翟志慧 梅彩英 王曉聞

摘 要 目的：建立重組抗CD25人源化單克隆抗體結合活性測定法并對其進行方法驗證。方法：采用間接ELISA法建立抗原-抗體-二抗結合反應體系，用四參數計算法擬合其結合曲線，計算供試品的結合活性。結果：方法具有良好的專屬性、精密度、相對準確度、線性和耐用性。在64%～156%水平范圍內，精密度驗證各水平的GCV值均在15%以內；相對準確度驗證各水平的相對偏倚置信區(qū)間均在±12%范圍內，平均回收率均在80%～120%范圍內；以五個水平實測值對數值對每個理論值對數值進行線性回歸，線性關系良好。結論：該方法專屬性好，精密度好，準確度高，可用于重組抗CD25人源化單克隆抗體結合活性的測定。

關鍵詞 抗CD25人源化單克隆抗體 結合活性 驗證

中圖分類號：R967 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0097-06

Establishment and validation of a method for the determination of the binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody

ZHAI Zhihui*， MEI Caiying， WANG Xiaowen

（Sansheng Guojian Pharmaceutical （Shanghai） Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： A method for determination of binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody was established and verified. Methods： An antigen-antibody-secondary antibody binding reaction system was established by indirect ELISA and four-parameter method was used to fit the binding curve and calculate the binding activity of samples. Results： The method has a good specificity， precision， relative accuracy， linearity and robustness. In the range of 64%-156%， the GCV values of each level were within 15% for precision validation， the confidence intervals of relative bias of each level were within ±12% for relative accuracy validation， and the average recovery rates were within 80%-120%， the linear regression of each theoretical log value with the measured log values at five levels showed a good linear relationship. Conclusion： The method has a good specificity， precision and accuracy， which can be used to determine the binding activity of recombinant anti-CD25 humanized monoclonal antibody.

KEy WORDS anti-CD25 humanized monoclonal antibody； binding activity； validation

急性排斥反應仍是器官移植術后導致移植物失功的重要危險因素，也是不良預后的一個重要影響因素[1-2]。T細胞的激活在急性排斥反應中處于中心角色，所以現在免疫抑制治療的目標就是阻止T細胞的激活、聚集和發(fā)揮作用[3]。目前已證實，激活的T細胞可表達不同結構和數量的IL-2R[4]。

IL-2R由α鏈（CD25、Tac、P55）、β鏈（CD122、P70、P75）和γ鏈（CD132、P64）三個亞基組成。單獨的α鏈只能構成低親和力受體；β和γ鏈則能構成中等親和力受體；只有三者的聚合體才能構成完整的高親和力受體。高親和力受體是T細胞增殖反應的關鍵，也是殺傷性T細胞增殖分化的必需因子。高親和力受體的形成必須依賴IL-2Rα鏈（CD25）的參與[5-6]：IL-2Rα鏈并不轉導信號，而是負責IL-2與IL-2R β鏈、γ鏈異二聚化，激活酪氨酸激酶Jak3，啟動STAT分子上的Stat3、Stat5a和5b進入受體開始磷酸化[7]，從而使抗原激活的T細胞開始有絲分裂和克隆擴增。

抗CD25的藥物主要有重組IL-2蛋白[8-9]、抗CD25單克隆抗體（basiliximab、daclizumab）、抗CD25放射免疫結合物（131I-basiliximab[10]、90Y-daclizumab[11]）、抗CD25免疫毒素（LMB-2[12]、OntakTM[13]、E7777[14]）、抗CD25抗體藥物偶聯(lián)物（ADCT-301）等[15]。臨床資料表明，抗CD25單克隆抗體作為新的免疫抑制劑的代表，特異性地作用于CD25，通過阻斷T細胞的活化與增殖，能夠有效降低急性排斥反應的發(fā)生率，顯著提高移植物及移植受體的生存率，降低激素用量和縮短其使用時間[16]。

本公司生產的重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液（健尼哌），是羅氏公司生產的賽呢派（daclizumab，zenapax）的生物類似藥，其作用機制是通過與抗原CD25的特異結合而發(fā)揮作用的?！吨袊幍洹?015版三部“人用重組單克隆抗體制品總論”中對效價的檢定包括生物學活性和結合活性兩個檢項。因此，結合活性是產品重要的質控指標。本研究采用間接ELISA法測定重組抗CD25人源化單克隆抗體與抗原CD25的結合活性，并參考USP通則<1033>（Biological Assay Validation），對該方法進行方法驗證。

1 材料與方法

1.1 參比品及供試品

參比品及供試品重組抗CD25人源化單克隆抗體理化對照品（簡稱002理化對照品，批號：S20110301）、空白輔料重組抗CD25人源化單克隆抗體原液緩沖液（簡稱002原液緩沖液，批號：180703）和其他IgG單抗重組抗HER2人源化單克隆抗體理化對照品（簡稱302理化對照品，批號：S200901）均由本公司提供。

1.2 試劑及儀器

CD25蛋白為北京義翹神州生物技術有限公司產品；Goat anti-Human IgG（Fc specific）-HRP為Sigma公司產品；EL-TMB顯色試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產品；SpectraMax M5多功能酶標儀及SoftMax分析軟件為美國Molecular Devices公司產品。

1.3 測定方法

將CD25蛋白用包被液稀釋至0.1 mg/ml，包被酶標板，100 ml/孔，2～8 ℃過夜；用洗滌液洗板4次；用封閉液（含3% BSA的PBS緩沖液）300 ml/孔，25 ℃孵育2 h；用洗滌液洗板4次；用稀釋液將重組抗CD25人源化單克隆抗體參比品及供試品分別稀釋至2 500 ng/ml，再3倍比稀釋10個濃度梯度達833.33、277.78、92.59、30.86、10.29、3.43、1.14、0.38、0.13和0.04 ng/ml，共11個濃度點。分別將稀釋后的參比品和供試品100 ml/孔加入酶標板中，25 ℃孵育2 h；用洗滌液洗板4次；加入二抗Goat anti-Human IgG （Fc specific）-HRP（1 ： 20 000），100 ml/孔，25 ℃孵育1 h；用洗滌液洗板4次；加入新配的TMB顯色液，100 ml/孔，室溫避光顯色15～25 min，加入終止液50 ml/孔，于酶標儀檢測波長450 nm參比波長650 nm處讀取各孔吸收度（A）值，利用Softmax軟件分析數據，以重組抗CD25人源化單克隆抗體蛋白濃度為橫坐標，對應的A450-650吸光度均值為縱坐標，用四參數方程繪制劑量反應曲線。根據供試品及參比品的半數有效濃度（EC50），按以下公式計算供試品的相對結合活性。以參比品及供試品曲線的系數R2≥0.98，信噪比≥10，參比品與供試品的曲線斜率的比值在80%～120%之間，檢測結果的變異系數（CV）不超過20%，作為試驗成立的標準。

1.4 方法學驗證

1.4.1 專屬性

將002理化對照品用65 ℃水浴處理4 h作為強制破壞樣本。取002理化對照品、002原液緩沖液、302理化對照品和強制破壞樣本（65 ℃水浴處理4 h）按照上述測定方法進行相對結合活性測定，驗證該方法的專屬性。002理化對照品應有顯著的量效曲線，實驗結果擬合圖應呈“S”曲線；002原液緩沖液和302理化對照品應無量效曲線；強制破壞樣品的結合活性相對于參比品應呈下降趨勢。

1.4.2 精密度

由2名實驗人員，在3個不同的工作日內，對002理化對照品按照上述測定方法進行相對結合活性測定。其中實驗人員1每天制備5個水平的供試品，相對結合活性分別是參比品的64%、80%、100%、125%和156%；實驗人員2每天制備3個水平的供試品，相對結合活性分別是參比品的64%、100%和156%。2名實驗人員每個水平的供試品需獨立制備兩份，在同一塊板上進行測定。參比品和供試品均以雙孔結果進行擬合作為一次結果，將各個水平的實測原始值取對數，計算每個水平的對數平均值、對數標準偏差（SD）、幾何標準偏差（GSD）、幾何變異系數（GCV）、對數標準偏差95%置信上限（CISD）、幾何標準偏差95%置信上限（CIGSD）、幾何變異系數95%置信上限（CIGCV）。以每一水平的幾何標準偏差和幾何變異系數來驗證該方法的精密度。GCV應≤15%。

1.4.4 線性與范圍

以相對準確度驗證中的5個水平實測值對數值（縱坐標）對每個理論值對數值（橫坐標）作圖，評估相對結合活性的實測值對數值與理論值對數值之間的線性關系。用直線回歸方程、方程斜率和回歸系數來驗證該方法的線性。直線回歸方程斜率應在1.00±0.15，R2應≥0.95。

符合相對準確度、精密度和線性要求時的活性水平即為該方法的范圍。

1.4.5 耐用性

1.4.5.1 抗原包被濃度

由同一實驗人員，采用120、100和80 ng/ml 3種抗原包被濃度，按照上述測定方法測定002理化對照品的相對結合活性。每種濃度包被1塊酶標板，每塊板制備1份參比品和2份100%水平的供試品，參比品和供試品均以復孔結果進行擬合作為一次結果，統(tǒng)計6次實驗結果的RSD。RSD應≤15%。

1.4.5.2 TMB顯色時間

由同一實驗人員，將TMB顯色時間分別設置15、20和25 min，按照上述測定方法測定002理化對照品的相對結合活性。每個TMB顯色時間1塊酶標板，每塊板制備1份參比品和2份100%水平的供試品，參比品和供試品均以復孔結果進行擬合作為一次結果，統(tǒng)計6次實驗結果的RSD。RSD應≤15%。

2 結果

2.1 方法的專屬性驗證

實驗結果顯示，002理化對照品有顯著的量效曲線，實驗結果擬合圖呈“S”曲線；002原液緩沖液和302理化對照品無量效曲線（圖1）。強制破壞樣本的相對結合活性為71%，相對于參比品呈下降趨勢（圖2，表1）。

2.2 方法的精密度驗證

對精密度驗證的結果進行統(tǒng)計分析，結果顯示，各水平的GCV值均在15%以內，符合可接受標準，證明該方法精密度良好（表2，表3）。

2.3 方法的相對準確度驗證

對相對準確度驗證的結果進行統(tǒng)計分析，結果顯示，各個水平的相對偏倚置信區(qū)間均在±12%范圍內（表4），各個水平的平均回收率均在80%～120%范圍內（表5）。兩種評判方法的相對準確度指標均符合可接受標準，證明該方法相對準確度良好。

2.4 方法的線性與范圍驗證

以相對準確度驗證中的5個水平實測值對數值（縱坐標）對每個理論值對數值（橫坐標）進行線性回歸，得回歸方程y=1.042 2x+0.006 5，方程斜率在1.00±0.15范圍內；回歸系數R2=0.990 8，不小于0.95。實驗結果顯示，在64%～156%水平范圍內，該方法的線性關系良好。

2.5 方法的耐用性驗證

耐用性驗證結果表明，兩組實驗實測值的相對標準偏差分別是2.9%和2.5%（表6，表7），說明方法的耐用性良好。

3 討論

抗體藥物對效價的評價主要包括結合活性測定和生物學活性測定。生物學活性測定方法主要包括基于細胞的生物活性測定方法（細胞增殖抑制法、細胞毒性法、補體依賴的細胞毒性法、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性法、細胞ELISA法等）、基于轉基因細胞生物活性測定方法及基于新技術的生物學活性測定方法（表面等離子共振效價測定法、均相時間分辨熒光、Alpha技術、熒光染料標記法）[17]。由于我司的重組抗CD25人源化單克隆抗體注射液（健尼哌）2011年就已經批準上市，當時并沒有開發(fā)出一個操作簡便、準確可靠、變異度小的生物學活性方法用于產品的批放行，而是用細胞膜表面表達CD25的人T淋巴瘤細胞系HUT-102作為靶細胞，用流式細胞技術檢測抗CD25抗體與抗原CD25親和力的方法作為產品的批放行檢測方法。該方法操作繁瑣、準確性差、變異度大，而且只能反映抗CD25抗體與細胞膜表面CD25之間的親和力，并不能真正反映抗體在體內的作用機制，因此可以用操作簡便、專屬性強、準確可靠的間接ELISA法代替。當然，結合活性測定方法只能評價抗體藥物與靶點分子在體外的相對親和力，當前評價藥效最常用的生物學活性測定方法應是開發(fā)轉基因細胞生物活性測定方法。因此，后續(xù)計劃構建轉基因工程細胞株，開發(fā)一個操作簡便、周期短、特異性好、變異度小的報告基因法用于產品批放行的生物學活性測定。

生物制品質量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學測定方法。理化分析方法的驗證與化學藥品基本相同，可參照《中國藥典》2015版三部通則<9101>“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”進行，在具體驗證時需要結合生物制品的特點具體考慮。而生物學測定方法相對于理化分析方法而言，存在更多的影響因素，由于通則<9101>并不涉及生物學測定方法驗證的內容，目前國內可參考的只有藥品審評中心發(fā)布的“生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則”，但此原則尚未在生物學活性測定的基礎上對方法驗證參數的含義和適用性進行清楚的闡述。而USP通則<1033>則是從生物學活性測定的角度來闡明生物檢定方法的驗證。因此，本文參考USP通則<1033>進行了方法驗證。

方法驗證結果顯示方法的專屬性、精密度、相對準確度以及線性與范圍各項指標均達到方法驗證的要求。因此本方法可用于重組抗CD25人源化單克隆抗體結合活性的測定。

參考文獻

[1] Asberg A， Midtvedt K， Line PD， et al. Calcineurin inhibitor avoidance with daclizumab， mycophenolate mofetil， and prednisolone in DR-matched de novo kidney transplant recipients[J]. Transplantation， 2006， 82（1）： 62-68.