孫習英 褚明亮 張赟 易韋 楊文秀

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004)

1 材料與方法

1.1材料 整理并統(tǒng)計2013年5月至2018年5月貴州省人民醫(yī)院就診并經細胞學、病理確診為腸癌的患者450例臨床資料；另外，收集2016年9月至2018年3月貴州省人民醫(yī)院病理科存檔的十二指腸癌術后蠟塊標本10例和結腸癌術后蠟塊標本56例，從中選取20例癌旁非癌十二指腸組織和22例癌旁非癌結腸組織(距癌組織大于5 cm)資料，患者術前均未接受任何化療和放療，收集同期存檔的15例正常空腸組織、10例正常回腸組織、20例正常闌尾組織、18例正常盲腸組織和15例正常直腸組織。所有標本相關臨床資料完整。

1.2方法 先采用HE染色對收集的石蠟標本進行常規(guī)染色，在證實標本后采用免疫組化方法染色檢測PARP6(1∶300，NBP1-8733，Novus Biologicals)、Survivin(1∶100;ZA-0530，ZSGB-BIO)和ki-67(1∶200;ZM-0165，ZSGB-BIO)的表達水平。免疫組化方法：石蠟切片置于67 ℃烤箱中，烘片2 h，脫蠟至水，PBS洗三次，取檸檬酸鹽緩沖液進行微波修復，加H2O2室溫孵育10 min，PBS洗三次，加一抗4℃過夜，PBS沖洗三次，加二抗。室溫下DAB顯色試劑顯色，蘇木精復染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍化，切片經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干觀察。陰性對照為PBS代替一抗。

1.3陽性結果判定標準 顯微鏡下采用雙盲法閱片，選用5個高倍視野分別觀察PARP6、Survivin和ki-67的表達情況，其中陽性染色部位呈棕黃色或棕褐色顆粒，PARP6、ki-67蛋白主要定位于細胞核，Survivin蛋白主要定位于細胞漿。評定標準如下：先按陽性細胞比例將0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0～4分；再按著色強度將無、黃色、棕黃色、黃褐色分別計為0～3分；最后綜合兩者相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。(+)、(++)、(+++)分別視為輕度陽性、中度陽性和強陽性。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1構成比 2013—2018年貴州省人民醫(yī)院病理科確診為大腸癌的發(fā)病人數427例，確診為小腸癌的發(fā)病人數為23例。前者構成比(94.9%)明顯高于后者(5.1%)。見表1。

表1 近5年貴州省人民醫(yī)院腸癌一般臨床資料

2.2PARP6、Survivin、ki-67在正常腸組織中的表達 三者在大腸和小腸組織中的表達均呈不同程度陽性，其中PARP6、ki-67蛋白主要定位于細胞核，Survivin蛋白主要定位于細胞漿(圖1、圖2)，其中少量PARP6、Survivin、ki-67主要表達于正常小腸黏膜(空腸、回腸、十二指腸)腸絨毛和正常大腸黏膜(結腸、闌尾、盲腸、直腸)的腺上皮中；三個細胞因子在正常大腸組織中的強陽性率顯著高于正常小腸組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 PARP6、Survivin和ki-67在正常大場組織中的表達(×100)

圖2 PARP6、Survivin和ki-67在正常小腸組織中的表達(×100)

表2 PARP6、Survivin和ki-67在正常腸組織中的表達(n)

2.3腸癌組織中PARP6、Survivin和ki-67的表達 三者在腸癌組織中的表達均呈不同程度陽性。PARP6、ki-67蛋白主要定位于細胞核，Survivin蛋白主要定位于細胞漿(圖3)；結腸癌組織中PARP6、Survivin和ki-67的強陽性率顯著高于十二指腸腺癌組織(P<0.05)。見表3。

表3 PARP6、Survivin和ki-67在腸癌中的表達(n)

圖3 PARP6、Survivin和ki-67在腸癌中的表達(×100)

3 討 論

近年來，大腸癌已成為我國常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率遠遠高于小腸癌，雖發(fā)病原因和機制仍不清楚，但有相關文獻報告細胞凋亡和增殖與腸癌的發(fā)生有著密切聯系[16]。

PARP多聚酶屬于蛋白酶家族，其中包括PARP1～4、PARP5α、PARP5β和PARP6～16，其中PARP6是最近發(fā)現的成員，參與DNA修復和細胞凋亡。有研究發(fā)現PARP6在結直腸腺癌組織中陽性率較低，并且在結直腸癌組織中的陽性表達與腫瘤的分化程度、腫瘤分期和淋巴結轉移密切相關，分別與增殖核抗原ki-67和凋亡抑制因子Survivin呈負相關性[17-18]；然而最新一項研究發(fā)現結直腸腺癌組織中Survivin與PARP6兩者為高表達，且PARP6與Survivin之間存在正相關性[19]，與前述結果相反。

Survivin是細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中結構獨特的新成員，分子量最小，僅含有一個單獨的桿狀病毒IAP重復序列(BIR)結構[20]。研究還發(fā)現Survivin的表達可以促進腫瘤微血管的增生，從而增加腫瘤的惡性程度[21]。Survivin可以通過阻斷caspase蛋白的活性而抑制細胞凋亡途徑，并參與調節(jié)細胞周期和促進細胞增殖[22]。Survivin在正常的成人組織中是無法檢測到的，但在胚胎組織和多種惡性腫瘤組織中則呈現為高表達，比如結直腸癌[23]。有人發(fā)現通過抑制Survivin誘導細胞凋亡的方法可治療結腸癌[24]。

ki-67可用來評估乳腺癌、食管癌、結直腸癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細胞的增殖活性，在細胞G1、S、G2和M期穩(wěn)定表達，而在靜止期(G0)不表達[25]。有資料表明，與正常組織相比，ki-67在大腸癌組織中的表達明顯上調[26]。

本實驗通過統(tǒng)計腸癌患者人數，結果顯示大腸癌的構成比遠遠高于小腸癌；一方面，免疫組化結果顯示PARP6、Survivin和ki-67在正常的腸組織和腸癌組織中都呈陽性表達；另一方面，三者在正常大腸組織和結腸癌組織中的強陽性率明顯高于正常小腸組織和十二指腸腺癌組織；進一步檢測三者在腸癌組織中的表達情況，發(fā)現PARP6、Survivin和ki-67在結腸癌組織中的強陽性率明顯高于十二指腸腺癌。由此推測，大腸癌的構成比高于小腸癌的原因可能與PARP6、Survivin和ki-67在正常大腸組織中的高表達有關；并且三個因子可能通過調控細胞增殖和細胞凋亡的過程參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展，其可望成為腸癌診斷、預后評估的新靶點和治療的新靶向。