吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，蔡雙虎，簡(jiǎn)紀(jì)常，湯菊芬

羅湖病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，蔡雙虎，簡(jiǎn)紀(jì)常，湯菊芬

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制廣東省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

【】建立一種快速、靈敏、特異的羅非魚（spp）羅湖病毒定量檢測(cè)方法。根據(jù)羅湖病毒節(jié)段8保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)羅湖病毒的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，并對(duì)該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.5×108～2.5×100拷貝數(shù)之間有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)2= 0.999），檢測(cè)限為2.5×100個(gè)拷貝。試驗(yàn)內(nèi)及試驗(yàn)間變異系數(shù)分別為0.11%～0.43%與0.54%～1.13%，重復(fù)性強(qiáng)；對(duì)水生動(dòng)物其他病毒和細(xì)菌均無擴(kuò)增反應(yīng)，有很好的特異性。新建立的羅湖病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)，可用于TiLV的早期的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控。

羅非魚；羅湖病毒；檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；標(biāo)準(zhǔn)曲線

尼羅羅非魚（）又稱白色三文魚，是全球重要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚種之一，有繁殖力強(qiáng)、生長速度快、產(chǎn)量高和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）推薦養(yǎng)殖魚種。近年來，以色列、厄瓜多爾、哥倫比亞、泰國和埃及等國及中國臺(tái)灣養(yǎng)殖和野生的羅非魚相繼暴發(fā)一種新病害[2-4]，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起國際上的廣泛關(guān)注。該病主要癥狀為病魚消瘦，體色發(fā)黑，眼球突出渾濁，體表充血、潰爛，腹部膨脹有積水。經(jīng)研究證實(shí)，導(dǎo)致以色列羅非魚大量死亡的病原體是一種新型RNA病毒[5]——羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV）。羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV）是一種新型的正黏病毒，由10個(gè)獨(dú)特的基因節(jié)段組成，最大的節(jié)段1包含1個(gè)開放閱讀框，與C型流感病毒PB1同源性較低，其他9個(gè)節(jié)段在GenBank中未發(fā)現(xiàn)與任何核酸、蛋白同源序列。最近研究發(fā)現(xiàn)，羅湖病毒還可感染與發(fā)病羅非魚同池的 施氏高體鲃（）[6]，對(duì)其他魚類同樣造成了嚴(yán)重威脅。因此，開展羅湖病毒的快速檢測(cè)和防控技術(shù)研究尤為重要和迫切。

迄今已有病毒分離細(xì)胞培養(yǎng)[7-8]、原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）[9-10]等多種檢測(cè)方法用于診斷TiLV。細(xì)胞培養(yǎng)和原位雜交操作過程復(fù)雜、耗時(shí)，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行測(cè)定，且結(jié)果不確定，常延誤病情的診斷；一步RT-PCR和巢式RT-PCR雖有較高的靈敏度和特異性，但檢測(cè)過程繁瑣且無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量的監(jiān)控檢測(cè)和樣品之間的比較，難以掌握病情的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)反應(yīng)過程一步完成，無需對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行后期處理，大大避免了后期污染和假陽性的發(fā)生，提高了檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性，已越來越多地應(yīng)用于水生動(dòng)物病原檢測(cè)[11-12]。本研究旨在建立一種可檢測(cè)TiLV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為TiLV的早期快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用吉富羅非魚購自茂名高州某養(yǎng)殖公司，羅湖病毒由本研究室保存。

主要試劑Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、pMD18-T 載體和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；RNA 提取試劑盒、One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒和大腸桿菌（）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Light Cycler 96）、梯度PCR儀（S1000）、核酸定量?jī)x（ND2000）均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)GenBank上已登錄的羅湖病毒節(jié)段8節(jié)段進(jìn)行比對(duì)分析，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物：正向引物TiLV-F，5′-ATTCGTCCCAGCCTTTCCTC-3′；反向引物TiLV-R，5′ -GATTTCACGCTCAACGGCAT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（下簡(jiǎn)稱“生工公司”）合成。

1.2.2 RNA的提取及cDNA一鏈的合成 按Trizol說明書提取病毒總RNA。通過凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，用核酸定量?jī)x檢測(cè)總RNA濃度和純度。用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒按照說明書合成cDNA一鏈，于-20℃保存待用。

1.2.3 DNA片段的克隆與標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以反轉(zhuǎn)的cDNA一鏈為模板和引物TiLV-F/TiLV-R擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件：94 ℃4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃下保存。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后，與pMD-18T連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，陽性克隆送至生工公司測(cè)序。將含有目的條帶、經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的陽性克隆大量培養(yǎng)后，用Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，并用核酸分析儀測(cè)定重組質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度。按照公式：質(zhì)粒濃度( 拷貝/μL) = 6.02×1023(拷貝/mol) × 質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL) / 質(zhì)粒分子數(shù)，換算出重組質(zhì)粒濃度，將含有TiLV目的片段的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中最佳退火溫度（生工公司設(shè)計(jì)合成上下游引物推薦平均值）和引物濃度（熒光定量酶推薦引物濃度），最終確定反應(yīng)體系為：2×One StepRT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，Ex TaqHS 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，模板及引物各1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94℃ 15 s，57 ℃15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，共9個(gè)濃度梯度，分別為2.5×108～2.5×100拷貝/μL，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。PCR結(jié)束后，利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括查看擴(kuò)增曲線和循環(huán)數(shù)。計(jì)算重組質(zhì)粒不同稀釋梯度與循環(huán)數(shù)的相關(guān)性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]，并建立回歸方程，用于定量分析。以每個(gè)濃度梯度重組質(zhì)粒平均循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，各濃度梯度質(zhì)粒模板濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)。

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（）、無乳鏈球菌（）、海豚鏈球菌（）、嗜水氣單胞菌（）、乳酸乳球菌（）、腫大細(xì)胞虹彩病毒和神經(jīng)壞死病毒（均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存）等多種菌毒株的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，用無菌ddH2O作為陰性對(duì)照，觀察結(jié)果確定引物特異性。

1.2.7 臨床樣品的檢測(cè) 取TiLV采用注射法回歸感染不同批次的吉富羅非魚（50 ~ 100 g，健康，28℃養(yǎng)殖），共采集魚3批次25尾，抽檢7尾，提取各組織總RNA和合成cDNA鏈，分別利用1.2.4中建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較分析結(jié)果。根據(jù)樣品循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增曲線綜合判定：無擴(kuò)增曲線的判為陰性樣品；循環(huán)數(shù)≤37.96，且擴(kuò)增曲線呈“S”型者判為陽性；循環(huán)數(shù)≤37.96，但擴(kuò)增曲線不規(guī)則或?yàn)槎钢毙本€者判為陰性；循環(huán)數(shù)> 37.96者為陰性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以TiLV cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得單一的203 bp目的條帶，與預(yù)期大小相同（圖1）。目的片段序列用Blast程序進(jìn)行同源性比較和相似性分析，結(jié)果顯示與TiLV泰國株（KU751821）節(jié)段8的同源率高達(dá)97.5%，擴(kuò)增產(chǎn)物確證為TiLV節(jié)段8的部分序列。

M. DL500 DNA 分子標(biāo)記；1. TILV 節(jié)段8部分序列

2.2 引物特異性

由圖2可知，經(jīng)qRT-PCR擴(kuò)增，僅以TiLV反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，而以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、乳酸乳球菌、腫大細(xì)胞虹彩病毒的DNA和神經(jīng)壞死病毒為對(duì)照模板時(shí)，出現(xiàn)不規(guī)則的折線形，而不是“S”型擴(kuò)增曲線。由圖3可知，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量熒光PCR，對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物作熔解曲線分析時(shí)，均只在熔解溫度（82.53±0.1）℃處有一個(gè)特異性吸收峰，無其他非特異性雜峰。表明所設(shè)計(jì)引物有良好的特異性。

曲線1為TiLV，其余分別為神經(jīng)壞死病毒、腫大細(xì)胞虹彩病毒、無乳鏈球菌、大腸桿菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳酸乳球菌DNA

圖3 TiLV節(jié)段8熔解曲線

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度

經(jīng)測(cè)定，提取的重組質(zhì)粒起始質(zhì)量濃度為80.64 ng/μL，經(jīng)換算，重組質(zhì)粒為2.5×1010拷貝/μL。以10倍系列稀釋后重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果如圖4所示，以2.5×108～2.5×100拷貝/μL 9 個(gè)濃度梯度質(zhì)粒作為模板得到的擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型，隨著模板量的減少，其對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)相應(yīng)增加，兩者之間具有良好的線性關(guān)系。

根據(jù)RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求擴(kuò)增效率應(yīng)處于90% ~ 110%之間，相關(guān)系數(shù)2等于0.999，符合RT-PCR要求，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法所允許的誤差范圍內(nèi)。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知，本研究開發(fā)的熒光定量檢測(cè)技術(shù)最低檢測(cè)限達(dá)2.5拷貝數(shù)，靈敏度較高。

從左到右依次（1 ~ 9）為重組質(zhì)?？截悢?shù)為2.5×108~ 2.5×100

圖5 定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 重復(fù)性

用6種濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)（CV）均< 2%（表1），表明該方法有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

應(yīng)用所建立的qRT-PCR檢測(cè)方法對(duì)25份已攻毒臨床病魚進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)的RT-PCR作對(duì)比。抽檢7尾魚PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖6、圖7）顯示，qRT-PCR法與常規(guī)RT-PCR均檢測(cè)到陽性樣品5條，qRT-PCR方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致。

表1 TiLV實(shí)時(shí)熒光定量批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

說明：= 3

M：DL2000 DNA分子標(biāo)記；1~7，取樣標(biāo)號(hào)

圖7 攻毒魚抽檢熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

3 討論

羅湖病毒自2009年首次在以色列發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)相繼在厄瓜多爾、哥倫比亞、泰國、埃及、我國臺(tái)灣地區(qū)、印度和馬來西亞等多個(gè)國家或地區(qū)得到確認(rèn)[14]，目前還有進(jìn)一步傳播到其他地區(qū)的趨勢(shì)，已經(jīng)成為危害國內(nèi)外羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要病原。目前，由于對(duì)羅湖病毒病尚無有效的防治措施，其發(fā)病癥狀與氣單胞菌感染癥狀相似，因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏的早期診斷對(duì)羅湖病毒病的預(yù)警預(yù)報(bào)與防控具有重要的意義。

與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)、原位雜交和RT-PCR檢測(cè)方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)和定量組織樣品中的病原體的優(yōu)勢(shì)，已被開發(fā)并驗(yàn)證用于檢測(cè)其他魚類病毒[15-16]，例如使用熒光定量PCR檢測(cè)含有淋巴囊腫病毒的無癥狀載體金頭鯛（）[17]和舌齒鱸（）[18]中神經(jīng)壞死病毒的組織分布和靶器官組織中的病毒復(fù)制。以前的研究顯示，標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR方法的檢測(cè)限為70 000個(gè)病毒拷貝，而更敏感的巢式RT-PCR在魚組織中檢測(cè)到低至7個(gè)拷貝[19]。本研究建立基于羅湖病毒節(jié)段8的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)對(duì)于檢測(cè)臨床樣品中的TiLV具有高度敏感性和特異性，最低檢測(cè)限可以檢測(cè)低至2.5拷貝/μL，其檢測(cè)靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍，與已報(bào)道的探針檢測(cè)靈敏度相當(dāng)[20]。

SYBR Green I是一種能結(jié)合到雙鏈DNA小溝部位并發(fā)出熒光的染料，在PCR反應(yīng)中任何的非特異性擴(kuò)增都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本意見所建立的用于檢測(cè)TiLV的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法呈現(xiàn)出良好的S型擴(kuò)增曲線，只出現(xiàn)特異擴(kuò)增產(chǎn)物的單峰，產(chǎn)物的m值均一，表明無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)；特異性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果只出現(xiàn)單一特異性條帶，與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、乳酸乳球菌和腫大細(xì)胞虹彩病毒均無交叉反應(yīng)，表明其具有良好的特異性。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，該方法起始模板濃度與循環(huán)數(shù)之間呈良好的線性關(guān)系，直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999（> 0.95），批內(nèi)和批間差異系數(shù)分別為0.11% ~ 0.43%和0.54% ~ 1.13%。這些數(shù)據(jù)與先前的熒光定量PCR方案在其他魚類病毒中的范圍相當(dāng)[21-22]，說明建立的反應(yīng)體系具有很高的精確度和良好的穩(wěn)定性。

本研究使用TiLV片段8的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，以TiLV部分基因序列建立檢測(cè)方法，為TiLV基因定量的有關(guān)研究提供參考，對(duì)早期羅湖病毒的快速檢測(cè)以及羅非魚羅湖病毒的預(yù)防及用藥治療提供技術(shù)支持。

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Development of Real-time Fluorescence Quantitative RT-PCR Detection Method for Tilapia Lake Virus

WU Feng-lei, HUANG Yu, HUANG Yu-cong, CAI Shuang-hu, JIAN Ji-chang, TANG Ju-fen

（,,524088,）

【】To establish a rapid, sensitive and specific quantitative detection method for Tilapia Lake Virus (TiLV).【】To design a pair of specific primers based on the conserved region of Lo Wu virus segment 8 and to establish SYBR Green I real-time quantitative RT-PCR for detection of TiLV. The specificity, sensitivity, and repeatability of the method were evaluated. 【】The standard curve had a good linear relationship between 2.5×108and 2.5×100copy number (correlation coefficient2= 0.999), and the detection limit was 2.5×100copy numbers. The intra- and inter-assay coefficients of variation were 0.11% - 0.43% and 0.54% - 1.13%, respectively. The repeatability was strong. There was no amplification reaction for other viruses and bacteria in aquatic animals, and it had good specificity. 【】The newly established real-time fluorescent quantitative PCR detection method of TiLV has good specificity, high sensitivity and high reproducibility, and can be used for early rapid diagnosis, epidemiological investigation, prevention and control of TiLV.

; Tilapia Lake Virus; detection; real-time fluorescence quantitative RT-PCR; standard curve

S943.125.41

A

1673-9159（2019）05-0031-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.005

2019-03-05

廣東省自然科學(xué)基金（2016A030313748）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0900501）

吳鳳雷（1994―），女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究。E-mail: 2352289350@qq.com

黃郁蔥，副教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制研究。E-mail: hyczjou@163.com

吳鳳雷，黃瑜，黃郁蔥，等. 羅湖病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：31-37.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）