陳慧黠，韓民泳，于佳豪，劉 琳

噬菌弧菌N1對(duì)淡水和海水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落影響PCR-DGGE分析

陳慧黠1，韓民泳1，于佳豪1，劉 琳2

（1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

【】研究噬菌弧菌sp. N1在一個(gè)投放周期內(nèi)對(duì)淡水和海水養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌、弧菌總數(shù)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。自市售微生態(tài)制劑分離蛭弧菌N1并進(jìn)行分子鑒定，測(cè)定其裂解效果，制備高濃度N1菌液分別投放至淡水紅鯉魚(yú)（red carp）和海水仿刺參（）養(yǎng)殖水體，采用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法及PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)分析48 h內(nèi)水體環(huán)境中細(xì)菌、弧菌總數(shù)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化。經(jīng)鑒定蛭弧菌N1為噬菌弧菌，其對(duì)大腸桿菌（）、溶藻弧菌（）、黃海希瓦氏菌（）、燦爛弧菌（）、哈氏弧菌（）和金黃色葡萄球菌（）均有裂解效果。將噬菌弧菌N1投放進(jìn)淡水和海水養(yǎng)殖環(huán)境的12~24 h，其能顯著降低兩種環(huán)境中弧菌含量（< 0.05）。DGGE分析顯示添加噬菌弧菌N1后淡水組優(yōu)勢(shì)菌群弧菌屬（，a1）和不可培養(yǎng)桿菌屬（Uncultured bacterium, a5）在 12 h 以后含量有明顯的減少，假單胞菌屬（, a3）和紅桿菌科屬（, a6）菌含量增加。海水組優(yōu)勢(shì)菌群不可培養(yǎng)桿菌屬（c2）菌在 12 h 時(shí)變成非優(yōu)勢(shì)菌群，而白桿菌屬（，c1）增加成為優(yōu)勢(shì)菌群。噬菌弧菌N1在水中含量在24 h時(shí)降至最低。噬菌弧菌N1對(duì)海水和淡水環(huán)境中的弧菌屬和不可培養(yǎng)桿菌屬菌群有明顯的裂解作用導(dǎo)致其含量下降，但也使假單胞菌屬（），紅桿菌科屬和白桿菌屬（）菌群含量增加，但生物效應(yīng)不明。為維持噬菌弧菌N1對(duì)弧菌的控制，需要24 h左右重新補(bǔ)充投放。

噬菌弧菌N1；養(yǎng)殖水體；PCR-DGGE分析；細(xì)菌群落；弧菌；不可培養(yǎng)桿菌屬

蛭弧菌及其類似物（-and-like organisms，BALOs），簡(jiǎn)稱蛭弧菌，是一個(gè)革蘭陰性（G-）細(xì)菌類群，菌體呈弧狀或短桿狀，具有寄生性，能夠裂解一些革蘭陰性（G-）細(xì)菌，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、幽門螺旋桿菌等[1]。蛭弧菌包括蛭弧菌科（Bdellovibrionaceae）和噬菌弧菌科（Bacteriovoracaceae），噬菌弧菌科分噬菌弧菌屬（，Ba）和吞菌弧菌屬（，Per）。蛭弧菌普遍存在于環(huán)境中[2-4]，對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，隨著我國(guó)高密度規(guī)?；B(yǎng)殖方式的普及，水產(chǎn)細(xì)菌性病害問(wèn)題日益凸顯，抗生素等藥物的濫用導(dǎo)致藥物殘留加重，對(duì)食品安全問(wèn)題造成威脅，直接對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。蛭弧菌因其特有的裂解特性、廣泛的分布及種類繁多等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值[7-9]。在應(yīng)用蛭弧菌防治細(xì)菌性疾病上，早期Nakamura等[10]利用蛭弧菌治療弗氏志賀菌（）感染的兔眼角結(jié)膜炎。Nayak等[11]報(bào)道噬菌蛭弧菌成功防治稻田水中由黃單胞菌（）引起的水稻白枯病的。國(guó)內(nèi)關(guān)于蛭弧菌防治的研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用方面報(bào)道較多，如應(yīng)用淡水蛭弧菌防治嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌等取得一定得成效[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)噬菌弧菌的研究主要集中在其裂解機(jī)制方面[14-15]，及對(duì)凡納濱對(duì)蝦弧菌病的防治問(wèn)題[16]，但噬菌弧菌對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要以淡水（紅鯉魚(yú)）養(yǎng)殖環(huán)境和海水（仿刺參）養(yǎng)殖環(huán)境為實(shí)驗(yàn)條件，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)研究了噬菌弧菌N1在一個(gè)投放周期內(nèi)對(duì)淡水紅鯉魚(yú)水體和海水刺參養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期了解噬菌弧菌N1在淡水和海水養(yǎng)殖的實(shí)際應(yīng)用效果，為噬菌弧菌的細(xì)菌性疾病防治應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參，體長(zhǎng)10 cm左右，體質(zhì)量12 g左右，取自農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；紅鯉魚(yú)苗，體長(zhǎng)5 cm左右，購(gòu)于觀賞魚(yú)市場(chǎng)，且產(chǎn)地均為遼寧省大連市。

噬菌弧菌N1（sp. N1）分離自市售微生態(tài)制劑（淡、海水均適用）。

1.2 方法

1.2.1 蛭弧菌的分離及裂解能力測(cè)試

1.2.1.1 蛭弧菌的分離純化 樣品預(yù)處理：將蛭弧菌微生態(tài)制劑用0.45 μm微孔濾膜粗過(guò)濾以除去大部分雜菌和顆粒物質(zhì)，濾出液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜收集蛭弧菌菌體。由生理鹽水洗脫懸浮備用。

蛭弧菌的分離：將大腸桿菌作為宿主菌（）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，吸取1 mL宿主菌和0.5 mL樣品混合后加入4 mL冷卻至40~50 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%瓊脂培養(yǎng)基中，均勻混合后，立即灌注到預(yù)先制備的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂平板上，待凝固后于28 ℃正置培養(yǎng)3~5 d。

蛭弧菌的純化：取單一噬菌斑以大腸桿菌為宿主菌在28 ℃、160 r/min進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。同分離培養(yǎng)方法，再次雙層瓊脂平板培養(yǎng)，培養(yǎng)3次以上直到平板上出現(xiàn)形態(tài)一致的噬菌斑。將純化后蛭弧菌培養(yǎng)液在4 ℃、3 000 r/min低速離心15 min，上清中即含有大量蛭弧菌細(xì)胞，該純化菌命名為蛭弧菌N1。蛭弧菌濃度測(cè)定采用計(jì)數(shù)噬菌斑法獲得。

1.2.1.2 蛭弧菌N1 16S rDNA序列擴(kuò)增及序列分析 以噬菌蛭弧菌16S rDNA區(qū)特異性引物Bac676F和Bac1442R進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×DNA buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）2 μL，模板DNA 5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，30 s； 40個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Nuclotide BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.1.3 蛭弧菌N1裂解能力的測(cè)試 用實(shí)驗(yàn)室保存的6株菌作為宿主菌進(jìn)行分離蛭弧菌裂解能力的測(cè)試。革蘭氏陰性菌有大腸桿菌（）、溶藻弧菌（）、黃海希瓦氏菌（）、燦爛弧菌（）、哈氏弧菌（），革蘭陽(yáng)性菌為金黃色葡萄球菌（）。將大腸桿菌等革蘭氏陰性菌置于30 ℃恒溫?fù)u床，將金黃色葡萄球菌置于37 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)16~24 h。將培養(yǎng)液在6 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清，沉淀用滅菌生理鹽水懸浮，4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎秒p層瓊脂平板法對(duì)分離的蛭弧菌進(jìn)行裂解能力測(cè)試。每個(gè)宿主3個(gè)重復(fù)，記錄噬菌斑數(shù)量，并在結(jié)束時(shí)測(cè)量噬菌斑最大直徑。

1.2.2 蛭弧菌N1對(duì)淡水和海水養(yǎng)殖環(huán)境微生物的影響

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、淡水組和海水組：淡水組養(yǎng)殖紅鯉魚(yú)（10尾），海水組（鹽度31~32）養(yǎng)殖仿刺參（10頭），兩組均添加50 mL純化的蛭弧菌N1菌液，致添加后終濃度為1×103PFU/mL，每個(gè)水槽注水量為50 L，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（0 h）加入20 mL含2 g蛋白胨和0.5 g酵母粉的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液[17]，對(duì)照組不添加噬菌弧菌N1菌液，所有組均2個(gè)平行。室內(nèi)養(yǎng)殖，保證溫度一致（25 ℃左右），每個(gè)水槽放置一個(gè)氣石，暫養(yǎng)期為7 d，不換水，實(shí)驗(yàn)期為48 h。

1.2.2.2 樣品采集和處理 在添加蛭弧菌N1菌液前30 min內(nèi)采集第一次水樣，即0 h時(shí)刻，加入蛭弧菌N1后4、12、24、48 h分別采集水樣1 L。所有水樣均在當(dāng)天處理完成：各取500 mL水樣用0.22 μm微孔濾膜在無(wú)菌條件下抽濾，無(wú)菌勺刮取濾膜上的菌體，并用TE緩沖液沖洗，溶于總計(jì)4 mL緩沖液中，用于總細(xì)菌、弧菌和蛭弧菌的計(jì)數(shù)，剩余樣品-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于DNA的提取。

1.2.2.3 微生物計(jì)數(shù) 將過(guò)濾收集的細(xì)菌進(jìn)行梯度稀釋，計(jì)數(shù)總細(xì)菌數(shù)量時(shí)，海水樣品采用2216E固體平板培養(yǎng)，淡水樣品采用NB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。弧菌計(jì)數(shù)則用TCBS培養(yǎng)基檢測(cè)。蛭弧菌計(jì)數(shù)用雙層自來(lái)水瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。以上各稀釋梯度樣品均設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。

1.2.2.4 水環(huán)境中細(xì)菌基因組DNA提取 取適量樣品于12 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入180 μL溶菌酶充分混勻，置于37 ℃水浴鍋溫浴30 min，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒篇[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA。取5 μL DNA樣品用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5 16S rDNA V3 區(qū)擴(kuò)增及變性梯度凝膠電泳（DGGE） 分別提取的五批次40個(gè)樣品（編號(hào)1-40）總基因組DNA作為模板，用V3區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)引物357F-40GC5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）作為引物[18]，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為230 bp。使用Bio-Rad DcodeTM system（Bio-Rad ）對(duì)16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。在變性梯度為30% ~ 60%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)8% 聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為 37.5∶1）上，電泳5 h。凝膠成像儀上拍照，分析V3區(qū)電泳條帶差異。

對(duì)DGGE中部分優(yōu)勢(shì)電泳條帶通過(guò)無(wú)菌刀片切膠回收、純化，純化產(chǎn)物分別用 pEASY-T1 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，每個(gè)條帶各選取2個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序引物M13F-47和M13R-48。

1.2.2.6 數(shù)據(jù)分析 PCR-DGGE圖譜采用Quantity One（Bio-Rad）軟件分析。將優(yōu)勢(shì)條帶和變化明顯的條帶割膠回收后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得的16S rDNA序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析給出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛭弧菌N1分離與鑒定

蛭弧菌N1在雙層瓊脂平板上生長(zhǎng)48 h后形成清晰可見(jiàn)的圓形噬菌斑，30 ℃培養(yǎng)4 d之后菌斑直徑可達(dá)4 ~ 5 mm（圖1所示）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析得知，N1的16S rDNA基因片段大小為766 bp，測(cè)序結(jié)果表明N1菌株為噬菌弧菌屬菌株，與JS5具有95 %的相似性，命名為噬菌弧菌N1（sp. N1）。

2.2 噬菌弧菌N1的裂解能力

實(shí)驗(yàn)表明，噬菌弧菌N1對(duì)選取的6株宿主菌均有較好的裂解能力，除大腸桿菌外，最大噬菌斑直徑均可達(dá)到4 mm，且出斑時(shí)間短，在24 ~ 48 h即可形成清晰可見(jiàn)的噬菌斑，最大噬菌斑直徑達(dá)4.5 mm，見(jiàn)表1。裂解效價(jià)為哈氏弧菌最高，達(dá)到了600 PFU/mL，最小的為燦爛弧菌，裂解效價(jià)為188 PFU/mL。

a，純化前噬菌斑；b，純化后噬菌斑

表1 Bacteriovorax sp. N1對(duì)不同宿主菌的裂解效價(jià)

2.3 噬菌弧菌N1對(duì)淡水和海水養(yǎng)殖水體微生物總量的影響

淡水組中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中總可培養(yǎng)細(xì)菌總含量和弧菌含量的變化趨勢(shì)較一致?；【吭? ~ 4 h呈迅速上升趨勢(shì)，隨后含量逐漸減少至峰值的一半，在第24 h后又趨于增長(zhǎng)趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組弧菌含量在12、24 h顯著低于對(duì)照組（< 0.05）（圖2a）。實(shí)驗(yàn)組中蛭弧菌含量變化明顯，在0 ~ 4 h時(shí)由初始濃度1×103PFU /mL增長(zhǎng)至1.5×104PFU /mL，而隨后含量持續(xù)降低，到24 h時(shí)降低到8×103PFU /mL，到48 h幾乎檢測(cè)不到（圖2 b）?？偪膳囵B(yǎng)細(xì)菌含量在第1 d內(nèi)迅速增長(zhǎng)，在第24 h時(shí)達(dá)到峰值，在第2 d內(nèi)含量逐漸下降至接近初始水平，兩組間差異不顯著（0.05）（圖2 c）。

海水組中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組總可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)和弧菌數(shù)變化趨勢(shì)較一致。實(shí)驗(yàn)組弧菌含量也在12、24 h顯著低于對(duì)照組（< 0.05）（圖3d）。蛭弧菌含量變化趨勢(shì)與淡水組基本一致，但是蛭弧菌濃度高于淡水環(huán)境，最高可達(dá)2.5×104PFU /mL，而且在48 h后水中蛭弧菌的含量可達(dá)到8×103PFU /mL（圖3e）?？膳囵B(yǎng)細(xì)菌總數(shù)在48 h內(nèi)總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組在12 ~ 24 h之間有明顯下降趨勢(shì)（< 0.05），弧菌含量也有此現(xiàn)象（< 0.05）（圖3f）。

綜上分析可知，添加噬菌弧菌N1菌液會(huì)使淡水和海水養(yǎng)殖水體中異氧細(xì)菌和弧菌含量有所下降，表現(xiàn)為具有一定的防控作用，但對(duì)弧菌的防控效果顯示在24 h效果顯著。

a為弧菌數(shù)；b為蛭弧菌數(shù)；c為可培養(yǎng)總細(xì)菌數(shù)

a為弧菌數(shù)；b為蛭弧菌數(shù)；c為可培養(yǎng)總細(xì)菌數(shù)

2.4 淡水及海水環(huán)境中基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，40個(gè)樣品均得到大小為200 bp左右的擴(kuò)增基因片段，且條帶較亮。

2.5 PCR-DGGE分析噬菌弧菌N1對(duì)海水和淡水養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌群落的影響

DGGE分析結(jié)果如圖4、5所示。DGGE圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類，條帶亮度大小代表微生物相對(duì)數(shù)量的多少，越亮則代表微生物數(shù)量越多。由圖4、5可以看出，添加噬菌弧菌N1后不同取樣時(shí)間淡水組實(shí)驗(yàn)組和海水實(shí)驗(yàn)組條帶較對(duì)照組均存在一定的差異。淡水組和海水組DGGE顯示優(yōu)勢(shì)條帶（a1 ~ a6, c1 ~ c2）和部分差異條帶（b5, d1）被切膠回收和克隆測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)表2，主要變化的微生物群落有弧菌屬（）、不可培養(yǎng)桿菌屬（uncultured bacterium）、假單胞菌屬（）、紅桿菌科屬（）等。

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)淡水實(shí)驗(yàn)組菌群豐度下降較明顯，而對(duì)照組基本維持在同一水平；淡水組加入噬菌弧菌N1后與加入噬菌弧菌N1前（0 h）菌群數(shù)量及優(yōu)勢(shì)類群出現(xiàn)部分差異變化。0 h和4 h以弧菌（, a1）和不可培養(yǎng)桿菌屬（uncultured bacterium, a5）為主要優(yōu)勢(shì)類群，在12、24、48 h時(shí)這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)類群有明顯的減少，弧菌屬（a1）甚至變?yōu)榉莾?yōu)勢(shì)類群，隨之新增了假單胞菌屬（, a3）和紅桿菌科屬（, a6）為優(yōu)勢(shì)類群。在4 h時(shí)新增的差異條帶b5經(jīng)測(cè)序檢測(cè)為噬菌弧菌N1，但因含量較低，在12 h之后不再有明顯可見(jiàn)的條帶出現(xiàn)。在24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組微生物菌群豐度值達(dá)到最低，即菌群數(shù)量最少。

海水實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組隨時(shí)間變化其微生物群落豐度值逐漸增加后回落。海水組微生物菌群結(jié)構(gòu)除部分優(yōu)勢(shì)類群有一定變化，其他非優(yōu)勢(shì)類群變化較少。白桿菌屬（，c1）在0 h和4 h并不完全是優(yōu)勢(shì)類群，而在12 h及之后以絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群存在，不可培養(yǎng)桿菌屬（uncultured bacterium, c2）在0 h為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，在12 h時(shí)變成非優(yōu)勢(shì)菌群，隨后又成為優(yōu)勢(shì)菌群。d1經(jīng)檢測(cè)為噬菌弧菌N1，且因?yàn)楹枯^低，在之后并沒(méi)有明顯條帶出現(xiàn)。其他非優(yōu)勢(shì)類群在海水實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中數(shù)量均有所增加，而沒(méi)有出現(xiàn)如淡水實(shí)驗(yàn)組中明顯減少現(xiàn)象。

a1―a6為優(yōu)勢(shì)菌群；b1―b10為差異菌群

a1―a6 are dominant microflora; b1—b10 are different from microflora

圖4 噬菌弧菌N1對(duì)淡水組水體細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響的DGGE分析及電泳識(shí)別

Fig. 4 DGGE of the effect of Bacteriovorax sp. N1 on bacterial community structure in freshwater

c1，c2是優(yōu)勢(shì)菌群；d1―d5是差異菌群

c1, c2 are dominant microflora; d1―d5 are different from microflora

圖5 噬菌弧菌N1對(duì)海水組水體細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響的DGGE分析及電泳識(shí)別

Fig. 5 DGGE of the effect of Bacteriovorax sp. N1 on bacterial community structure in seawater

表2 DGGE回收條帶序列分析

3 討論

蛭弧菌對(duì)環(huán)境細(xì)菌數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響主要取決于蛭弧菌裂解特性[19-23]。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中大多數(shù)病原菌都是革蘭氏陰性菌，有研究[24]報(bào)道蛭弧菌更易裂解環(huán)境中的弧菌。本研究主要研究噬菌弧菌N1在一個(gè)投放周期內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物總數(shù)及群落結(jié)構(gòu)或豐度的影響，DGGE結(jié)果顯示淡水組加入噬菌弧菌N1后菌群數(shù)量及優(yōu)勢(shì)類群出現(xiàn)部分差異變化，原優(yōu)勢(shì)群落弧菌屬（，a1）和不可培養(yǎng)桿菌屬（uncultured bacterium, a5）12 h后有明顯的減少，弧菌（a1）甚至變?yōu)榉莾?yōu)勢(shì)類群，該結(jié)果與平板培養(yǎng)結(jié)果一致，而增加了假單胞菌屬（，a3）和紅桿菌科屬（, a6）兩個(gè)優(yōu)勢(shì)類群。海水組的優(yōu)勢(shì)菌群不可培養(yǎng)桿菌屬（uncultured bacterium, c2）在12 h后明顯減少，在24 h后又恢復(fù)為優(yōu)勢(shì)菌群，而白桿菌屬（A）在12 h后增加成為優(yōu)勢(shì)菌群。平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示噬菌弧菌N1對(duì)海水中的弧菌也有較明顯的裂解效果，尤其是12~24 h，實(shí)驗(yàn)組弧菌含量顯著下降（< 0.05），但在DGGE實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，原因可能是在該海水養(yǎng)殖環(huán)境中弧菌還未形成優(yōu)勢(shì)菌群，因此在分析中忽略了弧菌條帶的變化。綜合16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增及DGGE分析可知，噬菌弧菌N1主要對(duì)弧菌和不可培養(yǎng)桿菌屬等細(xì)菌具有明顯的裂解作用致其含量下降。溫崇慶等[25]關(guān)于噬菌弧菌DA5對(duì)對(duì)蝦池育苗水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究表明較高含量的DA5在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)育苗水體中的弧菌和異養(yǎng)細(xì)菌有較明顯的削減效果，這與本研究所得結(jié)果具有一致性。

本研究發(fā)現(xiàn)噬菌弧菌N1也可使淡水中假單胞菌屬（）和紅桿菌科屬微生物含量增加，使海水中的白桿菌屬（）細(xì)菌含量增加，而這些微生物對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的生物學(xué)效應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。尤其假單胞菌屬的部分種在一定條件下具有致病性，噬菌弧菌N1作為微生態(tài)制劑應(yīng)用在紅鯉魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境中，假單胞菌屬菌含量增加引起的效應(yīng)還屬未知，因此噬菌弧菌N1的長(zhǎng)期微生物環(huán)境效應(yīng)需要進(jìn)一步研究。此外，本研究中噬菌弧菌N1在24 h時(shí)數(shù)量降至最低，因此施用頻率應(yīng)該為每24 h補(bǔ)充一次噬菌弧菌N1，才能較好得使噬菌弧菌N1對(duì)弧菌的控制效應(yīng)得以累積。

單一蛭弧菌的裂解范圍是有限的，而養(yǎng)殖水體中微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此可選用不同裂解范圍的蛭弧菌混合使用，可能會(huì)達(dá)到協(xié)同作用效果[26]。蛭弧菌也可與其他諸如增加營(yíng)養(yǎng)，改善水質(zhì)或增強(qiáng)免疫等的功能菌組合使用，以實(shí)現(xiàn)多目的同時(shí)進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。水體中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究準(zhǔn)確性很大程度上依賴于方法和技術(shù)的進(jìn)步[27]。DGGE能夠直觀的比較和分析微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度變化規(guī)律，但分析圖譜只能反映可視條帶的數(shù)量和變化，對(duì)含量極低的群落很難呈現(xiàn)出來(lái)，對(duì)這部分微生物影響的研究可用高通量測(cè)序的方法進(jìn)行。此外，噬菌弧菌N1對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中水質(zhì)指標(biāo)的影響，以及其與微生物群落變化間的關(guān)系還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，本文研究了一個(gè)施用周期噬菌弧菌N1對(duì)環(huán)境微生物群落的影響，而其長(zhǎng)時(shí)間施用對(duì)環(huán)境乃至刺參腸道微生物群落組成及功能的影響也需要考慮。

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Effect ofsp. N1 on the Bacterial Community in the Freshwater and Seawater Environment Using PCR-DGGE

CHEN Hui-xia1，HAN Min-yong1，YU Jia-hao1，LIU lin2

（1.,,,, 116023. 2.,,,266109,）

【】To study the effects ofsp. N1 on the total number of bacteria, Vibrio and bacterial community structure within an addition cycle in seawater and freshwater aquaculture environments. 【】N1 was isolated from commercially available microecological preparations. Molecular identification was carried out and its lysis effect was preliminarily determined. In addition, high concentration of N1 strain was splashed evenly into freshwater tank and seawater tank containing the red carprespectively. The number of bacteria, Vibrio and structure of bacterial community in the water environment within 48 h were analyzed by plate counting and Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) respectively.【】The strain N1 was identified assp.. It had lysis effect on,,,,and. WhenN1 was added to the fresh and marine culture environments for 12―24 hours, the content of Vibrio in both environments was significantly reduced (< 0.05). Results from DGGE showed that by addingsp. N1, the dominant(a1) and uncultured bacterium (a5) counts decreased significantly after 12 h in freshwater group, but(a3) and(a6) counts were increased. The dominant bacterium uncultured bacterium (c2) became a non-dominant species after 12 h in the seawater group, however,(c1) has become the new dominant bacterium. The content ofsp. N1 decreased to the lowest level within 24 hours. 【】sp. N1 can split Vibrio, uncultured bacterium, and also increase the number of microflora of,andin freshwater and seawater aquaculture environment. At present, the biological effects of these newly increased microflora are not known. In order to control the outbreak of Vibrio in fish cluture,sp. N1 should be replenished in 24 hours.

sp. N1; aquaculture environment; PCR-DGGE analysis; bacterial community; vibrio; uncultured bacterium

Q939.99

A

1673-9159（2019）05-0008-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.002

2019-05-07

遼寧省教育廳計(jì)劃項(xiàng)目（L2012255）

陳慧黠（1980－），女，博士，講師，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)及微生物應(yīng)用。E-mail：chenhuixia@dlou.edu.cn

劉琳（1979－）女，博士，講師，研究方向?yàn)槲⑸飸?yīng)用。E-mail：liulin@qau.edu.cn

陳慧黠，韓民泳，于佳豪，等. 噬菌弧菌N1對(duì)淡水和海水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落影響PCR-DGGE分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：8-15.

（責(zé)任編輯：劉朏）