湯加寧 謝華夏 張袁骕 徐志遠 程向東

槐耳作為一種藥用真菌，在我國已使用千年，隨著科技的發(fā)展，其藥用價值及抗腫瘤機制不斷被我國學者發(fā)現(xiàn)。國內(nèi)學者研究表明槐耳真菌的熱水提取物槐耳清膏（主要活性物質(zhì)為蛋白多糖）具有誘導胃癌、結腸癌、肺癌等數(shù)種癌細胞凋亡、抑制癌細胞生長及轉移的作用[1-3]。本研究采用胃腺癌MKN-45細胞系構建裸鼠足墊胃癌移植瘤模型，予槐耳清膏灌胃治療，觀察足墊移植瘤的生長及腘窩淋巴結轉移情況，通過檢測和比較足墊胃癌組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的蛋白和mRNA表達情況，進而探討槐耳清膏抑制胃癌MKN-45細胞淋巴結轉移的機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備 FBS、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒（AllPrepDNA/RNA/Protein Mini Kit）購自德國QIAGEN公司，熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa生物技術有限公司，qRT-PCR引物序列購自上海生工生物工程股份有限公司，抗體βactin購自武漢谷歌生物公司，抗體MMP-9購自美國Affinity公司，槐耳清膏購自啟東蓋天力藥業(yè)有限公司。倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司，電泳儀、蛋白印跡檢測系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，Real-time qPCR儀器購自美國Applied Biosystems公司?；倍甯喙嘧⒁旱呐渲品椒ǎ簩⒒倍甯嗳芙庥?.9%氯化鈉溶液中配成濃度為200mg/ml的灌洗液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后于4℃儲存待用。

1.2 細胞和動物 人胃腺癌細胞株系MKN-45由南京凱基生物科技有限公司提供。40只4~6周齡雄性BALB/c裸鼠由浙江省中醫(yī)藥大學動物實驗中心供應。

1.3 足墊胃癌移植瘤模型 將處于對數(shù)生長期的人胃腺癌細胞系MKN-45制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×107/ml。每只裸鼠右下肢足墊接種上述細胞懸液50μl，觀察人胃腺癌MKN-45細胞在裸鼠足墊生長和成瘤情況。

1.4 給藥及處理 建模成功后將裸鼠按體重配對法分成槐耳清膏組與氯化鈉溶液組，每組20只?；倍甯嘟M灌胃槐耳清膏液25ml/kg，2d 1次，氯化鈉溶液組每只小鼠均灌胃氯化鈉溶液0.5ml，2d 1次。灌胃給藥前測量裸鼠體重。給藥5周時再次測量體重后采用頸椎脫臼法處死兩組裸鼠。

1.5 觀察和檢測指標

1.5.1 一般狀態(tài)觀察 建模成功后每日觀察兩組裸鼠活動度、進食和足墊腫瘤變化情況，每2d測量1次體重。

1.5.2 裸鼠足墊腫瘤相對體積（RTV）測算 在脫頸處死并解剖兩組裸鼠后，參考公式RTV=πxyz/6（x為腫瘤長度，y為腫瘤寬度，z為腫瘤厚度），測算兩組裸鼠足墊腫瘤的RTV。

1.5.3 裸鼠組織病理學分析 裸鼠處死后，解剖兩組足墊腫瘤及相應腘窩淋巴結，固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織及淋巴結轉移情況，根據(jù)有腘窩淋巴結轉移只數(shù)/建模成功只數(shù)計算腘窩淋巴結轉移率。

1.5.4 MMP-9蛋白、mRNA表達檢測 采用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit試劑盒提取足墊胃癌組織總蛋白和總RNA。采用Western blot法檢測兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達。以β-actin為內(nèi)參，比較MMP-9蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。通過qRTPCR檢測兩組裸鼠足墊胃癌組織中的MMP-9 mRNA表達。使用紫外分光儀分析RNA純度和濃度。根據(jù)cDNA反轉錄酶試劑盒說明書，逆轉所有樣品RNA，反應條件：42℃ 45min，70℃ 10min。將 cDNA 儲存在-80℃超低溫冰箱中備用。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，MMP-9的前引物序列為GCAATGCTGATGGGAAACCC，后引物序列為AGAAGCCGAAGAGCTTGTCC，β-actin的前引物序列為TCACCATGGATGATGATATCGC，后引物序列為 GACGGTTGGATCTGCCATGA。PCR反應條件：預變性95℃ 30s；PCR反應40個循環(huán)，95℃ 5s；60℃ 34s。反應結束后確認qRT-PCR的擴增曲線和熔解曲線。根據(jù)相對定量分析方法計算MMP-9mRNA在槐耳清膏組中相對于氯化鈉溶液組中的擴增異倍數(shù)為2-ΔΔCt。其中Ct值表示目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct（MMP-9）-Ct（β-actin），ΔΔCt=ΔCt（槐耳清膏組）-ΔCt（氯化鈉溶液組）。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組裸鼠一般狀態(tài)比較 兩組裸鼠在造模后及實驗期間均未出現(xiàn)死亡，槐耳清膏組與氯化鈉溶液組裸鼠在體重和食欲上比較無明顯差別，槐耳清膏組裸鼠活躍度明顯比氯化鈉溶液組高。

2.2 兩組裸鼠足墊腫瘤RTV 兩組裸鼠足墊腫瘤為灰紅色不規(guī)則圓形腫塊，槐耳清膏組、氯化鈉溶液組裸鼠足墊腫瘤 RTV 分別為（1611.85±611.83）mm3、（662.75±450.66）mm3，槐耳清膏組大于氯化鈉溶液組，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.80，P＜0.05）。

2.3 兩組裸鼠腘窩淋巴結轉移情況比較 槐耳清膏組裸鼠中有8只裸鼠出現(xiàn)腘窩淋巴結轉移（40.0%）；氯化鈉溶液組裸鼠中有15只出現(xiàn)腘窩淋巴結轉移（75.0%）?；倍甯嘟M轉移率小于氯化鈉溶液組轉移率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.01，P＜0.05）。

2.4 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達比較槐耳清膏組足墊胃癌組織MMP-9蛋白的表達水平低于氯化鈉溶液組（圖1）；氯化鈉溶液組灰度值比（MMP-9/β-actin）為 0.97±0.01，槐耳清膏組為 0.74±0.05，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.03，P＜0.05）。

2.5 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9 mRNA表達比較槐耳清膏組足墊胃癌組織MMP-9 mRNA的ΔCt值為18.70±1.81，而氯化鈉溶液組的為 15.31±1.10，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且計算求得 2-ΔΔCt=0.095，故MMP-9 mRNA在槐耳清膏組的表達量為氯化鈉溶液組的9.5%。

圖1 兩組裸鼠足墊胃癌組織MMP-9蛋白表達的電泳圖

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥死亡的第4大主因[4]。腫瘤侵襲轉移是嚴重影響患者預后的因素（其中淋巴結轉移是胃癌轉移的主要途徑之一），因此如何抑制腫瘤轉移是當今腫瘤治療的熱點。腫瘤的侵襲轉移與多種信號通路及分子密切相關，其中MMP-9在腫瘤的侵襲轉移之中起到重要的作用。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一，可以降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、Ⅳ型膠原蛋白，從而破壞細胞間的天然屏障，降低細胞粘附力，增強其遷移能力，促進腫瘤細胞突破基底膜向外侵襲、轉移[5]。國內(nèi)外研究表明MMP-9與胃癌、結直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤侵襲轉移的生物學行為高度相關[6-10]。Jonsson等[11]提出MMP-9可以作為生物標物來預測腫瘤患者的預后及復發(fā)。鄭春雷等[12]研究表明胃癌患者的臨床組織標本中MMP-9的表達與淋巴結轉移、浸潤程度和臨床分期密切相關。筆者團隊先前體外實驗表明，槐耳清膏有阻滯細胞周期，抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡的作用[13]，另本團隊前期通過動物實驗證明槐耳清膏可調(diào)控PI3K/Akt信號傳導通路降低MMP-9 mRNA表達抑制胃癌腹膜轉移[1]。本研究是基于使用胃腺癌細胞系MKN-45構建裸鼠足墊胃癌移植瘤模型，并用槐耳清膏灌胃治療，觀察足墊腫瘤的生長及腘窩淋巴結轉移情況，并檢測和比較足墊腫瘤細胞中MMP-9的表達情況，進一步為槐耳清膏在體內(nèi)的抗腫瘤機制提供實驗依據(jù)。

在本實驗研究中，構建足墊胃癌移植瘤模型成功率為100%，試驗期間裸鼠均未出現(xiàn)死亡?；倍甯嘟M裸鼠的足墊腫瘤RTV明顯小于氯化鈉溶液組，可見槐耳清膏能顯著抑制MKN-45胃癌細胞的增殖生長，與本課題組前期體外實驗結果一致[13]?；倍甯嘟M裸鼠的腘窩淋巴結轉移率明顯低于氯化鈉溶液組，從轉移率上講槐耳清膏具有抑制胃癌細胞MKN-45淋巴轉移的作用。MMP-9具有降解ECM的作用，降低細胞黏附力，增強其遷移能力，與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關，為此本研究團隊進一步檢測了槐耳清膏組與氯化鈉溶液組裸鼠足墊胃癌組織的MMP表達情況。通過對比，筆者發(fā)現(xiàn)槐耳清膏組裸鼠胃癌組織中MMP-9表達（mRNA水平及蛋白水平）均明顯低于氯化鈉溶液組。就此本研究團隊認為槐耳清膏具有下調(diào)MMP-9表達的作用,這與本團隊前期動物實驗結果一致[1]。

綜上所述，筆者認為槐耳清膏是一種潛在的抗腫瘤藥物，對于胃癌的生長和淋巴轉移具有一定的抑制作用，其抑制淋巴轉移的機制可能是通過負性調(diào)節(jié)MMP-9的表達，進而抑制腫瘤ECM的降解，增加腫瘤細胞黏附能力，抑制腫瘤細胞向外侵襲轉移。