宗媛，高彩霞

堿基編輯系統(tǒng)研究進展

宗媛，高彩霞

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細胞與染色體工程國家重點實驗室，基因組編輯中心，北京 100101

堿基編輯技術(shù)(base editing)是基于CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展起來的新型靶基因修飾技術(shù)，目前依據(jù)堿基修飾酶的不同可分為胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)。這兩類堿基編輯系統(tǒng)利用胞嘧啶脫氨酶或人工進化的腺嘌呤脫氨酶對靶位點進行精準的堿基編輯，最終可以分別實現(xiàn)C-T (G-A)或A-G (T-C)的堿基替換。堿基編輯技術(shù)自2016年被開發(fā)以來，因其高效、不依賴DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生、無需供體DNA參與等優(yōu)勢，已經(jīng)成功應(yīng)用在各種動物、植物及其他生物中，為基因治療及精準作物育種等領(lǐng)域提供了重要技術(shù)支撐。本文從堿基編輯技術(shù)的特點、開發(fā)過程、優(yōu)化、應(yīng)用、脫靶效應(yīng)及改善策略等方面進行了系統(tǒng)介紹，最后對未來需要迫切解決的一些問題進行了分析和展望，以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研人員進一步了解、使用及優(yōu)化堿基編輯系統(tǒng)提供參考。

CRISPR/Cas；堿基編輯技術(shù)；胞嘧啶堿基編輯器(CBE)；腺嘌呤堿基編輯器(ABE)

如何精準、高效地對基因組進行修飾是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要目標。近年來，基因組編輯技術(shù)尤其是CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)成為實現(xiàn)該目標的最強工具[1~7]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在sgRNA引導(dǎo)下招募Cas9蛋白靶向基因組DNA，從而在靶點處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)，誘發(fā)細胞內(nèi)非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)修復(fù)途徑，進而實現(xiàn)對基因組DNA的定點敲除、替換、插入等精準修飾[8]。其中，NHEJ途徑發(fā)生頻率較高，但通常是一種不精確的修復(fù)方式，往往會在靶點處產(chǎn)生少量堿基的插入或缺失(insertions/deletions, Indels)，是一種有效地創(chuàng)制基因敲除突變體的途徑。HR途徑是一種更為精確的修復(fù)方式，需要人為提供與基因組DNA具有同源序列的供體DNA，以供體DNA為模板進行重組修復(fù)，最終實現(xiàn)精準的基因定點替換或定點插入[8]。

單核苷酸變異會導(dǎo)致約2/3人類疾病的發(fā)生[9]，也是許多作物重要農(nóng)藝性狀變異的遺傳基礎(chǔ)[10]，因此如何開發(fā)一種精準且高效實現(xiàn)堿基替換的技術(shù)尤為重要。理論上，HR途徑可實現(xiàn)任意堿基之間的改變，但該途徑受細胞類型及細胞周期的限制，且如何將供體DNA高效遞送到細胞中也是一大難題，這些弊端導(dǎo)致HR在動植物中的發(fā)生頻率及應(yīng)用范圍均受到了一定的限制[11]。另外，NHEJ途徑會與HR途徑競爭發(fā)生，因此往往會造成靶點處不必要的編輯產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，DSB引發(fā)的HR很難實現(xiàn)高效的、穩(wěn)定的單堿基突變。

2016年，堿基編輯系統(tǒng)(base editing)的開發(fā)將CRISPR/Cas系統(tǒng)從切割DNA的“剪刀”變?yōu)槟芨膶懱囟▔A基的“修正器”，打開了精準基因組編輯的大門。該系統(tǒng)目前已被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、基因治療、作物育種等各個領(lǐng)域的研究[12~17]。2017年，雜志將堿基編輯技術(shù)評為年度十大科學(xué)技術(shù)突破之一。

1 堿基編輯系統(tǒng)的概況及特點

堿基編輯系統(tǒng)將失去催化活性的Cas蛋白(如deactivated Cas，簡稱dCas)或只有切割一條鏈活性的Cas蛋白(如nickase Cas，簡稱nCas)和可作用于單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA)的脫氨酶進行融合，從而實現(xiàn)對靶點的堿基替換。目前堿基編輯系統(tǒng)依據(jù)融合的不同堿基修飾酶分為胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABE)[12]。這兩種堿基編輯器能在不產(chǎn)生DSB的情況下，分別利用胞嘧啶脫氨酶或經(jīng)過改造的腺嘌呤脫氨酶對靶位點上一定范圍的胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)進行脫氨基反應(yīng)，最終經(jīng)DNA修復(fù)或復(fù)制，實現(xiàn)精準的C-T或A-G的替換(圖1)。該系統(tǒng)與傳統(tǒng)的基于HR途徑實現(xiàn)點突變的方法相比，主要優(yōu)勢如下(表1)：

(1)不依賴DSB的產(chǎn)生。HR途徑必須依賴DSB的產(chǎn)生才有可能實現(xiàn)基因定點替換，并且在該過程中會不可避免的激發(fā)NHEJ途徑產(chǎn)生的非必要Indels產(chǎn)物。有效DSB的發(fā)生通常需要科研人員花費較大的精力去找尋并篩選出足夠高活性的sgRNA或Cas核酸酶。另一方面，當細胞內(nèi)產(chǎn)生大量甚至過量的DSB后會對細胞帶來較大的毒性，從而會對生物體造成一定的影響。而堿基編輯系統(tǒng)由于利用失去切割活性的或只有一條鏈切割活性的Cas蛋白來實現(xiàn)靶位點處堿基的定點替換，因此不依賴DSB的產(chǎn)生。盡管有相關(guān)報道證明CBE系統(tǒng)會產(chǎn)生一 定的Indels，但效率遠遠低于其介導(dǎo)的單堿基替換效率[12]。

(2)無需供體DNA的參與。HR途徑必須在提 供外源供體DNA的前提下才能實現(xiàn)堿基的定點替換。供體DNA形式目前主要包括環(huán)形雙鏈DNA (double-stranded DNA, dsDNA)、線性dsDNA和單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA) 3種形式。而對于選擇何種形式的供體DNA以及確定供體DNA形式后又應(yīng)該設(shè)計多少長度的同源序列才能夠達到最佳的同源重組效果，這在不同的動物細胞系或不同的植物體中均不相同，目前還沒有明確的統(tǒng)一的方法[4]。此外，如何將足量的供體DNA有效地遞送到細胞中也是目前的一大難題。堿基編輯系統(tǒng)無需提供供體DNA，有效地避免了上述各種不確定性。該系統(tǒng)借助于胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶的作用，通過sgRNA的引導(dǎo)直接對靶標堿基進行脫氨，從而高效地實現(xiàn)C-T或A-G的突變。

圖1 CBE和ABE工作模式圖

CBE系統(tǒng)在胞嘧啶脫氨酶及UGI的作用下將靶位點處一定活性窗口內(nèi)的C脫氨變?yōu)閁，經(jīng)DNA修復(fù)和復(fù)制后實現(xiàn)C-T的突變(左)；CBE系統(tǒng)經(jīng)胞嘧啶脫氨酶、UDG、AP裂解酶等作用下會產(chǎn)生非C-T或Indels的突變(中)；ABE系統(tǒng)在腺嘌呤脫氨酶的作用下將A脫氨變?yōu)镮，經(jīng)DNA修復(fù)和復(fù)制后實現(xiàn)A-G的突變(右)。

表1 CBE、ABE和HR的比較

SSB代表DNA單鏈斷裂。

(3)高效性和廣適性。HR一般發(fā)生在分裂的細胞，并且只能發(fā)生在細胞的S期和G2期[11]，這使其在動植物中發(fā)生的頻率較低，尤其在植物中HR的陽性篩選往往需要依賴除草劑抗性基因或靶標基因附近的抗生素基因來富集提高效率，因此大多數(shù)報道僅僅局限于對某些特殊的基因如和等的研究[4,11]，使其很難被廣泛地應(yīng)用。而堿基編輯系統(tǒng)介導(dǎo)的堿基替換在動植物中均表現(xiàn)出高效的優(yōu)勢，且已被廣泛地應(yīng)用于各種動物細胞系、人類胚胎、各種哺乳動物、非哺乳動物、單雙子葉植物、細菌、真菌等中[12,13,15,16]。

但是相比HR，堿基編輯系統(tǒng)目前只能實現(xiàn)堿基之間的轉(zhuǎn)換(transition)而不能實現(xiàn)堿基之間的顛換(transversion)，并且其在全基因組范圍和RNA水平存在較高的脫靶效應(yīng)(下文將詳細介紹)。但從整體來看，堿基編輯系統(tǒng)的開發(fā)及不斷的優(yōu)化發(fā)展為生命科學(xué)領(lǐng)域帶來了新的曙光。

2 CBE堿基編輯系統(tǒng)

2.1 CBE系統(tǒng)的開發(fā)

CBE一般由胞嘧啶脫氨酶、nCas9或dCas9組成[12,18]。具體工作原理是當CBE融合蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下靶向基因組DNA時，胞嘧啶脫氨酶可結(jié)合到由Cas9蛋白、sgRNA及基因組DNA形成的R-loop區(qū)的ssDNA處，將該ssDNA上一定范圍內(nèi)的胞嘧啶(C)脫氨為尿嘧啶(U)，進而通過DNA修復(fù)或復(fù)制將U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)，最終實現(xiàn)C至T (C-T)或G至A (G-A)的直接替換[18](圖1)。

自然界中存在的胞嘧啶脫氨酶大多數(shù)作用于RNA，而APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalyticpolypeptide-like)家族是目前報道的少數(shù)可作用于單鏈DNA的胞嘧啶脫氨酶，該類脫氨酶共同特點是都有一個能對堿基C進行脫氨的CDA (cytidine deaminase)保守結(jié)構(gòu)域，通過與CRISPR系統(tǒng)相結(jié)合，該類胞嘧啶脫氨酶由傳統(tǒng)的“突變器”被開發(fā)為新型的“編輯器”[18]。

2016年，美國哈佛大學(xué)David R. Liu實驗室率先建立了3種基于融合來源大鼠胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1的堿基編輯器(base editors, BE)[18]。第一代堿基編輯器BE1 (rAPOBEC1-XTEN-dCas9)由rAPOBEC1和完全失去切割活性的dCas9組成，可在體外實現(xiàn)有效的C-T堿基的編輯(25%~40%)，編輯的活性窗口可覆蓋sgRNA的第4~8位(PAM計為第21~23位)，但該堿基編輯器在哺乳動物細胞內(nèi)的編輯效率卻大大下降(0.8%~7.7%)。這在很大程度上與細胞體內(nèi)存在的尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase, UDG)有關(guān)，UDG可識別U?G錯配，并切割尿嘧啶和脫氧核糖骨架之間的糖苷鍵，通過細胞內(nèi)的堿基錯配修復(fù)途徑(base excision repair, BER)逆轉(zhuǎn)由BE1產(chǎn)生的U?G中間產(chǎn)物返回到C?G堿基對(圖1)。為了抑制UDG的作用，David R. Liu實驗室在BE1基礎(chǔ)上融合了來自噬菌體PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)，開發(fā)了第二代堿基編輯器BE2 (rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI)。UGI能夠抑制人類和細菌中的UDG作用，在一定程度上增加C-T的編輯效率，經(jīng)測試BE2比BE1編輯效率提高了3倍。隨后，該實驗室結(jié)合細胞的內(nèi)源修復(fù)機制開發(fā)了第三代堿基編輯器BE3 (rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI)。BE3將BE2中的dCas9替換為nCas9 (D10A)，可特異性的將非編輯鏈產(chǎn)生一個缺口，進而刺激細胞內(nèi)堿基錯配修復(fù)途徑(mismatch repair, MMR)以含有C的編輯鏈作為模板進行修復(fù)，從而增加堿基編輯效率。研究結(jié)果表明，BE3在人類細胞的6個位點中可實現(xiàn)平均約37%的編輯效率，比BE2提高了2~6倍，其編輯窗口仍為第4~8位，該堿基編輯器也是目前使用較為廣泛的CBE版本。

另外，日本神戶大學(xué)Akihiko Kondo實驗室采用上述類似策略將來源于七鰓鰻()的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1用于開發(fā)新的堿基編輯器—Targeted-AID[19]。研究人員通過該系統(tǒng)成功在酵母及哺乳動物細胞中實現(xiàn)了C-T的定點替換，效率分別高達80%及10%，編輯窗口為sgRNA的第5~9位，相比BE3的編輯窗口略大。

同年，基于融合人類胞嘧啶脫氨酶hAID的堿基編輯系統(tǒng)也被建立[20,21]。其中，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所健康所常興實驗室開發(fā)的TAM系統(tǒng)融合了dCas9及UGI[20]；美國斯坦福大學(xué)Michael C. Bassik實驗室開發(fā)的CRISPR-X同樣融合了dCas9，不同的是該堿基編輯器未融合UGI并且通過MS2招募hAID脫氨酶[21]。這兩種系統(tǒng)在轉(zhuǎn)入多個sgRNA的情況下，可以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)較大范圍(編輯范圍寬達100 nt)以及較多類型的堿基編輯。

另外，美國哈佛大學(xué)George M. Church實驗室開發(fā)了基于融合ZF或TALE特異性識別單元與hAID的堿基編輯系統(tǒng)[22]。相比上述基于融合Cas9變體的堿基編輯系統(tǒng)，這兩種堿基編輯器無PAM的需求，但在細菌及人類細胞中的編輯效率明顯下降，猜測原因是由于ZF或者TALE識別DNA特定區(qū)域后仍以dsDNA形式存在，未能夠提供胞嘧啶脫氨酶工作時所需要的ssDNA底物，從而降低了脫氨酶的催化效率。

2.2 CBE系統(tǒng)的限制及優(yōu)化

2.2.1 編輯產(chǎn)物純度

多項研究表明，經(jīng)CBE系統(tǒng)編輯后的編輯產(chǎn)物純度并不高，主要表現(xiàn)在兩方面：(1) CBE除將C編輯為T之外，也有一定幾率將C編輯為G或A[12]。這是由于UDG可將堿基U切除形成無嘧啶位點(apyrimidinic site, AP)，經(jīng)過跨損傷合成(translesion synthesis, TLS)聚合酶作用及DNA復(fù)制等，也有一定的幾率將該位置原始堿基C替換為其他堿基(圖1)；(2)在編輯過程中會產(chǎn)生少量的Indels[12,18]，這是由于形成的AP位點會在AP裂解酶或自發(fā)斷裂下產(chǎn)生一個缺口，進而與nCas9在非編輯鏈產(chǎn)生的缺口剛好形成一個DSB，經(jīng)過NHEJ修復(fù)途徑后會產(chǎn)生非必要的Indels產(chǎn)物(圖1)。David R. Liu實驗室在BE3的基礎(chǔ)上融合了第二個拷貝的UGI，構(gòu)建了第四代堿基編輯器BE4。測試結(jié)果表明，BE4不僅提高了堿基編輯效率，并且非C至T的替換效率相比BE3降低了2.3倍[23]。上海科技大學(xué)陳佳實驗室采取類似策略，通過優(yōu)化UGI的表達量，將UGI增至4個拷貝，建立的eBE-S3在哺乳動物細胞中同樣提高了編輯產(chǎn)物純度[24]。因此，通過添加更多拷貝UGI的策略對提高編輯產(chǎn)物純度具有重要作用。另外，David R. Liu實驗室進一步建立的BE4-Gam堿基編輯器可有效降低Indels的發(fā)生，這是由于融合的來源于噬菌體Mu的Gam蛋白可結(jié)合于DSB的末端防止其降解，進而阻止了NHEJ途徑的發(fā)生[23]。而基于融合環(huán)化的Cas9的4種CP-CBEmax編輯器也可一定程度的降低副編輯產(chǎn)物的發(fā)生[25]。

2.2.2 堿基編輯效率

研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)堿基編輯器的表達水平是影響其編輯效率的一個重要因素。David R. Liu實驗室通過增加不同個數(shù)的核定位信號(nuclear localiza-tion signal, NLS)以及使用不同公司優(yōu)化的密碼子序列等方法構(gòu)建了BE4max和AncBE4max，這兩種堿基編輯器可在各種哺乳動物細胞進行高效編輯[26]。Zafra等[27]通過增加NLS個數(shù)、改變NLS位置以及將nCas9密碼子優(yōu)化為哺乳動物細胞所偏好的密碼子序列，開發(fā)的FNLS-BE3的編輯效率相比BE3平均提高了15倍。另外，本實驗室開發(fā)的基于融合人類APOBEC3A胞嘧啶脫氨酶的A3A-PBE可在植物中實現(xiàn)比BE3平均高約13倍的堿基編輯效率[28]。

2.2.3 堿基編輯范圍

上述堿基編輯器均是融合SpCas9，因此只能靶向NGG序列的PAM形式，大大限制了CBE在基因組中的靶向范圍。為此，研究人員將SpCas9替換為其他Cas蛋白或相應(yīng)變體，通過不同Cas蛋白識別不同PAM，進而擴大CBE系統(tǒng)在基因組中的編輯覆蓋度。目前SpCas9的不同變體(VQR、EQR和VRER)、SaCas9和SaCas9的變體SaKKH與胞嘧啶脫氨酶的融合成功將CBE由NGG的PAM拓展為相應(yīng)的NGA、NGCG、NNGRRT和NNNRRT等多種PAM形式[29,30]。而dCpf1和Sp-macCas9的融合將CBE由識別富含GC序列拓寬至識別富含AT序列的的PAM位點[31~33]。值得一提的是，基于融合xCas9及SpCas9-NG變體的兩種堿基編輯器的開發(fā)使CBE系統(tǒng)可實現(xiàn)直接靶向NG PAM形式的位點[34,35]。

2.2.4 堿基編輯活性窗口

不同類型的CBE的堿基編輯窗口有略微的不同，依據(jù)不同的研究目的需要對編輯活性窗口做相應(yīng)的改變。當被用于精準改變某個特定的堿基C時，過大的脫氨化窗口會導(dǎo)致窗口內(nèi)非靶標堿基C的編輯，使得CBE系統(tǒng)被用于基因治療等領(lǐng)域時存在一定風(fēng)險。David R. Liu實驗室通過突變rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶上與DNA作用的關(guān)鍵酶活位點，開發(fā)了YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3和YEE-BE3堿基編輯器，進而可將脫氨窗口由5 nt縮小至1~2 nt，但同時對靶標C的編輯效率有所降低[29]。德國馬普分子植物生理所Ralph Bock實驗室開發(fā)的BE3-PAPAPAP以及通過縮短PmCDA1脫氨酶羧基端序列而建立的一系列nCDA1-BE3版本，能夠在保證對靶標C編輯效率依然高效的同時，可有效將編輯的活性窗口縮小到1~2 nt[36]。但如何進一步縮小突變窗口，真正做到只改變單一堿基而不影響旁側(cè)序列，將是堿基編輯系統(tǒng)今后重點攻克的方向。

另外，當CBE系統(tǒng)被用于基因功能篩選、大規(guī)模飽和突變、編輯調(diào)控元件、引入提前終止密碼子或進行可變剪接等時，更大的編輯活性窗口是更為有利的。Jiang等[37]采取SunTag系統(tǒng)策略開發(fā)了BE-PLUS系統(tǒng)，從而將BE3的突變窗口由5 nt (4~8)拓寬至13 nt (4~16)?；谌诤蟞A3A胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯器在人類細胞及植物中脫氨化的窗口可分別寬達14 nt (2~13)和17 nt (1~17)[28,38]。而CP1020- CBEmax和CP1028-CBEmax的編輯活性窗口可覆蓋sgRNA的8~9 nt[25]。Liu等[39]通過改造開發(fā)的DBE- A3A和DBE-AIDmono可將突變窗口拓寬為2~17位，并且依賴DBE系統(tǒng)可在體外培養(yǎng)的細胞中實現(xiàn)抗體親和成熟。

2.2.5 序列背景依賴性

基于融合rAPOBEC1的BE3具有強烈偏好TC序列，而對GC序列基本無編輯活性的特點[18]。而基于融合hAID、PmCDA1和hA3A的堿基編輯系統(tǒng)均可在GC序列背景下有效地編輯[23,28,40]，且hA3A- BE3可對高甲基化區(qū)域有較強的編輯活性[38]。而美國麻省總醫(yī)院Keith Joung實驗室通過加強堿基編輯效率依賴序列背景的特性，開發(fā)了eA3A-BE3，該堿基編輯器在保證其偏好TC序列背景的前提下，對其他序列背景下C的編輯活性大大下降，也進一步降低了對鄰近非靶標C的編輯[41]。類似的，基于融合人類hAPOBEC3G的hA3G-BE3只特定的編輯CC序列的第二個C或CCC序列的后兩個C[42]。

總之，針對胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)的各種不足之處，科研人員們不斷開發(fā)和優(yōu)化出新的堿基編輯器，極大地豐富了堿基編輯工具盒。上述各種堿基編輯器具體構(gòu)建及編輯特性見表2。

2.3 CBE系統(tǒng)的應(yīng)用

胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)自開發(fā)以來，被迅速的廣泛應(yīng)用于各種動物細胞系、人類胚胎、動物、植物及細菌等基礎(chǔ)體系的建立(圖2，表3)，其中包括酵母()、真菌、小鼠()、斑馬魚()、兔子()、家蠶(L.)、海膽()、非洲爪蟾()、豬(L.)、羊(L.)、水稻(L.)、小麥(L.)、玉米(L.)、番茄(Mill.)、擬南芥()、馬鈴薯(L.)、西瓜(L.)、棉花(L.)和細菌等[12,13,15,16,43~50]。除此之外，該系統(tǒng)也被用于基因治療、動物疾病模型建立、植物重要農(nóng)藝性狀創(chuàng)制等方面[12,13,15](圖2，表3)。

2.3.1 基因治療及動物疾病模型的建立

CBE系統(tǒng)的開發(fā)為精準基因治療提供了強有力的技術(shù)手段。通過CBE在各種細胞系水平上修正相應(yīng)致病位點的研究已經(jīng)很多，其中包括Komor等[18]利用BE3在小鼠星形膠質(zhì)細胞中修正了與阿爾茲海默癥相關(guān)的基因的突變；Zara等[27]在小鼠肝臟細胞中通過遞送密碼子優(yōu)化的FNLS-BE3糾正了與癌癥相關(guān)的S45F突變；Komor等[18]在人類乳腺癌細胞中糾正了Y163C突變；Koblan等[26]在來源于病人的原發(fā)性纖維細胞中實現(xiàn)了、等位基因的糾正等。而在哺乳動物體內(nèi)及人類胚胎中實現(xiàn)致病基因的定向修正也有相關(guān)報道，如Chadwick等[51]在成年小鼠中通過慢病毒遞送BE3，對基因進行提前終止突變，可大幅度降低小鼠血漿中PCSK9蛋白表達水平及膽固醇水平；Yang等[52]對組蛋白相關(guān)基因進行點突修飾，探索了表觀調(diào)控在小鼠胚胎發(fā)育中的重要性。Zeng等[53]在人類細胞和雜合子胚胎中糾正了馬凡綜合征致病性突變；中山大學(xué)黃軍就實驗室在重構(gòu)的人類胚胎中修復(fù)了引起β-地中海貧血病的突變[54]；中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝實驗室研究發(fā)現(xiàn)在人類胚胎的二細胞期注射BE3比在一細胞期注射時對基因的編輯效率更高，這為研究人類胚胎發(fā)育中的基因功能提供了一種強有力的方法[55]。

第一，往大處想——定義一個更加寬泛的問題，不斷地問“這個問題背后更大的問題是什么？”和“我們要達到的更好的效果是什么？”讓思維獲得更多的自由，從而想出更多的解決方案。第二，換位思考——進入你想模仿的人或公司的思維模式，重新審視遇到的問題，放開平常的限制，會發(fā)掘出新的、未想到過的解決方法。第三，強加約束——給現(xiàn)狀引入一個強有力的限制，探索這樣做能帶來什么樣的好處。第四，選擇構(gòu)架——怎么創(chuàng)造一種環(huán)境，讓人們在這種環(huán)境中選擇我們想要他們采取的行動。

表2 各種堿基編輯器(BE)的特點

續(xù)表

BE名稱脫氨酶Cas蛋白PAM類型UGI個數(shù)NLS個數(shù)密碼子優(yōu)化編輯活性窗口參考文獻 DBE-A3AhAPOBEC3A-MS2nCas9NGG1×1×–2~17[39] hA3AR128AhAPOBEC3A-R128AnCas9NGG1×1×–3~9[133] A3G-BE4maxhAPOBEC3G-CTDnCas9NGG2×1×–4~10[42] Target-AIDPmCDA1nCas9NGG1×1×–2~8[19] Target-AID-NGPmCDA1nCas9NG1×1×–2~8[35] nCDA1-BE3PmCDA1ΔnCas9NGG1×1×–3~4[36] TAMhAIDxdCas9NGG1×1×–4~10[20] CRISPR-XhAIDΔ-MS2dCas9NGG–1×––50~50[21] eAID-BE4maxhAIDnCas9NGG2×2×+4~8[40] DBE-AIDmonohAID-mono-MS2 nCas9NGG1×1×–2~17[39] ZF-AIDhAIDZF–1×1×––[22] TALE-AIDhAIDTALE–1×1×––[22] ABE7.9 TadA-TadA*nCas9NGG1×1×–4~9[107] ABE7.10 TadA-TadA*nCas9NGG–1×–4~7[107] PABE-7TadA-TadA*nCas9NGG–1×+4~7[108] ABEmax TadA-TadA*nCas9NGG–2×+4~7[26] VQR-ABETadA-TadA*nVQRCas9NGA–1×+/–4~8[30,114] VQR-ABEmaxTadA-TadA*nVQRCas9NGA–2×+4~8[25] VRER-ABETadA-TadA*nVRERCas9NGCG–1×+4~8[30] VRER-ABEmaxTadA-TadA*nVRERCas9NGCG–2×+4~8[25] VRQR-ABEmaxTadA-TadA*nVRQRCas9NGA–2×+4~8[25] ABEsaTadA-TadA*nSaCas9NNGRRT–1×+6~12[111] SaABEmaxTadA-TadA*nSaCas9NNGRRT–2×+4~14[25] SaKKH-ABETadA-TadA*nSaKKHCas9NNNRRT–1×+8~13[30,117] SaKKH-ABEmaxTadA-TadA*nSaKKHCas9NNNRRT–2×+4~14[25] xABETadA-TadA*nxCas9NG–1×–4~7[34] xABEmaxTadA-TadA*nxCas9NG–2×+4~8[25] ABE-NGTadA-TadA*nSpCas9-NGNG–1×+4~7[74] ABE-NG-STadA*nSpCas9-NGNG–1×+4~7[74] NG-ABEmaxTadA-TadA*nSpCas9-NGNG–2×–4~8[35] CP-ABEmaxTadA-TadA*CP-nCas9NGG–2×+4~12[25] ScCas9-ABE(7.10)TadA-TadA*nScCas9NNGN-1×-4~7[109] ABEmaxAWTadA-E59A-TadA*-V106WnCas9NGG–2×+4~8[132] ABEmaxQWTadA-E59Q-TadA*-V106WnCas9NGG–2×+4~8[132] ABE7.10F148ATadA-F148A-TadA*-F148AnCas9NGG–1×–5[133]

點突變動物模型的建立可通過HR實現(xiàn)，但該途徑效率低且周期長，并不能被廣泛的應(yīng)用。目前通過CBE系統(tǒng)已在多種動物中建立了相應(yīng)的疾病模型(圖2A，表3)。在小鼠中建立的疾病模型類型最多，包括白化病、肌營養(yǎng)不良、肝病和雄性激素不敏感綜合征等[56]，其中韓國首爾國立大學(xué)Jin-Soo Kim實驗室通過BE3 mRNA編輯小鼠胚胎基因和而建立了相應(yīng)的小鼠白化病和肌營養(yǎng)不良疾病模型[57]；中山大學(xué)松陽洲實驗室利用HF2-BE2也建立了小鼠白化病模型[58]；Sasaguri等[59]利用BE3和Targeted-AID系統(tǒng)在小鼠中引入了與早衰癥相關(guān)的基因的突變；Villiger等[60]在成年小鼠中利用AAV慢病毒載體遞送分割的BE3系統(tǒng)，修正了突變，治療了代謝肝??；Li等[61]利用hA3A-BE3- Y130F編輯富含GC的區(qū)域，獲得了雄性激素不敏感綜合征的小鼠。在大型哺乳動物如兔子、豬和羊中也有相關(guān)疾病模型的建立。兔子中，利用BE3、BE4-Gam、AID-nCas9和hA3A-eBE-N57G等不同的CBE堿基編輯器建立了白化病、早衰癥、雙肌臀、X-連鎖擴張性心肌病等疾病模型[62~65]。在豬中，Li等[66]利用BE3在豬胚胎成纖維細胞中編輯基因和基因，而后通過體細胞核移植的方法建立了無臉巨口綜合征和皮膚白化病的疾病模型；而中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)實驗室在豬中首次實現(xiàn)了多個基因靶點的同時C-T突變，并建立了相應(yīng)的疾病模型[67]。在羊中，利用BE3編輯和基因，成功獲得了體重、尺寸和毛長等生長指標增加的突變體羊[68,69]。除了在哺乳動物中，在非哺乳動物斑馬魚和非洲爪蟾中建立模擬人類疾病的模型也有相關(guān)報道，其中Zhang等[70]通過編輯斑馬魚胚胎的基因建立了模擬人類眼白化病的疾病模型；Tanaka等[71]利用Targeted-AID編輯了斑馬魚基因和，并觀察到了相應(yīng)突變體表型。在非洲爪蟾中，Park等[72]通過轉(zhuǎn)化BE3的RNP形式建立了白化病疾病模型；Shi等[73]利用BE3建立了模擬人類Holt-Oram綜合征和眼皮白化病1A型的疾病模型。上述致病基因的點突動物模型的建立為進一步真正進行臨床疾病治療提供了堅實的基礎(chǔ)。

圖2 堿基編輯系統(tǒng)的應(yīng)用

A：基因治療及動物疾病模型建立；B：植物中的應(yīng)用；C：提前終止密碼子的引入及改變；D：mRNA剪接；E：蛋白定向進化。

表3 堿基編輯系統(tǒng)在動物、植物和細菌中的應(yīng)用

續(xù)表

續(xù)表

2.3.2 在植物中的應(yīng)用

植物中許多重要農(nóng)藝性狀是由單個或少數(shù)幾個堿基突變引起，基于傳統(tǒng)化學(xué)誘變的TILLING (targ-eting induced local lesions in genomes)可獲得植物中的點突，但該方法耗時、耗力、隨機性強、突變效率低，而CBE系統(tǒng)的開發(fā)為在植物中快速、高效且精準的創(chuàng)制突變體提供了有力的工具(圖2B，表3)。其中，基于融合rAPOBEC1的BE3系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用最多。自2016年以來，來自國內(nèi)外的多個研究團隊利用BE3及基于融合SpCas9-VQR、SaKKH、SpCas9-NG和xCas9變體的BE3堿基編輯器在水稻中創(chuàng)制了多個基因的突變體[30,74~81]。本實驗室利用基于融合rAPOBEC1的PBE系統(tǒng)在水稻、小麥和玉米原生質(zhì)體中實現(xiàn)了多個基因的編輯，并獲得了突變效率高達45.8%的相應(yīng)突變體植株[82]；并利用PBE系統(tǒng)編輯小麥和基因，創(chuàng)制了一系列抗除草劑小麥新種質(zhì)，為麥田雜草防控提供了育種新材料及技術(shù)路徑[83]。另外，基于此本實驗室還在小麥中建立了無外源選擇標記、直接篩選堿基編輯事件的方法[83]。Chen等[84]通過對基因的堿基替換，創(chuàng)制了抗除草劑擬南芥材料。Tian等[85]利用BE3獲得了世界首例堿基編輯抗除草劑西瓜。另外，BE3介導(dǎo)的堿基編輯也已成功用于四倍體棉花基因組中[86]。

基于融合其他類型胞嘧啶脫氨酶的CBE系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用也有相關(guān)報道?；谌诤螾mCDA1脫氨酶的Target-AID系統(tǒng)已成功用于水稻、番茄和馬鈴薯相關(guān)基因的編輯，并創(chuàng)制了抗咪唑類除草劑水稻材料[87~90]。并且，該系統(tǒng)后續(xù)被用于建立植物抵御RNA病毒的免疫系統(tǒng)[91]。另外，SpCas9-NGv1與PmCDA1的融合進一步拓寬了胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)在水稻基因組中的靶向范圍[78,92]。而本實驗室利用基于融合人類APOBEC3A的A3A-PBE系統(tǒng)在水稻、小麥和馬鈴薯原生質(zhì)體實現(xiàn)了非常高效的堿基編輯并且創(chuàng)制了抗除草劑小麥材料[28]?；谌诤蟞AID的堿基編輯系統(tǒng)在水稻中表現(xiàn)出能高效編輯GC序列背景的特點[40]。

2.3.3 在細菌中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)來源于原核生物的免疫系統(tǒng)，可被用于細菌的編輯，同樣BE系統(tǒng)已被測試也可用于細菌的堿基編輯(表3)。Banno等[93]利用Targeted- AID編輯了大腸桿菌()等多個基因，更重要的是該系統(tǒng)在只轉(zhuǎn)入4個sgRNA的情況下可在多拷貝的轉(zhuǎn)座子元件中誘導(dǎo)41個突變的發(fā)生。Zheng等[94]利用BE3對大腸桿菌基因引入了提前終止密碼子。除在大腸桿菌中，科研人員利用BE3或者BE3-ΔUGI在羊布魯式桿菌()、金黃色葡萄球菌()、假單胞桿菌()和肺炎球菌()等中也成功實現(xiàn)了相關(guān)基因的堿基編輯[94~97]，這表明堿基編輯系統(tǒng)可被廣泛的應(yīng)用于多種原核生物的編輯。

2.3.4 引入提前終止密碼子

CBE系統(tǒng)通過C-T或G-A突變可以將非編碼鏈的CAA、CAG、CGA以及TGG共4種密碼子中的任意一種突變?yōu)榻K止密碼子，從而在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下達到敲除基因的效果(圖2C)。Jin-Soo Kim實驗室率先利用BE3在基因中引入提前終止密碼子，建立了肌營養(yǎng)不良的小鼠疾病模型[57]。隨后報道的CRISPR-Stop和iSTOP方法利用同樣的思路建立了大規(guī)模BE3介導(dǎo)的基因失活體系。其中，CRISPR-Stop相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過BE3產(chǎn)生的基因失活效率與Cas9介導(dǎo)的敲除效率相當，并且BE3對細胞的死亡損傷明顯降低[98]。Billon等[99]建立的iSTOP可覆蓋人類基因組讀碼框的98.6%以上，并且該實驗室提供了可免費設(shè)計人類、小鼠和擬南芥等8個物種iSTOP sgRNA的在線數(shù)據(jù)庫。而當同時使用多個sgRNA時，可顯著增加BE3介導(dǎo)的iSTOP效率[100]。

2.3.5 調(diào)控內(nèi)源mRNA的可變剪接

mRNA可變剪接是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的重要過程，典型真核內(nèi)含子連接有5?-GT(供體序列)和AG-3? (受體序列)，它們在剪接中起著重要作用[101]，而堿基編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)對特定mRNA剪接過程的功能研究提供了重要的技術(shù)工具(圖2D)。Gapinske等[102]率先利用BE3介導(dǎo)的CRISPR-SKIP剪接體系，對小鼠和人類不同細胞系的mRNA的可變剪接位點進行了編輯，導(dǎo)致外顯子跳讀。常興實驗室利用TAM系統(tǒng)在人類細胞中實現(xiàn)了目前存在的4種mRNA剪接形式的改變(外顯子跳讀、改變可變剪接位點的選擇、調(diào)節(jié)互斥外顯子的選擇和誘導(dǎo)小的內(nèi)含子的包含)，并且通過編輯基因的剪接位點，實現(xiàn)了目標外顯子的完全跳讀，在所有表達TAM的細胞中修復(fù)了心肌細胞的缺陷[103]。植物中，本實驗室利用BE3在擬南芥中對位于內(nèi)含子5'端的剪接保守位點“GU”以及基因5' UTR區(qū)的內(nèi)含子剪接位點處進行突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用該方法可高效的刪除或改變mRNA特定剪接形式或組成型剪接形式[104]。中山大學(xué)李劍峰實驗室同樣利用BE3在擬南芥和水稻中建立了有效的mRNA可變剪接體系[105]。

2.3.6 蛋白定向進化

堿基編輯系統(tǒng)除可以進行單個氨基酸位點的基因編輯以外，理論上還可以通過氨基酸位點的遺傳篩選進行蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究(圖2E)。常興實驗室利用TAM系統(tǒng)在慢性粒細胞白血病細胞中靶標基因，有效鑒定了賦予細胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變，這表明CBE系統(tǒng)可以在單堿基水平上篩選功能獲得性變異[20]。Michael C. Bassiks實驗室利用基于MS2招募hAID脫氨酶的CRISPR-X系統(tǒng)在哺乳動物細胞中突變了癌癥治療藥物萬珂(bortezomib)的靶標基因，從中找到了引發(fā)bortezomib耐藥性的已知和全新的突變[21]。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所李勁松實驗室利用優(yōu)化的BE3向小鼠“人造精子”中導(dǎo)入了一個靶向基因的一個sgRNA慢病毒文庫(含77個sgRNA)，通過兩輪的遺傳篩選，他們發(fā)現(xiàn)并驗證DND1蛋白的E59K、V60M、P76L和G82R對PGCs的發(fā)育具有重要作用[106]。該項研究是首次利用堿基編輯技術(shù)實現(xiàn)了個體水平蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸功能位點的遺傳篩選，理論上可同樣篩選人類疾病相關(guān)基因的功能位點。目前，在植物中堿基編輯系統(tǒng)用于基因大規(guī)模突變并沒有相關(guān)報道，分析原因主要有3個方面：(1)由于組織培養(yǎng)產(chǎn)生的大量再生植物沒有快速且高效的陽性篩選體系，為鑒定突變體帶來了很大的困擾；(2)缺乏高效的植物原生質(zhì)體再生方法，限制了突變類型的飽和度；(3)將堿基編輯系統(tǒng)與多個sgRNA同時遞送到植物細胞中是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化的一大困難。因此，在植物中利用堿基編輯系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白功能定向進化是目前重要研究方向之一。

3 ABE堿基編輯系統(tǒng)

3.1 ABE系統(tǒng)的開發(fā)

2017年，David R. Liu實驗室開創(chuàng)性地開發(fā)了腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)(ABE)，該系統(tǒng)由人工定向進化的腺嘌呤脫氨酶及nCas9組成，可實現(xiàn)A至G (A-G)或T至C (T-C)的替換[107]。其作用原理與CBE系統(tǒng)類似，即腺嘌呤脫氨酶可將靶位點處一定范圍的腺嘌呤(A)脫氨變?yōu)榧≤?I)，肌苷在DNA水平會被當作鳥嘌呤(G)進行讀碼與復(fù)制，最終實現(xiàn)A-G的改變。ABE的開發(fā)打破了之前堿基編輯系統(tǒng)僅能編輯C或G的限制，為堿基之間的相互轉(zhuǎn)變提供了更多的可能性(圖1)。

由于目前已知的腺嘌呤脫氨酶不能以DNA為底物對堿基A進行脫氨，這導(dǎo)致ABE系統(tǒng)的開發(fā)比CBE系統(tǒng)更具有挑戰(zhàn)性。David R. Liu實驗室最初也嘗試將來自大腸桿菌TadA、大鼠ADA、人類ADAR2和人類ADAT2 4種腺嘌呤脫氨酶分別直接與nCas9融合，但均沒有編輯活性，這表明必須將現(xiàn)有腺嘌呤脫氨酶進行定向改造，才有可能實現(xiàn)對堿基A的編輯[107]。對此，該實驗室選取大腸桿菌TadA為改造對象，將隨機突變的TadA序列融合dCas9構(gòu)建成隨機突變文庫，通過ABE恢復(fù)氯霉素、卡那霉素、壯觀霉素等抗性基因的功能，結(jié)合易錯PCR、DNA重排等定向進化策略，進行相應(yīng)的抗生素篩選， 先后經(jīng)過7輪進化與改造后，成功篩選到了能直 接作用于ssDNA的ABE系統(tǒng)。在人類細胞中建立了目前效率最高且應(yīng)用最廣的ABE版本ABE7.10 (ecTadA-ecTadA*-nCas9)。ABE7.10將nCas9與野生型腺嘌呤脫氨酶ecTadA和經(jīng)過定向進化的腺嘌呤脫氨酶ecTadA* (與野生型相比引入了W23R、H36L、P48A、R51L、L84F、A106V、D108N、H123Y、S146C、D147Y、R152P、E155V、I156F和K157N共14個位點的突變)二聚體相融合，在人類細胞中編輯效率約為50%，編輯活性窗口可覆蓋sgRNA的第4~9位[107]。相比CBE，ABE不需要抑制烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(alkyl adenine DNA glycosylase, AAG)的活性，這暗示著肌苷的損傷修復(fù)機制可能與AAG無關(guān)。

3.2 ABE系統(tǒng)的優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)ABE無論在哺乳動物還是在植物等中的編輯，相比CBE系統(tǒng)可保證高精確度的堿基替換和較低的Indels發(fā)生，因此科研人員對ABE系統(tǒng)的優(yōu)化主要表現(xiàn)在對堿基編輯效率的提高、擴大編輯活性窗口和堿基編輯范圍方面[12,13,15]。

對于堿基編輯效率的提高，本實驗室率先通過優(yōu)化密碼子、調(diào)整腺嘌呤脫氨酶二聚體的位置和NLS的位置、增加NLS個數(shù)以及使用3種不同sgRNA形式等手段優(yōu)化的PABE-7堿基編輯器相比原始的ABE7.10的編輯效率在小麥和水稻中提高了1.1倍[108]。David R. Liu實驗室通過不同公司優(yōu)化的密碼子序列和增加NLS的個數(shù)而建立的ABEmax也提高了對堿基A的替換效率[26]。另外，CP1012- ABEmax、CP1028-ABEmax、CP1041-ABEmax和CP1249-ABEmax堿基編輯器在保證效率與ABEmax相當?shù)那闆r下，可在一定程度上將4~8位的堿基編輯窗口拓展為4~12位[25]。在擴大PAM選擇范圍方面，VQR-SpCas9 (PAM: NGA)、VRER-SpCas9 (PAM: NGCG)、VRQR-SpCas9 (PAM: NGA)、SaCas9 (PAM: NNGRRT)、SaKKH (PAM: NNNRRT)、ScCas9 (PAM:NNGN)、xCas9 (PAM:NG)和SpCas9-NG (PAM: NG)的融合擴大了ABE在動植物基因組可編輯位點的范圍[25,30,74,109]。

3.3 ABE系統(tǒng)的應(yīng)用

ABE系統(tǒng)的開發(fā)為創(chuàng)制更多的動植物突變體、治療更多的點突引起的疾病以及創(chuàng)制優(yōu)異的農(nóng)作物性狀等提供了更加全面有力的工具(表3)。

在動物中，目前ABE系統(tǒng)已成功用于各種動物細胞系、人類胚胎、小鼠、大鼠、兔子和斑馬魚等中[12,13,15,110]。ABE可修改提前終止密碼子突變，當靶向非編碼鏈時可將編碼鏈的TAA、TAG和TGA修改為CAA、CAG和CGA (圖2C)。Jin-Soo Kim實驗室率先利用ABE7.10對小鼠基因引入了錯義突變，并將ABE7.10包裹到雙反式剪接的AAV病毒系統(tǒng)中，對基因進行了無義突變，建立了杜氏肌營養(yǎng)不良的小鼠疾病模型[111]。上?？萍即髮W(xué)黃行許實驗室通過編輯和基因，建立了ABE介導(dǎo)的相關(guān)小鼠疾病模型，同時該研究使用不同的Cas9同源蛋白實現(xiàn)了ABE和CBE的同時編輯[49]。另外，該實驗室利用ABEmax-NG在動物細胞內(nèi)實現(xiàn)了精準的mRNA剪接位點的編輯[112]。Liang等[113]在小鼠中編輯了基因和基因的可變剪接位點，并在含有突變的小鼠中觀察到了相應(yīng)的杜氏肌營養(yǎng)不良的表型。Yang等[114]利用ABE7.10建立了由突變引起的Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠模型，并且該研究也證實SaKKH-ABE和VQR-ABE兩種編輯器同樣可在小鼠中產(chǎn)生有效的A-G的突變。在大鼠中，Yang等[114]和Ma等[115]實現(xiàn)了大鼠基因的編輯，并且Yang等[114]在被ABE7.10編輯的D645G/ I646V F1后代的大鼠多個組織中發(fā)現(xiàn)了充滿糖原的大溶酶體異常積累，建立了龐貝氏癥大鼠疾病模型。在兔子中，Liu等[62]利用ABE7.10高效地編輯了兔子中的、和基因，并且T279A突變體表現(xiàn)出與人類家族性X-連鎖擴張型心肌病相似的典型臨床癥狀。除了哺乳動物，Qin等[116]利用斑馬魚密碼子優(yōu)化的zABE7.10成功在斑馬魚、、和中引入了突變，并且突變體有著相應(yīng)的表型，該實驗室進一步將zABE7.10max成功用于斑馬魚基因的編輯。

在植物中，ABE系統(tǒng)已成功被用于水稻、小麥、擬南芥和油菜(L.)等相關(guān)基因突變提的創(chuàng)制及相應(yīng)性狀的創(chuàng)制(表3)。中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康實驗室利用ABE-P1 (ABE7.10)和ABE-P2 (ABEsa)編輯了水稻的6個基因，并在后續(xù)研究中實現(xiàn)了ABE-P3 (VQR-ABE)、ABE-P4 (VRER-ABE)和ABE-P5 (SaKKH-ABE)、ABE-NG和ABE-NG-S (只融合人工進化的TadA變體TadA*)的進一步拓展，且在水稻中可同時實現(xiàn)C-T和A-G的同時編輯[30,74,117]。Yan等[118]同樣證明ABE在水稻中可高效工作。而本實驗室利用經(jīng)過多種元件優(yōu)化后的PABE-7版本編輯了水稻和小麥的多個基因，并且獲得了相應(yīng)的小麥突變體和抗除草劑的水稻基因突變材料[108]。Jin-Soo Kim實驗室利用RPS5A啟動子驅(qū)動ABE，在雙子葉擬南芥和油菜中實現(xiàn)了高效的編輯，并創(chuàng)制了擬南芥早花的突變體材料以及實現(xiàn)了油菜基因mRNA的可變剪接[119]。

4 堿基編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及改善策略

堿基編輯系統(tǒng)最重要的用途在于實現(xiàn)基因的堿基替換，從而達到治療疾病及作物改良的目的。因此，其編輯的特異性備受關(guān)注，也尤為重要。堿基編輯系統(tǒng)的脫靶分為3個方面(圖3)：

第一、傳統(tǒng)的可預(yù)測的脫靶。該類脫靶是指堿基編輯系統(tǒng)除了編輯靶位點以外，還可以編輯與靶位點相似性很高的其他位點，而這些位點往往與靶位點只有幾個堿基的錯配。這類的脫靶位點一般可用目前的軟件預(yù)測(如Cas-OFFinder、E-CRISP和CRISPR-P等)，后續(xù)結(jié)合分子生物學(xué)手段來判斷是否存在脫靶效應(yīng)。導(dǎo)致該類脫靶發(fā)生的原因主要有兩方面：一是sgRNA序列的容錯性，脫靶效應(yīng)的高低與sgRNA和靶標DNA之間錯配堿基的數(shù)目有關(guān)[120,121]；二是Cas9核酸酶自身的非特異性、脫氨酶與Cas9融合蛋白的高濃度及長時間持續(xù)表達都容易造成對非靶標位點的編輯。目前降低此類脫靶效應(yīng)的策略主要有以下幾種[122]：(1) sgRNA的修飾。利用縮短的sgRNA (gX18或gX17)或延長的sgRNA (gX20或ggX20)均可在保持BE3或ABE系統(tǒng)效率的前提下降低它們的脫靶效應(yīng)[120,121]；(2)使用高保真的Cas9核酸酶。利用工程化的Cas9變體可降低堿基編輯的脫靶情況。David R. Liu實驗室通過將HF1-Cas9與BE3融合，建立的HF-BE3可明顯降低原始BE3對非靶標位點的編輯[123]。Jin-Soo Kim實驗室通過將Sniper Cas9與ABE融合建立的Sniper ABE7.10對ABE系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)有明顯的改善[120]；(3)縮短脫氨酶與Cas9核酸酶融合蛋白在細胞中的作用時間。利用堿基編輯器與sgRNA形成的核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein, RNP)取代其DNA表達形式直接轉(zhuǎn)化細胞，可以使堿基編輯器在細胞內(nèi)快速降解，從而降低脫靶效應(yīng)。研究表明，遞送BE3 RNP和ABE RNP均可提高相應(yīng)堿基編輯系統(tǒng)的特異性[120,123]。

第二、全基因組范圍內(nèi)不可預(yù)測的脫靶。該類脫靶位點往往隨機或有一定規(guī)律的分布在全基因組水平上，但通過目前的軟件無法預(yù)測。體外優(yōu)化的Digenome-seq、EndoⅧ或Endo V-seq的脫靶評估手段并不能真實有效的反應(yīng)體內(nèi)環(huán)境下堿基編輯系統(tǒng)的特異性[120,121,124]。由于脫氨酶需要結(jié)合在ssDNA處發(fā)揮作用，因此細胞內(nèi)自身存在的ssDNA、轉(zhuǎn)錄區(qū)域、復(fù)制區(qū)域等成為了堿基編輯系統(tǒng)在全基因組水平的潛在脫靶對象。Lee等[125]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎中BE3在sgRNA前后200個堿基處的脫靶效應(yīng)高于ABE系統(tǒng)。而在小鼠中，楊輝實驗室利用建立的GOTI技術(shù)結(jié)合全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)BE3在小鼠體內(nèi)能夠引發(fā)比自發(fā)突變高20倍的C-T的單核苷酸變異(single nucleotide variations, SNVs)[126]；同一時間，本實驗室在植物中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即BE3和HF1-BE3能夠引起水稻全基因組水平的C-T SNVs的增加[127]，且這兩項研究均表明這些C-T SNVs在染色體間均勻分布，但呈現(xiàn)出在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)富集的趨勢[126,127]。而對于融合其他類型胞嘧啶脫氨酶的CBE系統(tǒng)是否也存在該現(xiàn)象還需要進一步的評估。更早的研究發(fā)現(xiàn)，過表達不同胞嘧啶脫氨酶或UGI在酵母、大腸桿菌及人類細胞系中會導(dǎo)致基因組內(nèi)C-T SNVs的增加[128~130]。這些問題的發(fā)現(xiàn)一方面暗示著現(xiàn)階段將堿基編輯系統(tǒng)于疾病治療等精準改造方面有一定的風(fēng)險，另一方面促使科研人員更深層次的探索究竟是胞嘧啶脫氨酶、UGI還是兩個組分共同作用的結(jié)果造成了全基因組水平的脫靶，從而改進開發(fā)出更加精準安全的CBE系統(tǒng)。而相比之下，ABE系統(tǒng)在全基因水平具有很高的特異性[126,127]，這可能與ABE系統(tǒng)融合的腺嘌呤脫氨酶是經(jīng)過人工定向進化以及ABE系統(tǒng)中并沒有UGI組分有關(guān)。

圖3 堿基編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及改善策略

堿基編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)分3個層次：傳統(tǒng)的可預(yù)測的脫靶、全基因組水平的脫靶及轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶。目前針對可預(yù)測的脫靶及轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶已有較好的改善策略，而對于CBE系統(tǒng)在全基因組范圍的脫靶只有初步的猜想。

第三、轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶。無論是胞嘧啶脫氨酶還是腺嘌呤脫氨酶在之前的研究報道中都是能夠作用于RNA或自身完全作用于RNA的脫氨酶，因此這就有可能導(dǎo)致堿基編輯系統(tǒng)在RNA水平產(chǎn)生脫靶。2019年，Keith Joung實驗室通過轉(zhuǎn)錄組測序，率先證明了BE3和ABE系統(tǒng)在人類細胞系轉(zhuǎn)錄組水平存在嚴重的脫靶效應(yīng)[131]。其中，BE3可在38%~58%的表達基因中以0.07%~100%的頻率誘導(dǎo)成千上萬的C-U的編輯；而ABEmax在RNA水平對堿基A的脫靶編輯也可高達100%[131]。隨后，David R. Liu實驗室也證明ABE在哺乳動物細胞系中存在很低但能夠檢測到的RNA脫靶[132]。楊輝實驗室定量評價了CBEs和ABEs誘導(dǎo)的RNA單核苷酸變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器BE3和腺嘌呤堿基編輯器ABE7.10都能產(chǎn)生成千上萬的非靶向RNA SNVs[133]。對于堿基編輯系統(tǒng)在RNA水平的嚴重脫靶現(xiàn)象，目前主要的解決方案是利用工程化的脫氨酶變體，即一般通過改造脫氨酶與RNA的活性結(jié)合位點從而來降低對RNA的編輯效率。依據(jù)此思路，Keith Joung實驗室開發(fā)的BE3-R33A和BE3-R33A/K34A的變體可將BE3對RNA的編輯分別降低390倍和3800倍。楊輝實驗室開發(fā)的BE3W90Y+R126E、hA3AR128A和hA3AY130F可直接將BE脫靶降低到本底水平[133]。對于ABE系統(tǒng)的改造，David R. Liu實驗室開發(fā)的ABEmaxAW (TadA E59A, TadA* V106W)和ABEmaxQW (TadA E59Q, TadA* V106W)可在保證一定DNA水平的編輯效率的同時，降低其在RNA水平的編輯效率[132]。而楊輝實驗室也開發(fā)了兩種ABE變體，ABE7.10D53E和ABE7.10F148A，其中ABE7.10F148A可直接消除ABE系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶效應(yīng)[133]。

總之，ABE系統(tǒng)因其在DNA水平具有較高的特異性，而在RNA水平的脫靶也有了很好的解決方案，因此就目前研究結(jié)果來看ABE系統(tǒng)具有較高的安全性。而CBE系統(tǒng)在DNA水平的脫靶效應(yīng)需要進一步的改善，開發(fā)出更安全的CBE工具。

5 堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)展前景

堿基編輯技術(shù)的開發(fā)為定向修正堿基突變和創(chuàng)制基因組中的關(guān)鍵核苷酸變異提供了重要工具，展現(xiàn)了其在遺傳疾病治療與動植物新品種培育等方面的重大應(yīng)用價值。然而堿基編輯系統(tǒng)仍然存在一些不足之處。最為明顯的是，CBE及ABE系統(tǒng)只能實現(xiàn)嘧啶對嘧啶、嘌呤對嘌呤的改變，即C-T、T-C、G-A和A-G的改變，而不能實現(xiàn)堿基之間的顛換，如C-G、C-A、A-T和A-C的轉(zhuǎn)變。雖然目前有研究報道CBE系統(tǒng)可產(chǎn)生C至G或A的突變，但其發(fā)生有很大的隨機性并且效率很低。另外，堿基編輯系統(tǒng)相比HR在全基因組及RNA水平的脫靶效應(yīng)更高，安全性更低。受自身的編輯活性窗口及PAM的限制，使堿基編輯系統(tǒng)在實際應(yīng)用中并不能對所有的靶點都能有效編輯。因此，堿基編輯系統(tǒng)在技術(shù)及應(yīng)用層面等仍具有更深層次的開發(fā)潛力，如新型堿基編輯系統(tǒng)的開發(fā)、全基因組水平的特異性的提高、堿基編輯材料遞送形式的優(yōu)化等。

(1)開發(fā)新型堿基編輯系統(tǒng)。主要表現(xiàn)在堿基之間可進行顛換的堿基編輯系統(tǒng)的挖掘。以C變G為例，目前已有關(guān)于其設(shè)計思路及相關(guān)專利的報道[134]。當C被胞嘧啶脫氨酶脫氨之后會在UDG的作用下形成AP位點，進而招募TLS聚合酶如Rev1等結(jié)合在此處進行修復(fù)，該酶會在AP位點的對側(cè)鏈偏向性的插入堿基C，留下一個可連接的缺口，最終在DNA連接酶及DNA修復(fù)過程中實現(xiàn)C-G的改變。David R. Liu實驗室公開相關(guān)專利，采用上述思路先后嘗試了多種構(gòu)建策略：rAPOBEC1-d/nCas9-UDG、rAPOBEC1-d/nCas9-UDG變體(UdgX、UdgX*和UdgX_On等)以及rAPOBEC1-d/nCas9-UDG/(UDG變體)+TLS聚合酶(Rev1、Kappa、Lota和Eta)等，經(jīng)測試后發(fā)現(xiàn)只有胞嘧啶脫氨酶同時融合UDG (或UDG變體)和TLS聚合酶時編輯效果最佳，但編輯效率并不理想?？赡茉蛟谟赨DG只有在細胞處于S期才會將U切除形成AP位點，并且TLS聚合酶必須在ssDNA缺口處才能復(fù)制。美國賓夕法尼亞大學(xué)科學(xué)家Kiran S. Gajula針對此問題提出了可能的改善策略，即一方面可人工定向進化Rev1，理想的Rev1應(yīng)具有5?至3?外切酶的活性，同時具有自主打開缺口并牢牢結(jié)合在AP位點處的功能，這樣可大大增加其接觸ssDNA的幾率；另一方面可融合EvolvR系統(tǒng)中的enCas9變體，從而有可能提高C-G的效率[134]。因而，對于C-G及其他堿基之間相互轉(zhuǎn)變的新型單堿基技術(shù)體系的開發(fā)需要不斷的探索及優(yōu)化。此外，如何簡單高效的實現(xiàn)C-T及A-G的同時編輯也值得探索。雖然目前在動植物中已有相關(guān)報道，但均是采用直接融合不同Cas9變體的策略，通過不同Cas9識別不同PAM的特點而實現(xiàn)。但該方案使用的表達載體過大，編輯效率低且能靶向的位點局限性大。因此可嘗試使用不同的適配體如MS2、PP7和boxB等招募不同的脫氨酶等方法，快速而高效的實現(xiàn)不同堿基的同時突變。

(2)提高堿基編輯系統(tǒng)的特異性。主要表現(xiàn)為需要開發(fā)在全基因組范圍具有更高特異性和更高安全性的CBE系統(tǒng)。具體的解決方案可嘗試YEE-BE3等其他新近開發(fā)的CBE堿基編輯器，由于YEE-BE3與DNA的結(jié)合活性較弱，對降低全基因組水平的脫靶效應(yīng)也許會有一定的幫助[29]；或者可人工進化脫氨酶找尋新的變體，在保證其正常編輯效率的同時能從本質(zhì)上解決CBE在全基因組范圍的脫靶。另外，可嘗試優(yōu)化胞嘧啶脫氨酶或UGI組分，如Keith Joung實驗室在相關(guān)國際專利提出初步設(shè)想，即將胞嘧啶脫氨酶分割到兩個載體中表達，一部分與ZF或TALE效應(yīng)因子融合，另一部分與nCas9融合，只有當兩部分同時靶向靶位點時，才能通過內(nèi)含肽二聚化形成具有活性的胞嘧啶脫氨酶，從而有可能降低其在全基因組水平的脫靶風(fēng)險。除了可改進脫氨酶組分之外，也可將nCas9組分替換為在全基因組水平更加特異的其他Cas蛋白，如dSaCas9或者dCas12a。另外，RNP相比DNA在細胞內(nèi)更容易快速降，因此猜測使用CBE RNP形式對降低CBE在全基因組脫靶會有一定的改善效果。

(3)堿基編輯材料的形式及遞送方式方面。如何將堿基編輯材料有效且安全的遞送到細胞內(nèi)是目前堿基編輯系統(tǒng)需要繼續(xù)改進及發(fā)展的重要方面。目前，堿基編輯系統(tǒng)介導(dǎo)的編輯材料包括質(zhì)粒(DNA)、體外轉(zhuǎn)錄物(transcripts, IVTs)以及RNP 3種形式發(fā)揮作用。目前在動物相關(guān)研究中，這3種形式的堿基編輯均已成功報道，主要通過注射、電轉(zhuǎn)、腺相關(guān)病毒(AAV)及陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)，其中以mRNA的形式居多[12]。但如何縮小BE載體大小使其更容易裝載入腺病毒載體、甚至開發(fā)出用于基因治療的新型遞送系統(tǒng)及可直接進行組織特異性的遞送仍需進一步的探索。相比在哺乳動物細胞中的研究，堿基編輯材料的遞送在植物中發(fā)展相對緩慢。對于質(zhì)粒DNA介導(dǎo)的堿基編輯是目前最常用的形式，在植物中可通過基因槍轟擊、農(nóng)桿菌浸染及PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)。但是當DNA整合到基因組中會帶來因堿基編輯DNA元件持續(xù)表達導(dǎo)致的潛在脫靶效應(yīng)的增加，且編輯的產(chǎn)品會引起公眾的擔憂。盡管本研究組采用瞬時表達堿基編輯系統(tǒng)的DNA方式可在一定程度上降低外源DNA的整合[28,82,108]，但不是根本的解決辦法。以堿基編輯IVTs或RNP的形式作為基因組編輯材料可以更加有效避免外源DNA整合事件的發(fā)生，整個過程中不涉及任何外源DNA，因而更有助于避免轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管。本實驗室率先利用BE3 mRNA形式在小麥中實現(xiàn)了基因的編輯[83]。對于RNPs形式的編輯，同樣是本實驗室初步報道了PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在小麥原生質(zhì)體中初步實現(xiàn)了A3A-PBE-ΔUGI RNP的編輯[28]，而對于RNP在植物個體中的堿基編輯并沒有成功案例。因此，在植物中如何高效且安全地將堿基編輯RNP形式遞送到植物細胞中從而獲得DNA-free的突變植株，成為目前植物堿基編輯系統(tǒng)亟待解決的技術(shù)瓶頸。由于在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中對RNP遞送數(shù)量及質(zhì)量均有損失，因此需要摸索RNP各種遺傳轉(zhuǎn)化條件，如測試不同的納米金顆粒包被RNP等。另外，可嘗試一些新型基因組編輯材料遞送方式，如磁納米顆粒轉(zhuǎn)化法、碳納米管轉(zhuǎn)化法、病毒載體轉(zhuǎn)化法等。

總之，堿基編輯技術(shù)在人類疾病研究、動植物科學(xué)基礎(chǔ)研究和育種等方面應(yīng)用前景廣闊，該技術(shù)的進一步優(yōu)化及改造將推動農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，生物醫(yī)藥及生命科學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。

致謝

感謝本實驗室王延鵬青年研究員在圖片制作和文章寫作方面給予的幫助，感謝李超和靳帥博士研究生在文章寫作方面給予的建議。

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Progress on base editing systems

Yuan Zong, Caixia Gao

Base editing is a newly developed precise genome editing technique based on the CRISPR/Cas system. According to different base modification enzymes, the current base editing systems can be divided into cytosine base editors (CBE) and adenine base editors (ABE). They use cytosine deaminases or artificially evolved adenine deaminases to perform single-base editing, and achieve C to T (G to A) or A to G (T to C) substitutions, respectively. Due to high efficiency, independence of DNA double-strand breaks, and no need for donor DNA, base editing systems have been successfully applied in diverse species including animals, plants and other organisms since the first report in 2016. Therefore, base editing systems will have a high prospect of providing important support for gene therapy and crop genetic improvement in the future.In this review, we describe the development and current applications of base editing systems for basic research and biotechnology, highlight the challenges, and discuss the directions for future research in this important field. The information presented may facilitate interested researchers to grasp the principles of base editing, to use relevant base editing tools in their own studies, or to innovate new versions of base editing in the future.

CRISPR/Cas; base editing;cytosine base editor (CBE); adenine base editor (ABE)

2019-07-19;

2019-08-07

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31788103)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31788103)]

宗媛，博士，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: zongyuan@genetics.ac.cn

高彩霞，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物基因組編輯。E-mail: cxgao@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.19-205

2019/8/21 10:05:03

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190821.1004.004.html

(責任編委: 張博)