徐瀟穎 羅金文 劉柱 金紹強(qiáng) 朱炳祺

摘要[目的]建立茶葉中氯噻啉殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。[方法]茶葉樣品經(jīng)乙腈提取，提取液通過TPT固相萃取柱凈化后進(jìn)行儀器分析。對(duì)樣品提取、凈化及儀器條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]氯噻啉在1 ～500 ng/mL線性關(guān)系良好（R2 >0.999）;檢出限為1.5 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg;在0.005、0.010、0.050和3.000 mg/kg條件下，回收率可達(dá)88.8%～109.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤54%（n=6）。[結(jié)論]通過方法學(xué)考察和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證表明，該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于各種茶葉中氯噻啉殘留量的定性和定量分析。

關(guān)鍵詞 氯噻啉;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;茶葉;固相萃取

中圖分類號(hào) TS207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）15-0201-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract[Objective]The research aimed to? establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the determination of chlorothiazide residues in tea.[Method]Tea sample was extracted by acetonitrile and purified by TPT solid phase extraction before instrumental analysis. This study optimized extraction method， clean up method and instrumental parameters.[Result]The linear relationship of chlorothiazide in 1-500 ng/mL is good （R2 > 0.999）;the limit of detection （LOD） and limit of quantification （LOQ） were 1.5 μg/kg and 5.0 μg/kg， respectively. The recoveries were 88.8%-109.1% with relative standard deviations （RSD） lower than 5.4%（n=6）.[Conclusion]Based on the results of method validation and interlaboratory validation， this method has proven to be sensitive， accurate and suitable for the qualitative and quantitative determination of imidaclothiz residue in tea.

Key words Imidaclothiz;Liquid chromatographytandem mass spectrometry（LCMS/MS）;Tea;Solid phase extraction

基金項(xiàng)目 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1603400）。

作者簡介 徐瀟穎（1989—），女，浙江金華人，工程師，碩士，從事食品質(zhì)量安全研究。*通信作者，工程師，博士，從事食品質(zhì)量安全控制研究。

收稿日期 2019-03-05

氯噻啉是我國自主研發(fā)的一種新型煙堿類殺蟲劑，它通過作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體以阻滯害蟲的中樞神經(jīng)正常傳導(dǎo)，其不僅可用于防治吮吸式口器害蟲，同時(shí)對(duì)鞘翅目、雙翅目和鱗翅目害蟲也有效，尤其對(duì)水稻二化螟、三化螟毒力比其他煙堿類殺蟲劑高，可以廣泛用于水稻、小麥、蔬菜、煙草、棉花、果樹、茶樹等作物，具有高效、光譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。由于氯噻啉對(duì)哺乳動(dòng)物毒性較低，被國家工信部列為“十一五”高度農(nóng)藥轉(zhuǎn)產(chǎn)和替代項(xiàng)目，具有一定的應(yīng)用前景[3]。

我國最新修訂的GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了茶葉中氯噻啉的最大殘留量為3.0 mg/kg，但國內(nèi)尚未制定關(guān)于茶葉中氯噻啉農(nóng)藥殘留量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前已報(bào)道的關(guān)于氯噻啉的檢測方法主要有液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]和氣相色譜-質(zhì)譜法[7]。施海燕等[8]利用生物素-鏈霉親和素的高親和作用，研制了一種簡便、快速的氯噻啉膠體金增強(qiáng)免疫層析分析方法，但該方法靈敏度差，容易出現(xiàn)假陽性。賀敏等[4]用二氯甲烷提取水稻樣品中的氯噻啉，提取液濃縮后通過佛羅里硅土固相萃取柱進(jìn)行凈化，使用液相色譜法檢測。楊東冬等[9]制備分子印跡固相萃取，使用液相色譜法測定大米中的氯噻啉，回收率在81.2%～97.5%。劉松南等[6]采用QuEChERS前處理方法，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中氯噻啉。相較于其他檢測方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn)，能有效檢測目標(biāo)化合物。但是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在定量分析過程中容易受到基質(zhì)的影響，不僅污染儀器，而且影響分析檢測的準(zhǔn)確性。在日常檢測過程中，茶葉基質(zhì)復(fù)雜，較谷物類食品和水果類食品含有更多的色素等基質(zhì)干擾物，因此需要有效的前處理方法以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

針對(duì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中氯噻啉使用的推廣和有效檢測方法缺失的矛盾，該研究對(duì)茶葉中氯噻啉的前處理方法及儀器測定條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證，建立準(zhǔn)確可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-MS 8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）（日本Shimadzu公司）。Mettler XPE 205分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。Multi-Prep自動(dòng)均質(zhì)器（美國PRO Scientific公司）。離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）。

1.2 試材

乙腈（質(zhì)譜純）、二氯甲烷（色譜純）購自德國Merck公司;甲苯（色譜純）購自美國TEDIA公司;甲酸（質(zhì)譜純）購自美國Fisher Scientific公司。氯化鈉（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，濃度為100 μg/mL，CAS號(hào)為105843-36-5;Cleanert TPT固相萃取柱（1 g，6 mL）、N-丙基乙二胺（PSA）由天津博納艾杰爾公司提供;試驗(yàn)用水均為經(jīng)過Milli-Q系統(tǒng)凈化后的去離子水。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

氯噻啉標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋成濃度為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液。準(zhǔn)確移取中間液，用經(jīng)過前處理的空白基質(zhì)溶液稀釋配制成濃度為1、20、50、100、200、500 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

離子源：電噴霧離子源（ESI）。掃描方式：正離子掃描。毛細(xì)管電壓4 kV。毛細(xì)管溫度300 ℃。霧化氣：氮?dú)猓? L/min。碰撞氣：氬氣。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。質(zhì)譜參數(shù)見表1。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量1 mL;流動(dòng)相A：0.1%甲酸水，B：乙腈;流速0.25 mL/min;梯度洗脫程序：0～3.0 min，15% B;3.0～6.0 min，15% B～75% B;6.0～8.0 min 75% B;8.0～8.1 min，75% B～15% B;81～10.0 min，15% B。

1.3.3 樣品處理。

1.3.3.1 提取。

稱取2 g粉碎均勻樣品（精確至0.001 g），置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，渦旋振蕩0.5 min，在高速組織搗碎機(jī)上以15 000 r/min勻質(zhì)1 min后4 000 r/min離心5 min，將上清液移入梨形燒瓶中。殘?jiān)儆?5 mL乙腈，重復(fù)上述提取過程一次，合并所有上清液，在40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至2～3 mL。

1.3.3.2 凈化。

在TPT固相萃取柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉并預(yù)先用5 mL乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）活化固相萃取柱。將濃縮提取液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱上，再用20 mL乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）洗脫，收集洗脫液于梨形燒瓶中，在40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，氮吹至干。用2.0 mL乙腈溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜測定。對(duì)于含量較高的樣品，用空白基質(zhì)溶液稀釋乙腈復(fù)溶液后，供儀器測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上氯噻啉的檢測模式為正離子模式，在方法開發(fā)過程中，依次考察了甲酸銨、乙酸銨和是否含有甲酸等分別作為水相時(shí)氯噻啉的響應(yīng)強(qiáng)弱，結(jié)果顯示，氯噻啉的響應(yīng)由強(qiáng)到弱依次為水>0.1%甲酸水溶液>5 mmol/L甲酸銨水溶液>含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液>含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液>5 mmol/L乙酸銨水溶液。盡管添加甲酸會(huì)抑制化合物的響應(yīng)，但是試驗(yàn)結(jié)果顯示純水做流動(dòng)相時(shí)容易產(chǎn)生峰前移并影響峰形。此外在乙腈中添加0.1%的甲酸對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值未有顯著提高。因此最終選擇0.1%甲酸水-乙腈作為此次分析的流動(dòng)相體系，采用梯度洗脫的方法可以將殘留在色譜柱上化合物充分洗脫。

在色譜柱的選擇中，分別考察了安捷倫Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、安捷倫Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）、安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Thermo Hypersil GOLD（2.1 mm×100 mm，3 μm）4種不同型號(hào)和規(guī)格的反相色譜柱，采用上述選定的流動(dòng)相條件進(jìn)行分離，結(jié)果表明絕大多數(shù)的C18色譜柱對(duì)氯噻啉均有保留，根據(jù)色譜柱長短適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相條件均可滿足試驗(yàn)要求。該研究選擇安捷倫Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），色譜圖見圖1。

試驗(yàn)過程中采用自動(dòng)優(yōu)化功能對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)各參數(shù)進(jìn)行快速優(yōu)化，確定特征母離子和子離子。試驗(yàn)得到母離子為m/z 262.0，二級(jí)碎片離子主要有m/z 181.05、122.10、123.05等。進(jìn)一步優(yōu)化二級(jí)碎片離子的碰撞電壓等參數(shù)，根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度和特異性，選取 m/z 262.00/181.05為定量離子，m/z 262.00/122.10為定性離子，優(yōu)化得到碰撞電壓分別為15和27 V。

2.2 提取條件的選擇

氯噻啉易溶于大部分有機(jī)溶劑，乙腈、二氯甲烷、甲醇、丙酮均為良好的提取溶劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示采用上述溶劑進(jìn)行提取后，所得回收率均能達(dá)到80%以上。相比于丙酮、二氯甲烷等，乙腈作為提取溶劑時(shí)，保證較好的提取效果的同時(shí)可以減少基質(zhì)干擾物的溶出[10]。此外在提取過程中，部分方法會(huì)采用加水對(duì)茶葉進(jìn)行浸泡后再進(jìn)行乙腈提取。如圖2所示，經(jīng)過水浸泡后的茶葉樣品提取液在凈化后顏色明顯深于未經(jīng)水浸泡的茶葉樣品。水的浸泡過程容易將茶葉的水溶性色素提取出來，從而帶來更多基質(zhì)干擾[11]。因此，在此方法中選擇乙腈直接提取茶葉樣品。

在提取方式上，通常有超聲、渦旋、振搖和均質(zhì)的方式，均質(zhì)可將樣品基質(zhì)中細(xì)胞等組織結(jié)構(gòu)破壞并充分地混合均勻[12]，為了保證能有效地將樣品中的待測目標(biāo)物提取到溶劑中，故采用均質(zhì)方法進(jìn)行提取。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

在檢測過程中，QuEChERS方法[13]有著操作便捷、適用范圍廣的特點(diǎn)，但多用于蔬菜水果的凈化。當(dāng)基質(zhì)變成茶葉、韭菜等樣品時(shí)，PSA吸附劑對(duì)色素凈化的效果有限，TPT固相萃取內(nèi)填復(fù)合吸附材料，在去除色素等基質(zhì)干擾物上有更好的效果。在研究中發(fā)現(xiàn)TPT固相萃取柱對(duì)氯噻啉有一定的吸附作用，使用乙腈不能有效地將目標(biāo)物洗脫下來，導(dǎo)致回收率低于80%。因此凈化過程中采用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫液以有效洗脫目標(biāo)物，此外試驗(yàn)對(duì)比了乙腈-甲苯（體積比3∶1）混合溶液作為洗脫溶液時(shí)的洗脫效果。盡管試驗(yàn)結(jié)果顯示使用2種洗脫液回收率均達(dá)到90%以上，但如圖2所示，使用乙腈-甲苯（體積比3∶1）作為洗脫液時(shí)得到的樣品溶液顏色深于使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫液時(shí)得到的樣品。另一份試驗(yàn)采用QuEChERS凈化方法，參考AOAC 2007.01，茶葉樣品定量加入10 mL乙腈提取液，在每毫升乙腈提取液中加入100 mg的PSA粉末進(jìn)行凈化。圖2試驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過該QuEChERS方法得到的樣品溶液顏色明顯深于使用TPT固相萃取柱方法得到的樣品溶液。因此，在該方法中選擇使用TPT固相萃取柱凈化方法并使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）作為洗脫溶劑，可以較好地去除色素雜質(zhì)。

47卷15期 徐瀟穎等 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同茶葉中的氯噻啉

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

依據(jù)“1.3.1”配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液并上機(jī)測試，以響應(yīng)值（Y）與目標(biāo)物濃度（X）建立線性擬合方程。經(jīng)驗(yàn)證，在1～500 ng/mL以不同基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2不小于0.999（表2）。

2.4.2 精密度、回收率及檢出限。

在陰性茶葉樣品中加入低、中、高、限量值4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行加標(biāo)回收與精密度測試，結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)表明，4個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為88.8%～109.1%，6次平行測試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～5.4%。

在空白茶葉樣品中加標(biāo)并進(jìn)行檢測，當(dāng)定量離子和定性離子色譜峰的信噪比（S/N）≥3時(shí)，樣品中對(duì)應(yīng)的氯噻啉含量為1.5 μg/kg，為該方法的檢出限。當(dāng)定量離子色譜峰S/N≥10時(shí)，樣品中氯噻啉的含量為 5.0 μg/kg，為該方法的定量限。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)對(duì)質(zhì)譜的離子化效果產(chǎn)生影響，從而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此為重要評(píng)價(jià)依據(jù)之一[14]。通常以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值，作為基質(zhì)效應(yīng)（ME），當(dāng)ME>1.1時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而ME<0.9時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)[15]。分別將紅茶、綠茶、烏龍茶和茉莉花茶樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與乙腈配制的校正曲線進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果顯示在4種茶葉基質(zhì)中，基質(zhì)效應(yīng)均為0.88～0.92。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，試驗(yàn)過程中采用基質(zhì)校正曲線對(duì)樣品進(jìn)行校正。

2.5 實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室之間不同儀器條件和不同實(shí)驗(yàn)人員的操作會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，為了保證方法的可重復(fù)性，選取紅茶、綠茶、茉莉花茶樣品在另外5家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容包括靈敏度、校正曲線、線性范圍、回收率試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在1～500 ng/mL，不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2均不小于0.999。在1.5和5.0 μg/kg濃度下滿足S/N≥3和S/N≥10。在 0.005、0010、0.050 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)濃度下加標(biāo)回收率均在70%～120%，RSD≤7.9%。

2.6 實(shí)際樣品測試

將該研究建立的方法，應(yīng)用于市場上流通的預(yù)包裝茶葉的檢測，其中綠茶15批、紅茶9批、烏龍茶6批、花茶4批，均未檢出氯噻啉。

3 結(jié)論

該研究結(jié)合了TPT固相萃取的前處理方法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器分析方法，建立了茶葉中靈敏、準(zhǔn)確的氯噻啉測定方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示茶葉樣品直接使用乙腈提取，通過TPT固相萃取柱方法并使用乙腈-二氯甲烷（體積比3∶1）為洗脫液，能保證回收率的同時(shí)達(dá)到較好的凈化效果。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的相關(guān)規(guī)定，為不同類型的茶葉樣品中氯噻啉殘留量的定性和定量分析提供有效的檢測手段。

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