童 也，王宇翔，徐海棟

0 引 言

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是引起下腰痛的主要因素之一，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和生活壓力［1-4］。既往研究表明，年齡、職業(yè)、機(jī)械負(fù)荷、吸煙等因素在IDD中發(fā)揮重要作用［5-6］。近年來，遺傳因素被認(rèn)為是導(dǎo)致IDD的主要危險(xiǎn)因素［7-9］。

miRNA是一種小型非編碼RNA，主要通過部分或者完全結(jié)合mRNA3′端的非編碼區(qū)域從而引發(fā)翻譯抑制或mRNA降解，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［10-12］。Jing等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-93在IDD的髓核組織中表達(dá)較低，其表達(dá)水平與IDD分級(jí)密切相關(guān)。此外，過表達(dá)的miR-93通過靶向調(diào)節(jié)MMP3增加了髓核細(xì)胞中II型膠原蛋白的表達(dá)。也有研究表明，miR-143-5p在IDD的髓核組織中過表達(dá)，miR-143-5p可以促進(jìn)髓核細(xì)胞衰老并抑制髓核細(xì)胞的增殖和分化［14］。雖然越來越多的證據(jù)表明，miRNA在IDD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制仍不明確。本研究通過生物信息學(xué)方法分析退變椎間盤的miRNA芯片，通過與正常椎間盤組織進(jìn)行比較，探究其差異表達(dá)的miRNA并預(yù)測(cè)其可能的靶基因，為IDD的分子機(jī)制研究與臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 獲取椎間盤芯片數(shù)據(jù)從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫中（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載人椎間盤的miRNA芯片數(shù)據(jù)，芯片數(shù)據(jù)集編號(hào)為GSE116726。該芯片包含3例IDD患者的髓核組織樣本（IDD組）以及3例來源于新鮮外傷性腰椎骨折患者的正常髓核組織樣本（正常組）。

1.2 芯片數(shù)據(jù)處理R軟件讀取芯片矩陣數(shù)據(jù)，對(duì)其中miRNA的表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。表達(dá)矩陣中相同的miRNA通過取平均值表達(dá)值的方法來合并數(shù)據(jù)。miRNA探針信息通過平臺(tái)文件GPL20712（芯片數(shù)據(jù)集的平臺(tái)文件）注釋。

1.3 差異表達(dá)miRNAR軟件中Limma包用來對(duì)上述處理后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的篩選。IDD組與正常組之間的miRNA表達(dá)值通過t檢驗(yàn)計(jì)算P值，BH法校正P值。差異miRNA的篩選條件為差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞1且校正后的P值＜0.05。

1.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)分別選取差異miRNA上調(diào)和下調(diào)最顯著的前5個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。在 miRWalk 2.0（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）軟件中選取TargetScan與miRTarBase2個(gè)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)得到的miRNA靶基因交集。將得到的結(jié)果導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.1（https：//cytoscape.org/）軟件中，對(duì)miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果進(jìn)行可視化［15］。其中預(yù)測(cè)評(píng)分設(shè)置為0.95且結(jié)合位點(diǎn)為3UTR。

1.5 靶基因富集分析找出靶基因數(shù)目最多的miRNA，在clusterProfiler包［16］中對(duì)其靶基因分別進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO富集包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組成3個(gè)類別。P＜0.05為富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 靶基因蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析在STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，對(duì)靶基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置最小有效結(jié)合分?jǐn)?shù)為0.4。分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。最后，利用cytoHubba插件中MCC算法分析PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的miRNA靶基因，找出其核心基因。為了進(jìn)一步了解核心基因在IDD組織中的表達(dá)水平，在GSE23130數(shù)據(jù)集中針對(duì)核心基因做初步分析。GSE23130數(shù)據(jù)集中包含23個(gè)椎間盤組織樣本，按照退變等級(jí)將數(shù)據(jù)分為對(duì)照組（Pfirrmann分級(jí)≤3級(jí)的15個(gè)樣本）和退變組（Pfirrmann分級(jí)＞3級(jí)的8個(gè)樣本），將退變組與對(duì)照組樣本進(jìn)行比較。鑒于該數(shù)據(jù)集中缺少TXLNG的注釋信息，只對(duì)剩余的9個(gè)核心基因做了表達(dá)水平的檢測(cè)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異miRNA篩選IDD組與正常組共篩選出374個(gè)差異miRNA，其中上調(diào)的miRNA 189個(gè)，下調(diào)的miRNA 185個(gè)，見圖1。差異miRNA中上調(diào)與下調(diào)最顯著的前15個(gè)miRNA中，hsa-let-7b-5p下調(diào)最明顯。見表1。

圖1 差異表達(dá)miRNA火山圖Figure 1 Volcano plot of the differentially expressed miRNAs in the subjects

2.2 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果上述得到的差異表達(dá)miRNA中，分別選取其中上調(diào)和下調(diào)最顯著的前5個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。hsa-let-7b-5p的靶基因數(shù)目最多，共有85個(gè)靶基因，包含GPAT4、E2F2、PAK1等。見圖2。

2.3 靶基因富集分析結(jié)果對(duì)上述得到hsa-let-7b-5p的全部靶基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示靶基因主要參與細(xì)胞周期G1/S相變、靶向膜蛋白的正調(diào)控等生物學(xué)過程；靶基因主要定位于染色質(zhì)和蛋白激酶復(fù)合物等細(xì)胞成分。靶基因的主要分子功能有突觸融合蛋白結(jié)合、核輸入信號(hào)受體活性、蛋白磷酸酶活性調(diào)節(jié)等，見圖3。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，靶基因主要富集的信號(hào)通路有催乳素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和p53信號(hào)通路，見圖4。

表1 差異最顯著的上調(diào)與下調(diào)的miRNATable 1 Most significantly up-or down-regulated miRNAs in the subjects

圖2 miRNA與其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Up-or down-regulated miRNAs and the regulatory network of their target genes

圖3 靶基因GO富集分析Figure 3 GO enrichment analysis of the target genes

2.4 靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果STRING數(shù)據(jù)庫與Cytoscape軟件中構(gòu)建了hsa-let-7b-5p靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖5。cytoHubba插件分析PPI網(wǎng)絡(luò)并找出10個(gè)核心基因，分別為CCND2、NRAS、E2F2、E2F6、STX3、CDCA8、RRM2、PPP2R2A、TXLNG、AKT2。在GSE23130數(shù)據(jù)集中對(duì)hsa-let-7b-5p核心基因做了表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，CCND2、NRAS、E2F2、E2F6、STX3、CDCA8、RRM2、PPP2R2A、AKT2在退變組中的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖6。

圖4 靶基因KEGG富集分析Figure 4 KEGG enrichmentanalysis ofthe target genes

圖5 hsa-let-7b-5p靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 5 PPI network of the hsa-let-7b-5p target genes

圖6 核心基因在GSE23130數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平Figure 6 Expression levels of the hub genes in the GSE23130 dataset

3 討 論

本研究選取了人椎間盤miRNA芯片，其中包括3例IDD患者的髓核組織樣本以及3例新鮮外傷性腰椎骨折患者的正常髓核組織樣本。通過比較2組miRNA表達(dá)水平，共找出374個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)的miRNA有189個(gè)，下調(diào)的miRNA有185個(gè)。據(jù)報(bào)道，hsa-miR-634的過表達(dá)可以抑制高級(jí)別骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的細(xì)胞存活和基質(zhì)合成［17］。本研究發(fā)現(xiàn)的差異miRNA中，hsa-miR-634表達(dá)同樣是上調(diào)的，因此，hsa-miR-634在椎間盤組織中可能同樣通過表達(dá)的上調(diào)從而抑制髓核細(xì)胞的生長以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，加速了椎間盤退變的過程。

在miRWalk軟件中，本研究分別選取其中上調(diào)和下調(diào)最顯著的前5個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，hsa-let-7b-5p的靶基因數(shù)目最多，包含GPAT4、E2F2、PAK1等。因此，為了探究hsa-let-7b-5p的主要功能，本研究通過clusterProfiler軟件包對(duì)hsa-let-7b-5p全部的靶基因進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)，靶基因主要參與細(xì)胞周期G1/S相變、靶向膜蛋白的正調(diào)控等生物學(xué)過程。膜蛋白在人體內(nèi)多種生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，如細(xì)胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?。靶向膜蛋白的正調(diào)控是hsa-let-7b-5p的靶基因主要參與的主要生物學(xué)過程之一，因此，hsa-let-7b-5p的表達(dá)失常在可能與髓核細(xì)胞的增殖能力異常高度相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果表明靶基因主要富集的信號(hào)通路有催乳素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和p53信號(hào)通路。有研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator 2，SIRT2）可以通過抑制p53/p21通路從而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老來阻止髓核細(xì)胞的降解，因此，我們推測(cè)，hsa-let-7b-5p的下調(diào)可能會(huì)間接激活p53/p21通路從而導(dǎo)致髓核細(xì)胞的大量降解，破壞椎間盤的正常生理結(jié)構(gòu)［18］。

hsa-let-7b-5p的靶基因在STRING數(shù)據(jù)庫與Cytoscape軟件中構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，通過cytoHubba插件分析靶基因網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)從而找出CCND2、NRAS、 E2F2、 E2F6、 STX3、 CDCA8、 RRM2、PPP2R2A、TXLNG、AKT2共10個(gè)核心基因，即10個(gè)與IDD相關(guān)的基因編碼的蛋白。NRAS基因負(fù)責(zé)編碼并制造一種稱為N-Ras的蛋白，該蛋白屬于RAS/MAPK信號(hào)通路途徑的一部分，負(fù)責(zé)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞循環(huán)，與細(xì)胞增殖相關(guān)。在IDD的髓核組織中，hsa-let-7b-5p的下調(diào)可能通過靶向調(diào)控NRAS從而抑制髓核細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了IDD的發(fā)生與發(fā)展。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa-let-7i-5p會(huì)抑制心肌細(xì)胞的增殖，相反的，抑制hsa-let-7i-5p的表達(dá)則顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。E2F2和CCND2作為hsa-let-7i-5p的靶點(diǎn)，具有介導(dǎo)其調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞周期的作用［19］。本研究基于此推測(cè)hsa-let-7b-5p可能同樣通過靶向調(diào)控E2F2和CCND2從而介導(dǎo)調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的周期，影響髓核細(xì)胞的增殖能力。

為了進(jìn)一步探究這些核心基因在IDD組織中的表達(dá)水平，本研究在GSE23130數(shù)據(jù)集中對(duì)核心基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)全部核心基因在IDD組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，其中TXLNG由于缺少注釋信息因此沒有納入分析。miRNA主要通過抑制mRNA的表達(dá)從而發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究中，hsa-let-7b-5p在IDD組織中下調(diào)，其靶基因通過蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)找出的核心基因在IDD組織中上調(diào)，這與預(yù)期的結(jié)果相一致，同時(shí)也提示我們?cè)贗DD疾病的進(jìn)展中，hsa-let-7b-5p正常的表達(dá)對(duì)于維持其靶基因表達(dá)的穩(wěn)定十分重要。

綜上所述，hsa-let-7b-5p在IDD的髓核組織中顯著下調(diào)，可能通過調(diào)控其靶基因CCND2、NRAS等在IDD的發(fā)病過程中扮演重要的角色，然而其具體的功能與分子機(jī)制還需要相關(guān)實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的驗(yàn)證。