黃慧娟 喬玉潔 吳劍英

摘 要 目的：建立眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的測(cè)定方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法：采用醋酸鈉和氯化十六烷基吡啶將樣品中的硫酸軟骨素沉淀，用氯化鈉溶液溶解后采用咔唑法測(cè)定硫酸軟骨素的含量。結(jié)果：方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，線性范圍為30.07～150.34 μg/ml，r為0.999 5；準(zhǔn)確度試驗(yàn)的9組樣品平均回收率為101.40%，RSD（n=9）為0.96%；精密度試驗(yàn)中，12份含量測(cè)試的平均值為102.1%，RSD（n=12）為1.22%；耐用性試驗(yàn)中，改變條件測(cè)得的結(jié)果與正常條件下測(cè)得的含量之比為99.9%～101.4%。結(jié)論：本研究的方法線性良好，準(zhǔn)確度、精密度和耐用性均符合標(biāo)準(zhǔn)，可用于眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 眼科粘彈劑 硫酸軟骨素 含量

中圖分類號(hào)：R988.1； R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）15-0113-03

Determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device

HUANG Huijuan1*， QIAO Yujie2， WU Jianying2**

（1. Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200231， China； 2. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device and to conduct methodological validation. Methods： The chondroitin sulfate in the sample was precipitated by sodium acetate and cetylpyridinium chloride， and then precipitate was dissolved in sodium chloride solution and the content of chondroitin sulfate was determined by carbazole method. Results： This method had good specificity with a linear range at 30.07-150.34 mg/ml and correlation coefficient （r） 0.999 5. The average recovery of the 9 groups of samples for accuracy test was 101.40% with RSD （n=9） 0.96%. The average value of 12 parts of samples for precision test was 102.1% with RSD （n=12） 1.22%. The ratio of the content determined under the changed condition to the content determined under normal conditions is 99.9% to 101.4% in the durability test. Conclusion： The method established in this study can be used for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device since its linearity， accuracy， precision and durability are in line with standards.

KEy WORDS ophthalmic viscosurgical device； chondroitin sulfate； content

白內(nèi)障是一種常見(jiàn)的眼科疾病，目前無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家白內(nèi)障致盲性均位居首位。在白內(nèi)障手術(shù)中，眼科粘彈劑是常見(jiàn)的手術(shù)輔助材料之一，目前國(guó)內(nèi)產(chǎn)品中眼科粘彈劑的主要成分大多為透明質(zhì)酸鈉，屬于內(nèi)聚性粘彈劑[1-3]。雖然內(nèi)聚性粘彈劑能維持良好的手術(shù)空間，但是高黏滯性和強(qiáng)黏彈性對(duì)手術(shù)操作過(guò)程和眼內(nèi)環(huán)境造成影響，易導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸鈉混合制備的彌散性眼科粘彈劑則能夠很好地貼覆于眼組織表面，從而更好地保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞不受損傷[4-5]。透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素均為酸性黏多糖，結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相似，因此當(dāng)兩者共存于制劑中時(shí)，其含量測(cè)定會(huì)相互干擾?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版二部采用HPLC法測(cè)定硫酸軟骨素含量，但是由于樣品中含有的透明質(zhì)酸鈉是大分子高黏度的化合物，不適合進(jìn)色譜柱。本研究首先用醋酸鈉調(diào)節(jié)樣品的pH，加入適量氯化十六烷基吡啶（CPC）選擇性地沉淀硫酸軟骨素，而透明質(zhì)酸鈉不被沉淀，從而將兩者有效分離，并參考《中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0308-2015醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠》中“透明質(zhì)酸鈉含量測(cè)定方法（咔唑法）”測(cè)定硫酸軟骨素含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器

Evoiution 260Bio紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；MS105DU分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

眼科粘彈劑（含透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素，上海建華精細(xì)生物制品有限公司自制，批號(hào)：180523，180530，180610）；硫酸軟骨素鈉（純度99.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140792-201702）；氯化十六烷基吡啶（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水醋酸鈉（特優(yōu)級(jí)，上海泰坦科技股份有限公司）；其余測(cè)試用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取眼科粘彈劑樣品適量，精密稱定，加蒸餾水稀釋至每1 ml溶液中含硫酸軟骨素1 mg，即得樣品溶液。精密量取樣品溶液10 ml置小燒杯中，加入醋酸鈉1.6 g，攪拌，使醋酸鈉溶解后，精密加入0.8%的氯化十六烷基吡啶溶液10 ml，充分?jǐn)嚢?，靜置2 h，用5 μm微孔濾膜通過(guò)抽濾濾過(guò)，過(guò)濾2次，將濾餅置小燒杯內(nèi)，加1.4 mol/L氯化鈉溶液約30 ml，超聲處理，將溶液定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，重復(fù)處理3次，稀釋至刻度，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取硫酸軟骨素對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加1.4 mol/L氯化鈉溶液溶解至刻度，搖勻，制成每1 ml含150 μg硫酸軟骨素，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 測(cè)定法

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml分別置于25 ml具塞試管中，依次分別加1.4 mol/L氯化鈉溶液至1.0 ml，混勻置于冰水浴中，分別緩慢加入0.025 mol/L四硼酸鈉硫酸溶液5.0 ml，邊加邊搖勻，密塞，沸水浴加熱15 min（中間振搖1次），迅速冷卻，加0.125%咔唑-無(wú)水乙醇溶液0.2 ml，搖勻，沸水浴加熱15 min（中間振搖1次），冷卻至室溫。以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液管為空白對(duì)照在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/ml）為x軸，其相應(yīng)的吸光度值為y軸作直線回歸，求得直線回歸方程。精密量取供試品溶液1 ml，置25 ml具塞試管中，自“冰水浴中冷卻”起，同法操作。由直線回歸方程計(jì)算硫酸軟骨素的濃度，并按樣品標(biāo)示濃度40 mg/ml計(jì)算樣品中硫酸軟骨素的含量。

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 線性

按1.3.2項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3項(xiàng)下求得直線回歸方程，得到線性方程為y=0.005 5x+ 0.017，r為0.999 5，符合r≥0.990的要求，線性良好，含量可測(cè)定范圍為30.07～150.34 μg/ml。

2.2 準(zhǔn)確度

取已知含量的硫酸軟骨素對(duì)照品適量，精密稱定，加入按產(chǎn)品處方比例配制不含硫酸軟骨素的溶液，使得硫酸軟骨素的濃度分別為0.8 mg/ml，1.0 mg/ml和1.2 mg/ml，按1.3.1項(xiàng)中“精密量取樣品溶液10 ml置小燒杯中”起同法操作制備供試品溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，按1.3.3項(xiàng)測(cè)定法測(cè)定硫酸軟骨素的含量，并計(jì)算回收率（表1）。

2.3 精密度

兩位研究員分別按1.3.1項(xiàng)下同時(shí)制備6份供試品溶液，按1.3.3項(xiàng)測(cè)定法測(cè)定硫酸軟骨素的含量，分別計(jì)算6組樣品檢測(cè)結(jié)果平均值和RSD值，并比較兩位研究員的檢測(cè)結(jié)果（表2）。

2.4 耐用性

在其他測(cè)定條件不變的情況下，測(cè)定方法發(fā)生微小變動(dòng)，考察該方法的耐用性。調(diào)整水解時(shí)間至方法規(guī)定的±2 min，調(diào)整最大吸收波長(zhǎng)至方法規(guī)定的±2 nm，并作隨行線性，測(cè)定硫酸軟骨素的含量（表3）。改變條件測(cè)得的結(jié)果與正常條件下測(cè)得的含量之比在99.9%～101.4%之間，均符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 樣品含量的檢測(cè)

采用該方法檢測(cè)3批自制樣品，批號(hào)為180523、 180530、180610的眼科粘彈劑硫酸軟骨素含量分別為101.6%、102.1%、101.3%。

3 討論

本研究通過(guò)參考文獻(xiàn)資料[6-10]，建立了咔唑法檢測(cè)眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的方法，選用醋酸鈉和氯化十六烷基吡啶使硫酸軟骨素沉淀，得到的濾餅采用氯化鈉溶液完全溶解后進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品采用硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法線性良好，準(zhǔn)確度、精密度和耐用性試驗(yàn)結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)。采用該方法檢測(cè)3批次自制樣品，硫酸軟骨素含量均符合標(biāo)準(zhǔn)。本研究試驗(yàn)方法穩(wěn)定，能準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中的硫酸軟骨素含量，可用于眼科粘彈劑產(chǎn)品硫酸軟骨素含量的測(cè)定。

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