017, 36: 243-254.

[20] TOOPCHAM T, ROYTRAKUL S, YONGSAWA- TDIGUL J. Characterization and identification of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from tilapia using Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 proteinases[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 14: 435-444.

[21] ZHANG Y, DUAN X, ZHUANG Y. Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia () skin gelatin[J]. Peptides, 2012, 38(1): 13-21.

[22] 操德群, 何艷麗, 余虹, 等. 海洋生物ACE抑制肽研究進(jìn)展[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2017,31(5): 927-937.

[23] CHEN J, WANG Y, YE R, et al. Comparison of analytical methods to assay inhibitors of angiotensin I-converting enzyme[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4):3329-3334.

[24] ITO H Y, HIRATA Y, ADACHI S, et al. Endothelin1 is an autocrine/paracrine factor in the mechanism of angiotensin II-induced hypertrophy in cultured rat cardiomyocytes[J]. Journal of Clinical Investigation, 1993, 92(1): 398-403.

[25] GRAGASIN, F. S. Estrogen reduces angiotensin ii-induced nitric oxide synthase and NAD(P)H oxidase expression in endothelial cells[J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2003, 23(1): 38-44.

[26] POPOVICI RF, ALEXA IF, NOVAC O, et al. Pharmacokinetics study on mesoporous silica-captopril[J]. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2011, 6(4): 1619-1630.

[27] MOSKOWITZ DW. Is ‘somatic’ angiotensin i-converting enzyme a mechanosensor?[J]. Diabetes Technology & Therapeutics, 2002, 4: 841-858.

[28] KOBAYASHI Y, YAMAUCHI T, KATSUDA T, et al. Angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory mechanism of tripeptides containing aromatic residues[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106(3): 310-312.

[29] WANG X, CHEN H, FU X, et al. A novel antioxidant and ACE inhibitory peptide from rice bran protein: Biochemical characterization and molecular docking study[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 75: 93-99.

[30] ROHIT A C R, SATHISHA K S, APARNA H S. A variant peptide of buffalo colostrum b-lactoglobulin inhibits angiotensin I-converting enzyme activity[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2012, 53: 211-219.

[31] WU Q, JIA J, YAN H, et al. A novel angiotensin-? converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from gastrointestinal protease hydrolysate of silkworm pupa (Bombyx mori) protein: Biochemical characterization and molecular docking study[J]. Peptides, 2015, 68: 17-24.

Study on in Vitro ACE Inhibitory Activity, Digestibility and Molecular Docking Comparison of Tilapia Fish Skin Peptide

CHEN Jia-li1, YANG Sheng-tao1, XIAO Zhen-bang2, QIAN Zhong-ji2,3

（1.,,524088; 2.,,524088; 3.,518108）

【】The ACE inhibitory activity of tilapia skin peptide LSGYGP, gastrointestinal digestive stability and molecular docking comparison with antihypertensive drug captopril were analyzed. 【】The IC50value and inhibition mode of peptide were determined by HHL stability, Stability of peptide in the simulated gastrointestinal digestion was measured. Cell viability was detected by MTT method, protein expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) and endothelin-1 (ET-1) were detected by western blot. Comparison of peptide and captopril with ACE in molecular docking was analyzed. 【】The IC50of LSGYGP was 2.57 μmol/L, which showed mixed non-competitive inhibition; Simulated gastrointestinal digestion was stable within 4 h; MTT assay indicated that the peptide LSGYGP had no toxic effect on HUVEC cells (> 0.05), and viability of HUVEC in Ang II-induced group was significantly increased (< 0.01). Compared with the control group, LSGYGP treatment could decreased the expression of iNOS, COX-2 and ET-1 in a dose-dependent manner (< 0.001). Docking results indicated that hydrogen bond is the supporting force in the binding structure of LSGYGP and ACE, while captopril usually forms a tight binding interaction with the Zn2+ion of ACE. 【】The digestive-stabilized tilapia fish skin peptide LSGYGP significantly inhibited the expression of vasoconstrictor and inflammatory factors, and exhibited a good ACE inhibitory activity. The difference in activity between LSGYGP and captopril might be due to the different forces of ACE molecular docking, which might provide the pharmacological basis to develop ACE inhibitors with fewer side effects.

Tilapia fish skin peptide; HUVEC; Gastrointestinal digestion; Captopril; Molecular docking

Q291; R544.1

A

1673-9159（2019）05-0107-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.015

2019-06-03

廣東省“揚(yáng)帆起航”緊缺人才引進(jìn)項(xiàng)目（201433009）；廣東海洋大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)?！笨蒲袉?dòng)基金項(xiàng)目（2013050204）

陳佳麗（1995－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品高值化加工與利用，E-mail：jiali1745@163.com

千忠吉（1978－），男，博士，副教授，研究方向?yàn)槟虾Ｉ锘钚晕镔|(zhì)的研究與利用，E-mail：zjqian78@163.com

陳佳麗，楊勝濤，蕭振邦，等. 羅非魚魚皮肽的體外ACE抑制活性、消化性及分子對(duì)接對(duì)比[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：107-114.

（責(zé)任編輯：劉朏）