陳鐘 何艷△ 周國(guó)強(qiáng) 周泉

(1.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

艾滋病(AIDS/HIV)合并馬爾尼菲青霉菌(penicillium marneffei，PM)感染是由于艾滋病患者免疫缺陷而導(dǎo)致的一種廣泛播散性感染，病死率較高，早期診斷和治療直接影響其預(yù)后[1-2]。馬爾尼菲青霉菌病(penicilliosis marneffei，PSM)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)主要是病原學(xué)培養(yǎng)，但血液病原培養(yǎng)陽(yáng)性率并不高而且費(fèi)時(shí)[3]；組織活檢可提高培養(yǎng)陽(yáng)性率，但為有創(chuàng)性操作結(jié)果也需要數(shù)天，臨床操作有一定難度，因此有必要建立一種簡(jiǎn)單快速的血清學(xué)檢測(cè)方法和指標(biāo)用于早期診斷HIV-PSM，本文擬通過(guò)檢測(cè)不同階段艾滋病患者血清中的腺苷脫氨酶酶(adenosine，ADA)及其同工酶(ADA1和ADA2)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transferase，AST)的活性；以探索早期診斷艾滋病合并馬爾內(nèi)菲青霉菌病的血清學(xué)指標(biāo)，以便早期治療改善預(yù)后。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 本研究納入2015年1月至2016年3月我院收治的艾滋病患者共158例，其中HIV感染組62例(無(wú)機(jī)會(huì)性感染)，其中男41例，女21例，年齡19～53歲，平均(32.51±5.23)歲；AIDS患者組43例(有機(jī)會(huì)性感染但非馬爾尼菲青霉菌)，其中男40例，女3例，年齡19-53歲，平均(31.47±7.12)歲；艾滋病合并馬爾尼菲青霉菌患者53例(HIV-PSM組)，其中男43例，女10例，年齡20～53歲，平均(37.94±11.25)歲；每例患者空腹靜脈采血10 mL，對(duì)HIV-PSM組患者治療2周后再次采血，分離血清存放于-20 ℃?zhèn)溆?。流式?xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞數(shù)量，RT-PCR檢測(cè)HIVRNA病毒載量；采用常規(guī)的酶偶聯(lián)速率法檢測(cè)腺苷脫氨酶(tADA)、腺苷脫氨酶的同工酶(ADA1和ADA2)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；同時(shí)，針對(duì)該53例的艾滋病合并馬爾內(nèi)菲青霉菌病患者，在經(jīng)診斷并接受同等時(shí)間治療后，繼續(xù)對(duì)各患者情況進(jìn)行跟蹤，結(jié)果有45例好轉(zhuǎn)，5例未愈，3例死亡，并對(duì)其中的50例樣本進(jìn)行采血跟蹤測(cè)定指標(biāo)。并采取擴(kuò)大樣本的方式測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)性、特異性和靈敏度。所有HIV患者均由當(dāng)?shù)厥』蚴屑?jí)疾病控制中心實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)報(bào)告，診斷標(biāo)準(zhǔn)按《國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》。本研究得到長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1CD4+T細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)和記錄 將患者靜脈血離心分離，將其細(xì)胞成分分裝于流式細(xì)胞儀專用管用于流式細(xì)胞儀(Accuri C6，BD，NJ in USA)進(jìn)行CD4+T細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

1.2.2AST和ALT的活性檢測(cè) 根據(jù)中山標(biāo)佳生物科技有限公司的AST試劑盒(速率法)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(速率法)的使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，配套儀器為深圳邁瑞公司的BS-400全自動(dòng)生化分析儀；參考值范圍：AST 12-39 U/L；ALT 7-48 U/L。

1.2.3馬爾尼菲青霉菌病的確認(rèn)檢查 (1)使用專用檢測(cè)PSM的培養(yǎng)瓶對(duì)住院合并機(jī)會(huì)性感染的AIDS患者采集靜脈血，置于梅里埃公司的BACT/ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，設(shè)置對(duì)照組，七天內(nèi)該系統(tǒng)將有菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)瓶進(jìn)行報(bào)警，即初步判定為PM陽(yáng)性組；(2)將報(bào)警的培養(yǎng)瓶中的PM陽(yáng)性結(jié)果菌群挑出，進(jìn)行沙氏平板實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)行PM二次確認(rèn)。

1.2.4tADA、ADA1和ADA2的檢測(cè) 采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定血清總ADA(即tADA是ADA1和ADA2之和)，正常參考值4～18 U/L。本研究中采用的是深圳邁瑞公司的BS-400全自動(dòng)生化分析儀，腺苷脫氨酶(總ADA)檢測(cè)試劑盒(AD7278)購(gòu)自上海執(zhí)誠(chéng)生物科技股份有限公司，按試劑盒說(shuō)明書操作。而對(duì)ADA1和ADA2的含量測(cè)定，是根據(jù)紅-9-(2-羥基-3-壬烷基)腺嘌呤(EHNA，0.1 mM)(58337-38-5，Minneapolis，USA)能完全抑制ADA1活性，而ADA2對(duì)EHNA 抑制作用不敏感[20]的原理，通過(guò)加入EHNA測(cè)定總ADA含量和ADA2含量，兩者相減即得到ADA1的含量。

2 結(jié) 果

2.1CD4+細(xì)胞數(shù)測(cè)定 由表1中測(cè)定所得CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)情況可知，在AIDS組中CD4+T細(xì)胞數(shù)比較高，平均值為1055.6個(gè)/μL，HIV感染組平均值為534.44個(gè)/μL，而HIV-PSM組的平均值為21.84個(gè)/μL；與HIV感染組相比，AIDS組和HIV-PSM組的CD4+細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)，且降低幅度較大；統(tǒng)計(jì)分析顯示：HIV-PSM組、AIDS組及HIV感染組之間均是差異顯著的(P<0.05)。

表1 AIDS組、HIV感染組和HIV-PSM組的對(duì)應(yīng)CD4+細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果分析

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較。

2.2各組血清中AST和ALT的活性檢測(cè)結(jié)果分析 血清AST和ALT的活性在AIDS組和HIV-PSM組中均有增加，如表2所示，但AST的改變更明顯；HIV-PSM組血清AST、AST活性明顯高于其他兩組(P均<0.05)，而ALT的變化差異不顯著，說(shuō)明結(jié)果指向性并不明顯。

組別nASTU/LtPALTU/LtPHIV感染組6213.2±2.15.122a0.037a22.5±3.415.627a0.289aAIDS組4324.9±4.08.141b0.022b34.8±5.37.364b0.126bHIV-PSM組53124.6±12.63.228c0.034c52.1±8.710.347c0.224c

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較。

2.3各組中tADA、ADA1和ADA2活性分析 tADA的值是ADA1和ADA2兩值之和，tADA在HIV-PSM組中明顯升高，其中以ADA2同工酶升高最明顯，且組間比較差異顯著(p均<0.05)，而ADA1同工酶的差異并不顯著(p>0.05)。見表3。

組別ntADAU/LtPADA2U/LtPADA1U/LtPHIV感染組624.9±1.210.341a0.046a1.5±1.46.384a0.048a3.4±0.95.322a1.237aAIDS組439.4±2.54.127b0.031b4.9±1.71.249b0.039b4.5±2.02.834b0.628bHIV-PSM組5331.7±17.92.834c0.044c26.1±12.84.571c0.042c5.1±8.56.924c0.640c

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較；數(shù)據(jù)是以平均值±SD的形式呈現(xiàn)的。

2.4tADA、ADA1、ADA2和AST在HIV-PSM患者治療前后的分析評(píng)價(jià) 治療后，HIV-PSM組患者tADA、ADA2及AST水平均下降，與治療前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1。

注：與治療前比較，**P<0.01。

圖1治療前后各指標(biāo)(tADA、ADA1、
ADA2和AST)的數(shù)值變化比較

2.5各指標(biāo)放大樣本后的相關(guān)性分析 由圖2A中的相關(guān)性分析圖可知，在所有的樣本中，包括HIV感染組、AIDS組及HIV-PSM組的所有數(shù)據(jù)，隨著樣本CD4+細(xì)胞數(shù)的上升，其tADA的活性是下降的，兩者呈負(fù)相關(guān)(R=-0.784，P=0.006)；同時(shí)，如圖2B所示，隨著樣本CD4+細(xì)胞數(shù)的上升，其ADA2的活性是下降的，亦呈負(fù)相關(guān)(R=-0.742，P=0.002)；而對(duì)ADA1活性與CD4+細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析顯示，兩者之間的反向相關(guān)性較低(R=-0.09，P<0.05)。另外，如圖2C所示，發(fā)現(xiàn)隨著樣本tADA活性上升，ADA2活性亦增加，兩者呈正相關(guān)(R=0.957，P=0.045)；而ADA1活性與tADA活性的相關(guān)性亦較低，此處并未將數(shù)據(jù)展示出來(lái)。由上圖數(shù)據(jù)綜合分析，tADA與ADA2的樣本相關(guān)性相對(duì)較高，而tADA與ADA1的相關(guān)性卻較低。最后，如圖2D所示，隨著樣本中AST活性上升的趨勢(shì)tADA的活性也在逐步增加，圖中趨勢(shì)顯示是顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.891(P=0.019)。

注：A.HIV所有感染患者樣本中CD4+細(xì)胞數(shù)與tADA活性的相關(guān)性；B.HIV所有感染患者樣本中CD4+細(xì)胞數(shù)與ADA2活性的相關(guān)性；C.HIV所有感染患者樣本中tADA活性與ADA2活性的相關(guān)性D)HIV所有感染患者樣本中tADA活性與AST活性的相關(guān)性。

圖2指標(biāo)在樣本檢測(cè)中的相關(guān)性分析

2.6特異性和靈敏度分析 tADA、ADA2及AST三個(gè)指標(biāo)在非HIV-PSM與HIV-PSM樣本中的AUC值均在0.81～0.89之間。tADA、ADA2及AST的ROC下面區(qū)域分別為0.870、0.885和0.810。tADA的特異性和靈敏度分別為80%、80%；ADA2的特異性和靈敏度亦分別為90%、80%；AST的則為100%、70%，在此特異性和靈敏度條件下對(duì)應(yīng)的tADA、ADA2及AST臨界值(當(dāng)Youden指數(shù)最大時(shí)確定診斷最佳臨界值)分別為： 28.5 U/L、19.4U/L和115.9 U/L。

注：A：tADA的ROC曲線；B：ADA2的ROC曲線；C：AST的ROC曲線。

圖3tADA、ADA2和AST的ROC曲線

3 討 論

近年來(lái)，由于全球艾滋病感染者不斷增加，馬爾內(nèi)菲青霉菌病發(fā)病率也呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。由于馬爾內(nèi)菲青霉菌病具有較高的病死率，如果患者未得到準(zhǔn)確的診斷和及時(shí)治療，播散型的PSM病死率可超過(guò)75%[1]。早期診斷無(wú)特殊生化指標(biāo)，確診需要病原學(xué)檢測(cè)，而病原學(xué)檢測(cè)耗時(shí)，有可能延誤最佳治療時(shí)機(jī)[2]，因此有必要建立一套早期診斷的指標(biāo)，以便及時(shí)治療以改善預(yù)后。

tADA是嘌呤核苷分解代謝過(guò)程中的可特異性催化水解核苷生成肌苷和氨的一種重要酶類，包括兩種同工酶：ADA1和ADA2，其在體內(nèi)分布較普遍，主要存在于實(shí)質(zhì)器官、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞中。正常情況下，血清中tADA主要來(lái)源于肝臟，當(dāng)肝細(xì)胞損傷壞死或膜通透性增加時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)tADA釋放入血引起tADA活性增加，可作為一種反應(yīng)肝細(xì)胞損害、肝纖維化的指標(biāo)[3]；但是，由于在單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞中tADA活性較血清更高[4]，其tADA是淋巴細(xì)胞增殖與分化及單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞過(guò)程中所必需的，tADA缺陷可導(dǎo)致原發(fā)性免疫缺陷病，因而被認(rèn)為是細(xì)胞免疫的指標(biāo)[5-6]，故臨床上tADA的變化可能與免疫性疾病的關(guān)系更為密切。有文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，在肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎患者血清及胸膜腔中的tADA活性增高，認(rèn)為與細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)、淋巴細(xì)胞增多有關(guān)；但在某些免疫缺陷的疾病中，亦發(fā)現(xiàn)有tADA的升高，說(shuō)明ADA活性高低，并不完全與免疫功能的強(qiáng)弱及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)一致。原因可能是標(biāo)準(zhǔn)的tADA檢測(cè)的是tADA的活性(有氨顯色法和氨偶聯(lián)酶測(cè)定法)，而不是數(shù)量，活性與數(shù)量不完全成正比，因此只有當(dāng)T細(xì)胞受到抗原刺激激活或快速增殖時(shí)，tADA活性水平才會(huì)明顯增高[9]。而在肺結(jié)核及AIDS感染者中，tADA升高時(shí)，CD4+T淋巴細(xì)胞減少而CD8+T淋巴細(xì)胞增加[10]，且發(fā)現(xiàn)tADA升高是以ADA2為主[11]，而在本研究中，HIV-PSM組血清tADA升高亦是以ADA2升高為主，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)锳DA2主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活與淋巴細(xì)胞數(shù)量變化不一致情況下亦可能出現(xiàn)tADA的升高[12]。

馬爾內(nèi)菲青霉菌病是由于馬爾尼菲青霉菌(PM)感染所致，而PSM主要寄生于巨噬細(xì)胞，并可隨血液運(yùn)送到單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。在免疫功能正常者，巨噬細(xì)胞被T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子激活而使PSM感染得到控制；而在HIV/AIDS患者由于免疫功能低下，體內(nèi)CD4+T細(xì)胞減少，巨噬細(xì)胞不能及時(shí)吞噬和殺滅入侵的PM孢子，致使PM在體內(nèi)迅速繁殖，巨噬細(xì)胞變性壞死造成該菌在體內(nèi)廣泛播散，引發(fā)播散型PSM[13-14]。由于馬爾內(nèi)菲青霉菌喜嗜濕熱環(huán)境，因而我國(guó)南方或東南亞可能更多見，文獻(xiàn)報(bào)道，該病在越南的患病率是4.4%[15]，在中國(guó)香港的患病率是14%[16]，但是中國(guó)大陸鮮有報(bào)道。除環(huán)境因素、季節(jié)性變化外，最主要的是患者CD4+T細(xì)胞數(shù)減少，通常小于200個(gè)/μL的AIDS患者其患PSM的風(fēng)險(xiǎn)更高，本文結(jié)果就提示HIV-PSM組患者的CD4+T細(xì)胞數(shù)僅僅21個(gè)/μL左右。ADA活性變化是否與CD4+T細(xì)胞數(shù)及機(jī)會(huì)性感染密切相關(guān)呢？有研究[17]報(bào)道，HIV陽(yáng)性患者血清中ADA的活性可能有一個(gè)很明顯的上升趨勢(shì)，但是ADA或ADA1和ADA2同工酶在HIV合并PSM患者中的變化情況卻很少報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在HIV感染不同階段，隨著CD4+T細(xì)胞數(shù)逐漸減少，患者出現(xiàn)機(jī)會(huì)性感染的幾率越高，尤其是PSM，而且ADA(ADA2)和AST活性亦隨之升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著HIV-PSM治療轉(zhuǎn)歸好轉(zhuǎn)，ADA(ADA2)和AST活性亦隨之下降，說(shuō)明ADA(ADA2)和AST活性與HIV感染的疾病進(jìn)程和機(jī)會(huì)性感染密切相關(guān)，尤其是HIV-PSM患者。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，上述三個(gè)指標(biāo)具有較好的相關(guān)性和較高的靈敏度和特異性；進(jìn)而在此特異性和靈敏度條件下對(duì)應(yīng)的tADA、ADA2及AST臨界值(當(dāng)Youden指數(shù)最大時(shí)確定診斷最佳臨界值)分別為： 28.5 U/L、19.4U/L和115.9 U/L。因此，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)摸索，可以初步推斷這些指標(biāo)(tADA、ADA2及AST)有可能成為HIV-PSM早期診斷的血清學(xué)指標(biāo)，以輔助臨床早期診斷治療及改善預(yù)后。但本研究?jī)H為單指標(biāo)探索性診斷研究，初步發(fā)現(xiàn)血清幾個(gè)常見指標(biāo)在HIV/AIDS合并PSM早期診斷中具有潛在價(jià)值，今后尚需擴(kuò)大樣本及綜合更多指標(biāo)進(jìn)行更深入探索。