孫習(xí)英 褚明亮 張赟 易韋 楊文秀

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004)

1 材料與方法

1.1材料 整理并統(tǒng)計(jì)2013年5月至2018年5月貴州省人民醫(yī)院就診并經(jīng)細(xì)胞學(xué)、病理確診為腸癌的患者450例臨床資料；另外，收集2016年9月至2018年3月貴州省人民醫(yī)院病理科存檔的十二指腸癌術(shù)后蠟塊標(biāo)本10例和結(jié)腸癌術(shù)后蠟塊標(biāo)本56例，從中選取20例癌旁非癌十二指腸組織和22例癌旁非癌結(jié)腸組織(距癌組織大于5 cm)資料，患者術(shù)前均未接受任何化療和放療，收集同期存檔的15例正?？漳c組織、10例正?；啬c組織、20例正常闌尾組織、18例正常盲腸組織和15例正常直腸組織。所有標(biāo)本相關(guān)臨床資料完整。

1.2方法 先采用HE染色對(duì)收集的石蠟標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)染色，在證實(shí)標(biāo)本后采用免疫組化方法染色檢測(cè)PARP6(1∶300，NBP1-8733，Novus Biologicals)、Survivin(1∶100;ZA-0530，ZSGB-BIO)和ki-67(1∶200;ZM-0165，ZSGB-BIO)的表達(dá)水平。免疫組化方法：石蠟切片置于67 ℃烤箱中，烘片2 h，脫蠟至水，PBS洗三次，取檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行微波修復(fù)，加H2O2室溫孵育10 min，PBS洗三次，加一抗4℃過夜，PBS沖洗三次，加二抗。室溫下DAB顯色試劑顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干觀察。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。

1.3陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡下采用雙盲法閱片，選用5個(gè)高倍視野分別觀察PARP6、Survivin和ki-67的表達(dá)情況，其中陽性染色部位呈棕黃色或棕褐色顆粒，PARP6、ki-67蛋白主要定位于細(xì)胞核，Survivin蛋白主要定位于細(xì)胞漿。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如下：先按陽性細(xì)胞比例將0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計(jì)為0～4分；再按著色強(qiáng)度將無、黃色、棕黃色、黃褐色分別計(jì)為0～3分；最后綜合兩者相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。(+)、(++)、(+++)分別視為輕度陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1構(gòu)成比 2013—2018年貴州省人民醫(yī)院病理科確診為大腸癌的發(fā)病人數(shù)427例，確診為小腸癌的發(fā)病人數(shù)為23例。前者構(gòu)成比(94.9%)明顯高于后者(5.1%)。見表1。

表1 近5年貴州省人民醫(yī)院腸癌一般臨床資料

2.2PARP6、Survivin、ki-67在正常腸組織中的表達(dá) 三者在大腸和小腸組織中的表達(dá)均呈不同程度陽性，其中PARP6、ki-67蛋白主要定位于細(xì)胞核，Survivin蛋白主要定位于細(xì)胞漿(圖1、圖2)，其中少量PARP6、Survivin、ki-67主要表達(dá)于正常小腸黏膜(空腸、回腸、十二指腸)腸絨毛和正常大腸黏膜(結(jié)腸、闌尾、盲腸、直腸)的腺上皮中；三個(gè)細(xì)胞因子在正常大腸組織中的強(qiáng)陽性率顯著高于正常小腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 PARP6、Survivin和ki-67在正常大場組織中的表達(dá)(×100)

圖2 PARP6、Survivin和ki-67在正常小腸組織中的表達(dá)(×100)

表2 PARP6、Survivin和ki-67在正常腸組織中的表達(dá)(n)

2.3腸癌組織中PARP6、Survivin和ki-67的表達(dá) 三者在腸癌組織中的表達(dá)均呈不同程度陽性。PARP6、ki-67蛋白主要定位于細(xì)胞核，Survivin蛋白主要定位于細(xì)胞漿(圖3)；結(jié)腸癌組織中PARP6、Survivin和ki-67的強(qiáng)陽性率顯著高于十二指腸腺癌組織(P<0.05)。見表3。

表3 PARP6、Survivin和ki-67在腸癌中的表達(dá)(n)

圖3 PARP6、Survivin和ki-67在腸癌中的表達(dá)(×100)

3 討 論

近年來，大腸癌已成為我國常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小腸癌，雖發(fā)病原因和機(jī)制仍不清楚，但有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告細(xì)胞凋亡和增殖與腸癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系[16]。

PARP多聚酶屬于蛋白酶家族，其中包括PARP1～4、PARP5α、PARP5β和PARP6～16，其中PARP6是最近發(fā)現(xiàn)的成員，參與DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)PARP6在結(jié)直腸腺癌組織中陽性率較低，并且在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)與腫瘤的分化程度、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，分別與增殖核抗原ki-67和凋亡抑制因子Survivin呈負(fù)相關(guān)性[17-18]；然而最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌組織中Survivin與PARP6兩者為高表達(dá)，且PARP6與Survivin之間存在正相關(guān)性[19]，與前述結(jié)果相反。

Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員，分子量最小，僅含有一個(gè)單獨(dú)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)結(jié)構(gòu)[20]。研究還發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤微血管的增生，從而增加腫瘤的惡性程度[21]。Survivin可以通過阻斷caspase蛋白的活性而抑制細(xì)胞凋亡途徑，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]。Survivin在正常的成人組織中是無法檢測(cè)到的，但在胚胎組織和多種惡性腫瘤組織中則呈現(xiàn)為高表達(dá)，比如結(jié)直腸癌[23]。有人發(fā)現(xiàn)通過抑制Survivin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法可治療結(jié)腸癌[24]。

ki-67可用來評(píng)估乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活性，在細(xì)胞G1、S、G2和M期穩(wěn)定表達(dá)，而在靜止期(G0)不表達(dá)[25]。有資料表明，與正常組織相比，ki-67在大腸癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)[26]。

本實(shí)驗(yàn)通過統(tǒng)計(jì)腸癌患者人數(shù)，結(jié)果顯示大腸癌的構(gòu)成比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小腸癌；一方面，免疫組化結(jié)果顯示PARP6、Survivin和ki-67在正常的腸組織和腸癌組織中都呈陽性表達(dá)；另一方面，三者在正常大腸組織和結(jié)腸癌組織中的強(qiáng)陽性率明顯高于正常小腸組織和十二指腸腺癌組織；進(jìn)一步檢測(cè)三者在腸癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PARP6、Survivin和ki-67在結(jié)腸癌組織中的強(qiáng)陽性率明顯高于十二指腸腺癌。由此推測(cè)，大腸癌的構(gòu)成比高于小腸癌的原因可能與PARP6、Survivin和ki-67在正常大腸組織中的高表達(dá)有關(guān)；并且三個(gè)因子可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的過程參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展，其可望成為腸癌診斷、預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)和治療的新靶向。