李智瓊 孫承謀 朱玲娜 孔昌盛 喻葵

(1.宜昌市夷陵醫(yī)院檢驗科，湖北 宜昌 443100；2.荊門市第一人民醫(yī)院院感科，湖北 荊門 448000)

鼻咽癌(NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，具有獨特的地域和生物學(xué)特性，它在中國南方，東南亞流行。單發(fā)或多發(fā)頸部淋巴結(jié)腫大是其常見的臨床癥狀。鼻咽癌是一種高度放射敏感的腫瘤。放射療法是NPC主要治療手段；早期鼻咽癌總體生存率約為90%，70%患者初治時多為局部晚期或合并多出轉(zhuǎn)移，5年生存率通常較差。對于鼻咽癌的診斷和篩查包括了鼻咽鏡鏡檢和血漿中EBV-DNA檢測檢查。對于大多數(shù)非腫瘤?？漆t(yī)院，特別是中西部偏遠地區(qū)基層醫(yī)院中，EBV-DNA檢測，鼻咽鏡等難以推廣。因此，選擇鼻咽癌早期篩查和診斷的腫瘤標志物具有重要的意義。腫瘤異常糖蛋白(TAP)，又稱異常糖鏈糖蛋白，在腫瘤的即可釋放到組織液和體液中，當機體中腫瘤細胞達到1×108時，即可在末梢血液中檢測出；具有檢測方便、快速、無創(chuàng)等優(yōu)點。TAP的檢測在臨床甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌中已報告具有重要的臨床價值，在鼻咽癌中的報道尚不清楚。本文分析并比較TAP和EBV-DNA在正?；颊吆捅茄拾┒繖z測差異，并探討其在鼻咽癌臨床分期的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集宜昌市夷陵醫(yī)院院2010年1月至2017年12月140例患者作為觀察組，年齡23～75歲；男84例，女56例。所有患者按照第八版AJCC分級分期標準和世界衛(wèi)生組織2002標準進行分型 。其病理類型主要包括：角化型鱗狀細胞癌 23例(16.42%)，非角化型癌 99例(70.71%)，基底細胞鱗狀細胞癌 18例(12.67%)。TNM分期類型：140例患者中Ⅰ期5例(3.57%)，Ⅱ期19例(13.57%)，Ⅲ期83例(59.29%)，Ⅳ期33例(23.57%)。T1 7例，T2 76例，T3期 33例，T4期 24例；N0期 3例，N1期 44例，N2期 68例，N3期 25例；M0期 128例，M1期12例。同期選取本院健康體檢人群120名作為對照組，年齡2～65歲，其中男76名，女44名。本實驗得到醫(yī)院倫理委員會批準和受檢者的知情同意。

1.2儀器與試劑 EBV-DNA 檢測試劑盒購自廣東華銀醫(yī)藥科技有限公司，采用TapMan熒光探針基因聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增法，檢測方法參考試劑說明書。TAP檢測試劑盒(凝集法)及瑞生TAP檢測圖文系統(tǒng)標準版購自浙江瑞生醫(yī)療科技有限公司。

1.3方法 (1)DNA提取：分別取實驗組和對照組靜脈血2 mL，全血經(jīng)4℃ 12 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入DNA提取液并混勻，置于恒溫水浴箱中熱處理10 min(100 ℃)；靜置于冰盒中5 min，再次離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)EBV-DNA檢測：EBV-DNA定量測定采用熒光定量PCR法。熒光定量PCR擴增引物序列：F-5'-CGTAGATGGCCATATTTCAG-3; R-5-GTTTCTA-GCTGTAGTCACTCG-3。雙末端標記熒光探針5-(FAM)TACCACCGTCCGGAGA ATGC(TAMRA)-3。反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94℃ 2 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，4 ℃ 30 min，共35個循環(huán)。陽性定量標準品以EBV- DNA BamHI-W片段作為陽性模板，EBV-DNA水平大于1×10 copy/mL判斷為陽性，EBV- DNA水平小于或等于1×10 copy/mL判斷為陰性[5]。(3)TAP檢測：實驗組和對照組待檢者采集末梢血，規(guī)范手法擠血、采血。實驗組患者均為初診患者，采血前均未進行放療、化療、靶向治療、中藥抗腫瘤治療及其他物理腫瘤治療。每張玻片采血量20～30 μL，共制作2張。血片干燥后滴加TAP檢測試劑3滴(每滴約50 μL，液滴斑點直徑10～15 mm)，輕微搖晃保證使檢測劑均勻分布，常溫下靜置3 h使其充分反應(yīng)，血片形成圓形斑點提示顯色完成。TAP凝聚物是不規(guī)則的類圓形晶體顆粒，有晶體顆粒檢出為陽性，若無晶體顆粒檢出為陰性。此晶體顆粒因聚集的多少又可以呈現(xiàn)出不同的顏色，周圍混合物較多則呈現(xiàn)棕黑色或墨綠色，反之則呈現(xiàn)淡綠色、棕色或者淡黃色。將有可疑的斑點圖像轉(zhuǎn)用40×物鏡觀察，在瑞生TAP檢測圖文系統(tǒng)中采集>80 mm以上的特異凝集物為有效凝集顆粒，如果有效凝集顆粒數(shù)量為1顆，則檢測特異凝集物的結(jié)果為該顆粒實際面積大??；若有效凝集顆粒大于等于2顆，則檢測特異凝集物的最終數(shù)值就等于所有顆粒面積總和×0.62。TAP凝聚物結(jié)果：凝集物≥121～225 mm；提示TAP異常為陽性結(jié)果；凝集物<121 mm，則提示TAP正常為陰性結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。血清TAP陽性率和血漿EBV-DNA拷貝數(shù)陽性率采用非參數(shù)檢驗方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組檢測結(jié)果 實驗組血清TAP的陽性率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 血漿EBV-DNA陽性率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血清TAP的陽性率略高于血漿EBV-DNA陽性率，但二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組血清TAP和血漿EBV-DNA陽性率比較(%)

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2各組病理學(xué)檢測結(jié)果 在角化型鱗狀細胞癌和基底細胞鱗狀細胞癌組中，血清TAP的陽性率和血漿EBV-DNA陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在非角化型癌組中，血清TAP的陽性率與血漿EBV-DNA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清TAP和血漿EBV-DNA在鼻咽癌不同病理分期中陽性率比較[n(%)]

2.3血清TAP陽性率與鼻咽癌患者TNM分期的關(guān)系 隨著T分期、N分期、M分期的遞增，腫瘤患者血清TAP的陽性率逐步增加，在T1、T2期、N0、N1期中，血清TAP與血漿EBV-DNA陽性率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3、表4、表5。

表3 鼻咽癌患者不同T分期血清TAP和血漿EBV-DNA陽性率比較[n(%)]

表4 鼻咽癌患者不同N分期血清TAP和血漿EBV-DNA陽性率比較[n(%)]

表5 鼻咽癌患者不同M分期血清TAP和血漿EBV-DNA陽性率比較[n(%)]

2.4血清TAP陽性率與鼻咽癌患者臨床分級的關(guān)系 隨著分級的遞增，腫瘤患者血清TAP的陽性率逐步增加，在Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌中，血清TAP與血漿EBV-DNA陽性率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌中，血清TAP與血漿EBV-DNA陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同腫瘤分級中血清TAP和血漿EBV-DNA陽性率比較[n(%)]

3 結(jié) 論

鼻咽癌是EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤，目前臨床EB病毒感染的檢測主要包括了EBV相關(guān)的血清標記物，如VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNase和血漿EBV-DNA定量測定。這類方法的應(yīng)用具有一定的局限性：(1)不適合基層醫(yī)院的廣泛推廣；(2)對于鼻咽癌低發(fā)區(qū)域的鼻咽癌(非EB病毒感染相關(guān)鼻咽癌)早期診斷臨床價值欠佳。尋找其他腫瘤來源的標記物具有重要的臨床意義。致癌因子的刺激促進了原癌基因和抗癌基因的異常表達，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[6]。當致癌因子影響細胞核時，鈣組蛋白從DNA鏈中分離并釋放到血液中，因此，裸露的DNA容易受損，導(dǎo)致癌細胞的發(fā)生；另一種是糖鏈異常的糖蛋白，存在于細胞膜中，它是由突變基因產(chǎn)生的具有異常功能的糖蛋白[7]。TAP是異常糖蛋白、鈣組蛋白和基因在細胞癌變后表達的常見復(fù)合物。TAP檢測是一種借助于凝固劑的特異性檢測技術(shù)，通過凝固劑有助于腫瘤異常蛋白的聚集和特異性結(jié)晶顆粒的形成，且不含TAP物質(zhì)的人血標本不能形成結(jié)晶。

近年來，隨著國內(nèi)外研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)肝癌、乳腺癌、食管癌等上皮來源惡性腫瘤中TAP也呈高表達。有研究[8]結(jié)果顯示，TAP在肝臟腫瘤具有較高表達，陽性率為70.0%～95.0%；在消化系統(tǒng)腫瘤高危人群的篩查中，TAP陽性檢測特異度為97.7 % ，誤診率為2.3%；將其作為肝癌血清學(xué)檢測重要指標，對發(fā)現(xiàn)肝癌癌前病變有較高的靈敏度和特異性。臨床中，腫瘤標志物已應(yīng)用于腫瘤的術(shù)前分期、術(shù)后療效監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷。而在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，血清唾液酸含量在臨床影像診斷前數(shù)周升高，這對于早期發(fā)現(xiàn)和及時治療非常重要[9-10]。

本資料中，鼻咽癌患者血清TAP陽性率與T分期顯著相關(guān)，腫瘤T分期越高，血清TAP陽性率越高，T3期、T4 期患者血清TAP陽性率高于T2期和T1期患者，其機制為腫瘤分期越晚，釋放到體液和血液中的TAP越多，因此，其能夠間接反映腫瘤的復(fù)制程度。本實驗中鼻咽癌患者血清TAP陽性率與N分期有顯著相關(guān)性，隨著N分期的增加，患者血清TAP釋放越多，N0期血清TAP表達最低，N3期血清TAP表達最高。同時本實驗結(jié)果顯示，鼻咽癌患者血清TAP表達與M分期也密切相關(guān)，M1期血清TAP陽性率高于M0期，其機制可能是血清TAP與轉(zhuǎn)移的腫瘤負荷有關(guān)，血清TAP可能由腫瘤細胞釋放進入外周血，隨著病情的進展，血清TAP表達會相應(yīng)增加。

本實驗比較血清TAP與血漿EBV-DNA兩種檢測方法對鼻咽癌的診斷價值，結(jié)果顯示，對于Ⅰ和Ⅱ期患者，血清TAP具有高敏感性，同時在非EB病毒感染的鼻咽癌病理類型(角化型鱗狀細胞癌)中，血清TAP具有更高的敏感性(P<0.05)。對于Ⅲ期和Ⅳ期患者，血清TAP的高敏感性低于血漿EBV-DNA。與文獻報道TAP對早期腫瘤的診斷具有重要的臨床意義相一致。

綜上所述，對于廣大基層醫(yī)院，血清TAP檢測對早期鼻咽癌的篩查，具有效果好、價格便宜、準確率高和簡便易行等優(yōu)點，值得臨床推廣應(yīng)用。