許孟杰，陳華泉，周雪松

(華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640)

海藻酸鹽可以從天然褐藻中獲得，具有生物相容性、低毒性、成本低廉、容易與二價金屬離子凝膠化等優(yōu)點，被廣泛用于制備水凝膠并應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是蛋白質(zhì)和藥物的傳輸[1]。海藻酸鹽基水凝膠運用于藥物傳輸，一般方法是將目標(biāo)藥物包封在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠中，通過擴散和水凝膠的瓦解來實現(xiàn)藥物穩(wěn)定釋放[2]。纖維素是一種天然高分子，來源廣泛、生物相容性好、無毒，故纖維素被應(yīng)用在藥物醫(yī)學(xué)方面有天然的優(yōu)勢，并有較長的歷史[3]。但以往研究纖維素材料作為藥物載體，僅考慮了單藥物傳輸系統(tǒng)，而缺乏復(fù)合藥物傳輸系統(tǒng)的研究[4]。近5年來，各種生物高分子聚合物(殼聚糖[5]、海藻酸鹽[6-7]、羧甲基纖維素[8])被研究制作多層膜水凝膠材料。本研究旨在開發(fā)陽離子纖維素和陰離子海藻酸鹽的雙膜水凝膠材料，并作為新型復(fù)合藥物載體。因為構(gòu)建水凝膠的兩組分都是天然多糖，故雙膜水凝膠的生物相容性和無毒性得以保證。

對于藥物釋放，如果藥物傳遞系統(tǒng)能逐漸釋放活性成分，則可以確保長時間的治療水平，克服活性物質(zhì)半衰期短的缺點[9]。本研究選用牛血清白蛋白和茶堿為模型藥物，分別擔(dān)載在雙膜水凝膠的內(nèi)外層，探究雙膜水凝膠作為新型藥物載體的復(fù)合藥物釋放效果。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

微晶纖維素、海藻酸鈉(SA)、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G250、氫氧化鈉(NaOH)、脲、氯化鈣(CaCl2)、(3-氯-2羥丙基)三甲基氯化銨溶液(CHPTAC，65%)、茶堿(藥典BP級)均為分析純，無需純化可直接使用。

FTIR-Nexus 670紅外光譜儀；AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振譜儀；EV018掃描電子顯微鏡(SEM)；UV8453紫外分光光度計；Vario EL cue型元素分析儀；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.2 陽離子纖維素的制備

合成路線如下：

按照氫氧化鈉∶脲∶水質(zhì)量比為7∶12∶81 的比例配制 100 g 溶液[10]，放置在冰箱中預(yù)冷至-12 ℃，然后快速將2 g纖維素加入配制好的溶液中，高速攪拌 5 min。隨后，將得到的溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，放入冷凍離心機中，8 000 r/min 條件下離心10 min，除去氣泡和少量未溶解的纖維素，即得透明的濃度為2%纖維素溶液，0～5 ℃下封口存放待用。

將不同量的CHPTAC加入到纖維素溶液中，在25 ℃條件下攪拌反應(yīng)24 h后，用HCl將反應(yīng)后的溶液中和到pH=7。然后加入2倍體積的無水乙醇，攪拌，砂芯漏斗抽濾，無水乙醇洗滌數(shù)次后，于 60 ℃下真空干燥24 h，得到白色顆粒狀固體，即為陽離子纖維素。根據(jù)CHPTAC與纖維素不同的物質(zhì)的量比，合成兩種陽離子纖維素CC-1、CC-2。

1.3 陽離子纖維素的表征

紅外光譜(FTIR)采用傅里葉變換紅外光譜儀，以溴化鉀壓片。核磁分析13C NMR采用核磁共振譜儀，以重水(D2O)為溶劑。

采用元素分析儀測定陽離子纖維素氮元素含量，根據(jù)氮元素的含量計算陽離子纖維素的取代度(DS)，公式為：

1.4 水凝膠的制備

1.4.1 單膜水凝膠 分別配制0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的陽離子纖維素溶液(CC-1)、0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))陽離子纖維素溶液(CC-2)、1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻酸鈉溶液。混合陽離子纖維素溶液和海藻酸鈉溶液，用噴嘴直徑為3 mm的注射器吸取上述混合溶液，將混合溶液通過注射器滴入到0.2 mol/L的CaCl2的水溶液中，交聯(lián)反應(yīng)1 h，產(chǎn)生水凝膠。用去離子水沖洗掉水凝膠表面的Ca2+，然后用濾紙吸收水凝膠表面的水。分別制備出純海藻酸鈉水凝膠(SA)、海藻酸鈉/陽離子纖維素水凝膠(SA/CC-1、SA/CC-2)。

1.4.2 雙膜水凝膠 將制得的單層膜水凝膠放置在1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻酸鈉溶液中，放置不同的時間(5 min，20 min，1 h，3 h，6 h)。當(dāng)單層膜水凝膠吸收完不同量的海藻酸鈉溶液后，將其轉(zhuǎn)移到0.2 mol/L 的CaCl2溶液中交聯(lián)形成第二層海藻酸鈉膜。制備雙層膜水凝膠的路線見圖1。

圖1 單膜和雙膜水凝膠制備流程Fig.1 Preparation process of single-membrane and double-membrane hydrogels

1.5 水凝膠結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 光學(xué)顯微鏡 用光學(xué)顯微鏡觀察單膜、雙膜水凝膠的形貌，放大倍數(shù)為10倍。將球形水凝膠放置在長方形石英比色皿上，然后滴加去離子水直至完全浸沒水凝膠。

1.5.2 掃描電鏡 通過SEM進一步觀察冷凍干燥后的水凝膠的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在觀察之前，所有樣品都鍍金，在10 kV的加速電壓下進行SEM操作。

1.6 體外藥物釋放研究

1.6.1 單膜水凝膠 以牛血清白蛋白為模型藥物探究單膜微球水凝膠體外藥物釋放行為。制備擔(dān)載藥物的微球體水凝膠，首先將牛血清白蛋白溶解在海藻酸鈉、陽離子纖維素混合水溶液中并不斷攪拌，牛血清白蛋白的濃度為0.1%(w/v)。然后吸取上述混合溶液滴加到0.2 mol/L的CaCl2溶液中，交聯(lián)反應(yīng)1 h制得擔(dān)載牛血清白蛋白的微球體水凝膠。將擔(dān)載了藥物的微球體水凝膠分別浸入到pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，溫度為37 ℃的條件下進行藥物釋放性能的研究。分別在pH=2.0和pH=7.4的條件下進行藥物釋放實驗，是模擬人體的胃部和結(jié)腸部位的pH環(huán)境。利用Bradford[11]方法，在預(yù)定的時間點取0.8 mL待測液，用紫外分光光度計測量其在595 nm處的吸光度，進而檢測釋放出牛血清白蛋白的濃度。待測定完成后，向待測液中加入另外的0.8 mL新鮮緩沖液，保持待測液總體積恒定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以確定牛血清白蛋白的累積釋放率。

1.6.2 雙膜水凝膠 兩層膜擔(dān)載不同的藥物，內(nèi)層擔(dān)載牛血清白蛋白，外層擔(dān)載茶堿，研究不同藥物的釋放行為。類似于單層膜藥物釋放研究，將擔(dān)載了藥物的雙層膜水凝膠浸入到pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，溫度為37 ℃的條件下進行藥物釋放性能的研究。在預(yù)定的時間點取3 mL待測液，用紫外分光光度計于波長273 nm處測定溶液的吸光度，進而檢測釋放出茶堿的濃度。同時取0.8 mL待測液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計于波長595 nm處測定溶液的吸光度，確定釋放出的牛血清白蛋白的濃度。測定完成后，向待測液中加入等額的新鮮緩沖液，維持待測液總體積恒定。

1.7 溶脹/侵蝕行為

將雙層膜水凝膠浸沒在pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，研究溶脹行為。在特定的時間間隔，取出吸水后的水凝膠，用濾紙去除水凝膠表面的水分，用質(zhì)量法算出水凝膠的溶脹率(SR)。

其中，Ws是吸水后的水凝膠質(zhì)量，Wd是初始水凝膠的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 陽離子纖維素表征

通過元素分析測定不同樣品(CC-1、CC-2)的氮元素含量及取代度，結(jié)果見表1。

表1 樣品元素分析及取代度Table 1 Elemental analysis and substitutiondegree of samples

陽離子纖維素的紅外光譜見圖2。

圖2 陽離子纖維素(樣品CC-2)紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of cationic cellulose (sample CC-2)

由圖2可知，陽離子纖維素與纖維素最明顯不同之處在于1 474 cm-1處的吸收峰，對應(yīng)于銨鹽基團中的甲基。此外，1 378 cm-1處是C—N鍵的吸收峰。紅外圖譜表明，季銨鹽陽離子基團被成功引入到了纖維素分子鏈上。

將陽離子纖維素溶于氘代水中，其13C NMR 譜圖見圖3。

由圖3可知，化學(xué)位移102.4，78.5分別對應(yīng)于葡萄糖單元上的C1、C4吸收峰；化學(xué)位移73.0處為葡萄糖單元上的C2、C3和 C5的吸收峰；而在此化學(xué)位移處還有一吸收峰，幾乎與 C2，3，5的吸收峰重合，應(yīng)歸屬于陽離子醚化劑3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CHPTAC)中亞甲基中的碳原子(C7)；化學(xué)位移60.0對應(yīng)于亞甲基碳C6；在化學(xué)位移68.2處為季銨鹽陽離子基團中位于氮原子與羥基碳原子之間的碳原子(C9)；位于65.2處的吸收峰則歸屬于陽離子醚化劑中連接羥基的碳原子(C8)；在 54.4附近有一個強烈的吸收峰，應(yīng)為季銨鹽陽離子基團中連接氮原子的三個甲基碳原子(C10)吸收峰。根據(jù)碳譜的結(jié)果，進一步證明，在NaOH/脲溶劑體系中，成功合成了陽離子纖維素。

圖3 陽離子纖維素的13C NMR譜圖(樣品CC-2，DS=0.41)Fig.3 13C NMR spectra of cationic cellulose

2.2 水凝膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)

用光學(xué)顯微鏡觀察球體單膜和雙膜水凝膠的結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。通過控制吸收純海藻酸鈉的時間，水凝膠外層膜的厚度從35(5 min)～700 μm(3 h)。具體厚度見表2。因為水凝膠的厚度太小或太大都不利于藥物的控制釋放，故在進行水凝膠的復(fù)合藥物釋放研究時，選用了持續(xù)吸附純海藻酸鈉1 h而制備成的雙膜水凝膠。

圖4 水凝膠的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 Optical microscopic photographs of hydrogels

樣品樣品厚度/μm5 min20 min1 h3 hSA/CC-135.388.2152.9682.4SA/CC-241.2105.9164.7710.5

水凝膠冷凍干燥后，用掃描電鏡觀察其整體和內(nèi)部的形貌，結(jié)果見圖5。

圖5 水凝膠的SEM圖Fig.5 SEM images of hydrogels a.SA單膜水凝膠；b.SA/CC-2單膜水凝膠； c.SA/CC-2-1h雙膜水凝膠；d.SA/CC-2-3h雙膜水凝膠

由圖5a和5b可知，SA/CC單膜水凝膠與SA水凝膠的塌陷表面形態(tài)相比，表現(xiàn)出更規(guī)則和完全球形的形態(tài)。這是由于剛性纖維素的存在，可以防止海藻酸鈉基水凝膠結(jié)構(gòu)倒塌和增強其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。由圖5c和5d可知，SA/CC-1h和SA/CC-3h水凝膠的雙膜結(jié)構(gòu)，一個薄薄的外膜覆蓋了內(nèi)部水凝膠表面。

2.3 單膜水凝膠的藥物釋放特性

單膜水凝膠的藥物釋放行為(BSA)是pH敏感的，在溫度37 ℃，pH=7.4和pH=2.0緩沖液中3種單膜水凝膠的累積藥物釋放曲線見圖6。

由圖6a可知，在pH=7.4條件下，3種單膜水凝膠SA、SA/CC表現(xiàn)出不同的藥物釋放行為。與純海藻酸鈉水凝膠SA快速釋放牛血清蛋白(3 d)相比，SA/CC-1水凝膠釋放牛血清白蛋白的效果明顯緩慢，延長至6 d，SA/CC-2甚至可以控制釋放至8 d。在形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，SA/CC水凝膠能延緩牛血清白蛋白釋放，一是相比于SA水凝膠，剛性纖維素鏈的存在可延長藥物擴散的路徑；二是陽離子纖維素與海藻酸鹽之間存在強的靜電作用，可以進一步延緩藥物的釋放，故陽離子化程度更高的SA/CC-2水凝膠控釋牛血清白蛋白的效果最好。由圖6b可知，在pH=2.0的條件下，所有水凝膠的牛血清白蛋白釋放量明顯減少，因為海藻酸鹽在酸性條件下會變得更緊密，滲透性更低。同樣由于陽離子纖維素與海藻酸鹽之間的靜電作用，SA/CC-1和SA/CC-2水凝膠的3%牛血清白蛋總釋放量，明顯低于SA水凝膠的6%總釋放量。

圖6 單膜水凝膠的牛血清白蛋白釋放研究Fig.6 Bovine serum albumin release of single-membrane hydrogela.pH=7.4；b.pH=2

2.4 雙膜水凝膠的復(fù)合藥物釋放特性

由圖7可知，關(guān)于茶堿的釋放，SA/CC-1-1h，SA/CC-2-1h雙膜水凝膠表現(xiàn)出相似的行為，即pH=7.4條件下藥物分子在3 d內(nèi)快速釋放。這兩種水凝膠有相同組分和結(jié)構(gòu)，快速釋放茶堿可歸因于外部純海藻酸鹽膜的溶脹和崩解。在茶堿釋放的前3 d期間，沒有檢測到牛血清白蛋白的釋放，這表明復(fù)合藥物是從雙膜水凝膠中有序釋放出來的。對于SA/CC-1-1h雙膜水凝膠，牛血清白蛋白在4 d后開始釋放，并從第6 d到第8 d快速釋放，第9 d達到平衡。然而，SA/CC-2-1h雙膜水凝膠表現(xiàn)出不同的牛血清白蛋白藥物釋放行為，其藥物的持續(xù)釋放延長至7～8 d(從第4 d開始釋放并在第11 d或第12 d 達到平衡)。這種結(jié)果和研究單膜水凝膠藥物釋放行為類似，即作為水凝膠組分之一的纖維素的陽離子化程度越高，兩組分之間的靜電作用更強，藥物的延緩釋放效果越顯著。

圖7 在pH=7.4緩沖溶液中雙膜水凝膠的復(fù)合藥物釋放曲線Fig.7 Complexing drug release curve of double-membrane hydrogel in pH=7.4 buffer solution

2.5 溶脹侵蝕行為

為了探究復(fù)合藥物釋放的過程，在pH 7.4和pH 2.0條件下對SA/CC-2-1h雙膜水凝膠進行溶脹/侵蝕實驗，結(jié)果見圖8。

圖8 在pH=7.4(a)和pH=2(b)條件下SA/CC-2-1h雙膜水凝膠的溶脹/侵蝕行為Fig.8 Swelling/erosion behavior of the SA/CC-2-1h double-membrane hydrogel under pH 7.4 and pH 2.0 conditions

由圖8可知，基于雙膜水凝膠內(nèi)外膜不同的結(jié)構(gòu)特點，溶脹/侵蝕展現(xiàn)出兩個不同的過程。pH=7.4時水凝膠的外層膜在第1 d吸水溶脹，然后溶脹率從第1 d～第3 d逐漸減少，這可歸因于外膜水凝膠的逐漸侵蝕。在3 d后，外層全部被侵蝕，內(nèi)層水凝膠吸水溶脹，溶脹率重新上升，持續(xù)5 d，在第8 d能達到180%的最高溶脹率。8 d后，雙膜水凝膠中的內(nèi)膜水凝膠開始侵蝕，故溶脹率第二次下降。而pH 2.0條件下雙膜水凝膠的溶脹/侵蝕行為則不同，10 d后SA/CC-2-1h表現(xiàn)出很小的溶脹/侵蝕率，為-4%，表明了在酸性條件下海藻酸鹽基水凝膠的收縮行為和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。溶脹/侵蝕結(jié)果反映了SA/CC-2-1h雙膜水凝膠在不同pH條件下的結(jié)構(gòu)變化，這與復(fù)合藥物釋放行為基本一致。

基于單膜和雙膜水凝膠的體外藥物釋放和溶脹行為的結(jié)果，可以提出由陽離子纖維素和陰離子SA制備的雙膜水凝膠可能的復(fù)合藥物釋放模型，見圖9。

圖9 在pH=7.4下，雙膜水凝膠的復(fù)合藥物釋放過程Fig.9 Complexing drug release process of double-membrane hydrogel at pH=7.4

由圖9可知，在pH 7.4條件下，純海藻酸鹽的外膜經(jīng)歷溶脹，部分和完全瓦解，快速釋放茶堿。對于內(nèi)膜，存在剛性的陽離子纖維素鏈與陰離子海藻酸鹽之間的靜電相互作用，促進了內(nèi)部水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此，在pH 7.4條件下，內(nèi)膜經(jīng)歷比外膜更長的溶脹和瓦解過程，故內(nèi)部水凝膠擔(dān)載的藥物可以實現(xiàn)緩慢釋放。值得注意的是，作為藥物傳輸系統(tǒng)的雙膜水凝膠實現(xiàn)了復(fù)合藥物釋放，其中一種藥物快速釋放，另一種藥物緩慢釋放。

3 結(jié)論

制備出了海藻酸鹽/纖維素雙膜水凝膠，并作為一種新型復(fù)合藥物載體。內(nèi)膜中存在陽離子纖維素，可以通過其與陰離子海藻酸鹽之間的靜電相互作用增強水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。內(nèi)外部水凝膠的不同組成和特性使得藥物釋放的效果不同，在復(fù)合藥物的傳輸中，達到快速釋放茶堿和持續(xù)緩慢釋放牛血清白蛋白的目的。本研究中生物相容性水凝膠展現(xiàn)出特殊的雙膜結(jié)構(gòu)和復(fù)合藥物控釋行為，可以應(yīng)用到口服給藥等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。