楊麗姝 郭煥男 王正瑤 韓波△

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省農(nóng)墾總局總醫(yī)院腫瘤三科，黑龍江 哈爾濱 150088；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院護(hù)理支持中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界第三大癌癥相關(guān)死亡原因。早期診斷、早期治療是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的重要因素，如果能夠早期發(fā)現(xiàn)，治愈率可能達(dá)到100%。但目前缺乏一種有效的篩查方法。已有研究證實(shí)，大腸癌危險(xiǎn)與遺傳因素有關(guān)，約占疾病病因的35%[1]。近年來(lái)，一些全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)了與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因位點(diǎn)，包括8q24、8q23.3、10p14、11q23、15q13、18q21等基因變異[2]。非編碼RNA(ncRNAs)分為microRNAs(約22個(gè)核苷酸)和lncRNAs(長(zhǎng)鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，不作為蛋白質(zhì)模板)[3]。lncRNAs作為一種新興的非編碼RNA，因其生物調(diào)控功能而受到廣泛關(guān)注[4]。有人提出，lncRNAs可以通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)的修飾[5]、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工[6-7]等途徑調(diào)控基因的表達(dá)，從而在不同的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮多種功能，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)可影響基因表達(dá)或蛋白質(zhì)功能。多項(xiàng)研究[8-10]表明，一些lncRNAs中的單核苷酸多態(tài)性與癌癥的發(fā)生和化療敏感性有關(guān)。癌癥易感性候選8(casc8)基因是定位在8號(hào)染色體(8q24.21)上的lncRNA[11]，位于lncRNA-casc8基因的內(nèi)含子中的rs10505477變異已被證實(shí)與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)[12-14]和胃癌預(yù)后有關(guān)。本文將重點(diǎn)討論染色體8q24 C等位rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷、早期治療及判斷預(yù)后提供新的思路和手段。

1 對(duì)象與方法

1.1一般資料 病例組選自2008年1月至2010年9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為結(jié)直腸癌的患者共390例，排除家族性腺瘤性息肉病和遺傳性結(jié)直腸癌；對(duì)照組為同一時(shí)期本院健康體檢的人群，均證實(shí)身體健康，共398名。病例組和對(duì)照組無(wú)年齡、性別的限制，并證實(shí)均為無(wú)親緣關(guān)系；正常對(duì)照組在年齡、性別等方面與病例頻數(shù)匹配。研究對(duì)象簽署知情同意書后，采用統(tǒng)一的流行病學(xué)調(diào)查問(wèn)卷，記錄年齡、性別、吸煙史(根據(jù)WHO的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，一生中連續(xù)或累計(jì)吸煙6個(gè)月或以上為吸煙)、飲酒史(1周至少飲酒1次、累計(jì)時(shí)間1年以上者定義為有飲酒史，未達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)為不飲酒者)、腫瘤家族史(一級(jí)親屬和/或二級(jí)親屬患有癌癥者定義為有癌癥家族史，否則就定義為無(wú))。分別抽取病例組和健康對(duì)照組清晨外周靜脈血2mL，EDTANa抗凝，用于PCR檢測(cè)。

1.2PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)rs10505477基因 采用DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)，提取樣本總DNA。PCR(PCR試劑購(gòu)自Takara公司)擴(kuò)增含有rs10505477(T>C)位點(diǎn)的目標(biāo)片段：上游引物5′-GGAAGAATTTAAAGGAGAGCAGGGA -3′，下游引物5′-CTTTGCCCCTTTTCTAAAT-CTTCATCTgC-3′[15](南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Promega公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物應(yīng)用1 μL PstI限制性內(nèi)切酶(Fermentas公司)進(jìn)行酶切，PCR擴(kuò)增片段為228 bp，C等位基因酶切后互補(bǔ)鏈產(chǎn)生兩個(gè)片段(200 bp和28 bp)，T等位基因互補(bǔ)鏈未被酶切(228 bp片段)，雜合子會(huì)出現(xiàn)三條片段(228 bp、200 bp和28 bp)。酶切產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較結(jié)直腸癌組和對(duì)照組的人口學(xué)數(shù)據(jù)、基因型以及等位基因的頻數(shù)分布，計(jì)算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)，分析各基因型與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。以擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)計(jì)算SNP位點(diǎn)各基因型在對(duì)照組中的分布是否符合Hardy-Weinberg哈迪—溫伯格遺傳平衡定律(HWE)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 結(jié)直腸癌組和對(duì)照組比較，年齡、性別、吸煙、飲酒及腫瘤家族史分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組和對(duì)照組一般情況的比較[n(%)]

2.28q24 C等位rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系 對(duì)照組中8q24 C等位rs10505477基因(5’-UTR T>C)各基因型分布頻率符合HWE定律(χ2=0.071，P>0.5)。χ2檢驗(yàn)顯示rs10505477 T基因型(TC+TT)患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于rs10505477 CC基因型的個(gè)體(OR=1.089，95%CI=1.011～1.174)。見(jiàn)表2。

表2 rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[n(%)]

2.3分層分析 按年齡、性別、吸煙史、飲酒史和腫瘤家族史進(jìn)行進(jìn)一步的分層分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)在年齡≤60歲、不吸煙、不飲酒及無(wú)腫瘤家族史的亞組中有顯著相關(guān)性(OR=1.129，95%CI=1.028～1.241)，P=0.011；OR=1.184，95%CI=1.042～1.345，P=0.009；OR=1.096，95%CI=1.007～1.194，P=0.034；OR=1.112，95%CI=1.016～1.216，P=0.021)；而在年齡>60歲、有吸煙史、飲酒史和有腫瘤家族史的人群中未見(jiàn)顯著相關(guān)；未見(jiàn)rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和性別相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的分層分析

3 討 論

盡管lncRNAs的功能和作用到目前為止仍然難以確定，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，在人類基因組中，高達(dá)90%的非編碼轉(zhuǎn)錄物具有重要的和多樣的生物學(xué)作用[16]。多項(xiàng)研究[17-19]提示lncRNA的異常表達(dá)具有潛在的腫瘤抑制或致癌作用。

SNP rs10505477改變癌癥風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者提出了一些假設(shè)。首先，rs10505477位于lncrna-casc8的內(nèi)含子區(qū)域，Ma等[11]假設(shè)它可能通過(guò)改變casc8的折疊結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其表達(dá)失調(diào)來(lái)影響其功能；其次，casc8與pou5f1b是同源基因，而pou5f1b是公認(rèn)的腫瘤易感性基因，rs10505477等位基因可能通過(guò)與某些pou5f1b基因的轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)改變casc8與pou5f1b之間的相互作用[20]。有報(bào)道rs10505477基因多態(tài)性還可能與前列腺癌、肺癌[21]、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病率相關(guān)；與胃切除術(shù)后接受順鉑化療的胃癌患者的生存率相關(guān)。

在本研究中，rs10505477 T基因型(TC+TT)患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于rs10505477 CC基因型的個(gè)體，提示rs10505477的遺傳變異與結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，在年齡≤60歲病例和對(duì)照組中，這種風(fēng)險(xiǎn)似乎更大。這與Stephen B.Gruber等的報(bào)道[12]一致。在本研究中還發(fā)現(xiàn)rs10505477基因多態(tài)性在無(wú)吸煙史、無(wú)飲酒史及無(wú)腫瘤家族史的亞組中與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別具有相關(guān)性，而在有吸煙史、飲酒史及有腫瘤家族史的亞組中未見(jiàn)其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，此前的研究未見(jiàn)類似報(bào)道。我們猜測(cè)，rs10505477 CC基因型對(duì)于不發(fā)生結(jié)直腸癌的保護(hù)性影響可能因吸煙、飲酒及有腫瘤家族史而減小，這有待于更大樣本量的研究證實(shí)。此外，我們還需要進(jìn)一步研究證實(shí)rs10505477基因多態(tài)性是否會(huì)影響結(jié)直腸癌對(duì)于化療的反應(yīng)、是否對(duì)于結(jié)直腸癌的預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)作用。

總之，rs10505477基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高呈顯著相關(guān)，基因型(TC+TT)是罹患結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素。