王菲，于蘇琦，宋力，侯雨歌

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

金花葵花黃酮是一種安全、無毒、易制備的生物活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化和抗菌等活性[1]。但若直接作為生物保鮮劑使用，其穩(wěn)定性稍差，且保鮮時(shí)間較短，實(shí)際應(yīng)用受到極大限制。

冷鮮肉含豐富營養(yǎng)，但冷鮮肉如何保鮮成為業(yè)界面臨的難題[2]。冷鮮肉富有水分，長時(shí)間、無任何措施的放置會(huì)出現(xiàn)干癟、腐爛等狀況，造成嚴(yán)重浪費(fèi)。通過微膠囊技術(shù)可以在一定程度上保護(hù)活性物質(zhì)不受外界不良因素(如光、熱等)的影響[3-4]，穩(wěn)定性高、緩釋性好、產(chǎn)率高、保鮮效果理想，可控制水分流失，抑制微生物生長與繁殖，延緩冷鮮肉發(fā)生腐敗變質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

金花葵花，由遼寧恒生實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供；新鮮豬后腿肉，市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純；無水乙醇、鹽酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鈉、硼酸、氧化鎂、溴甲酚綠、甲基紅、殼聚糖均為分析純；安琪酵母，購自超市；酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉均為生物試劑；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

AR124CN電子天平；ALC-1100.2電子天平；UV-2600可見分光光度計(jì)；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 金花葵花黃酮酵母微膠囊制備

1.2.1 金花葵花總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取一定量金花葵花粉末，按料液比1∶30 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液，在60 ℃水浴提取2.5 h，離心，取上清液，濃縮，冷凍干燥后備用。

1.2.2 酵母細(xì)胞制備 稱取一定量安琪干酵母，按1∶20 g/mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl，在54 ℃水浴振蕩5 h，離心后水洗2次。冷凍干燥，得到酵母細(xì)胞。

1.2.3 金花葵花總黃酮酵母微膠囊制備 稱取一定量酵母細(xì)胞，加入10 mL金花葵花總黃酮濃縮液，水浴振蕩6 h，離心，水洗3次。冷凍干燥，得到金花葵花總黃酮酵母微膠囊[5]。

1.3 保鮮冷鮮肉

1.3.1 冷鮮肉的處理 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，先用75%酒精進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)用具的消毒滅菌工作，再經(jīng)20 min紫外照射滅菌處理。在無菌操作下，清理掉豬后腿冷鮮肉的筋、膜及脂肪，切成140 g/塊。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即空白組、2%黃酮粗提液組、2%黃酮酵母微膠囊組(以黃酮含量計(jì))和2%殼聚糖組。在這3種不同保鮮液中進(jìn)行浸泡30 min，夾出并晾干，置于自封袋中排氣封口。與空白組一同放入4 ℃冰箱冷藏[6]。于第0，1，3，5，7，9 d取出，測定并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)的微生物指標(biāo)和理化指標(biāo)。

1.3.2 測定指標(biāo)

1.3.2.1 汁液損失率 原料肉中汁液損失的質(zhì)量占原料肉的質(zhì)量百分比即為汁液損失率。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天稱取每塊冷鮮肉初始質(zhì)量(M)和托盤質(zhì)量(m)。于第1，3，5，7，9 d取出肉樣，將汁液倒盡，瀝干水分，再次稱取肉塊與托盤的總質(zhì)量(W)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的汁液損失率(X，%)。

1.3.2.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 參照GB/T 5009.228—2016，從各實(shí)驗(yàn)組稱取10.00 g肉樣，剪碎，放在三角瓶中，加入100 mL水，搖勻，浸泡0.5 h，過濾，留濾液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，事先在三角瓶中裝好已加入5～6滴混合指示液的2%硼酸吸收液10 mL，注意將蒸餾器的冷凝管下部插至三角瓶內(nèi)液面下，以防漏氣。準(zhǔn)確吸取各實(shí)驗(yàn)組樣品濾液10 mL，加入蒸餾器反應(yīng)室中，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% MgO混懸液，立即蓋塞，做好水封。通入加熱蒸汽發(fā)生器，當(dāng)蒸餾裝置中充滿蒸汽時(shí)，立即關(guān)閉蒸汽出口管，從第1滴冷凝水產(chǎn)生時(shí)開始計(jì)時(shí)，5 min后停止蒸餾。移走吸收液，用0.01 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，滴定終點(diǎn)為藍(lán)紫色[7]。同時(shí)做試劑空白。

1.3.2.3 pH值 從各實(shí)驗(yàn)組稱取10.00 g樣品，剪碎，加入蒸餾水90 mL，振蕩0.5 h，過濾、取濾液，測定各實(shí)驗(yàn)組的pH值。

1.3.2.4 菌落總數(shù) 參照GB 4789.2—2010，在無菌條件下，從各實(shí)驗(yàn)組稱取10.00 g樣品，剪碎，置于事先盛有90 mL 0.85%無菌生理鹽水的三角瓶中，封口，于搖床中充分振搖3 min。吸取1 mL上清液，并進(jìn)行10倍遞增稀釋，從中挑選適當(dāng)稀釋度的樣液倒入，再慢慢倒入PCA培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，于第1，3，5，7，9 d對各實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 金花葵花總黃酮微膠囊制備條件優(yōu)化

主要考察芯壁比(黃酮含量與預(yù)處理酵母細(xì)胞質(zhì)量之比)、振蕩溫度和振蕩時(shí)間對金花葵花總黃酮微膠囊包埋效果(包埋率)的影響。

2.1.1 芯壁比對包埋率的影響 稱取一定量預(yù)處理過的酵母細(xì)胞6份，分別按芯壁比4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4加入10 mL總黃酮濃縮液，于60 ℃下恒溫水浴中振蕩6 h，離心、冷凍干燥，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的包埋率，結(jié)果見圖1。

圖1 芯壁比對包埋率的影響Fig.1 Effect of core wall

由圖1可知，芯壁比增大時(shí)，包埋率先緩慢增長，隨后快速上升，芯壁比1∶3時(shí)包埋率達(dá)到最大，隨后包埋率逐漸減小。這是因?yàn)榻湍讣?xì)胞對黃酮的包埋有一定的承載能力，因此隨芯壁比增加，酵母細(xì)胞對黃酮的包埋能力逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)芯壁比達(dá)到 1∶3 時(shí)，酵母細(xì)胞對黃酮的包埋能力已經(jīng)飽和，若再繼續(xù)增加壁材用量，會(huì)出現(xiàn)包埋量超載的問題，影響包埋率[6]。

2.1.2 振蕩溫度對包埋率的影響 稱取一定量預(yù)處理過的酵母細(xì)胞5份，各按芯壁比1∶1加入10 mL總黃酮濃縮液，分別在30，40，50，60，70 ℃的恒溫水浴振蕩6 h，離心、冷凍干燥，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的包埋率，結(jié)果見圖2。

圖2 振蕩溫度對包埋率的影響Fig.2 Effect of vibration temperature

由圖2可知，隨著振蕩溫度增加，包埋率先增大后逐漸減小。振蕩溫度為40 ℃時(shí)包埋率最大。主要是由于在一定振蕩溫度范圍內(nèi)，溫度逐漸升高時(shí)，黃酮分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，有助于酵母細(xì)胞包埋黃酮。但當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)過于劇烈，反而破壞包埋效果，包埋率顯著減小[8]。故振蕩的適宜溫度為40 ℃。

2.1.3 振蕩時(shí)間對包埋率的影響 稱取一定量預(yù)處理過的酵母細(xì)胞5份，各按芯壁比1∶1加入10 mL總黃酮濃縮液，于60 ℃水浴中分別振蕩2，4，6，8，10 h后，離心、冷凍干燥，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的包埋率，結(jié)果見圖3。

圖3 振蕩時(shí)間對包埋率的影響Fig.3 Effect of vibration time

由圖3可知，隨振蕩時(shí)間延長，包埋率先增大后逐漸減小，在振蕩7 h時(shí)包埋率達(dá)到最大值。這是因?yàn)榻湍讣?xì)胞主要是借助由細(xì)胞內(nèi)外濃度差而產(chǎn)生的擴(kuò)散作用進(jìn)行黃酮包埋[9]。振蕩初期，隨著時(shí)間延長，黃酮的擴(kuò)散作用加快，被酵母細(xì)胞很好地包埋，包埋率不斷增大。但繼續(xù)增加振蕩時(shí)間，反而導(dǎo)致已經(jīng)被包埋的黃酮從酵母細(xì)胞中擴(kuò)散出來，使得包埋率驟降。故振蕩時(shí)間宜為7 h。

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察芯壁比、振蕩溫度和振蕩時(shí)間對微膠囊包埋率的影響，確定制備金花葵花總黃酮微膠囊化最適條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The resalt of orthogonal test

表2 方差分析結(jié)果Table 2 The result of variance analysis

由表1可知，最佳因素水平組合為A2B2C1，即芯壁比為1∶3，振蕩溫度為30 ℃，振蕩時(shí)間為7 h。按此條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得包埋率分別為55.16%，50.33%，56.09%，平均包埋率為53.86%，大于表1中所有實(shí)驗(yàn)組的最大包埋值(52.3%)，故此因素水平組合即為金花葵花總黃酮酵母微膠囊化的最適條件。將3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所制備的微膠囊進(jìn)行混合，測定并計(jì)算得到其中黃酮含量為55.19 mg/g。

由表1可知，各因素對包埋效果的影響程度為：A>C>B，即芯壁比>振蕩溫度>振蕩時(shí)間，其中，芯壁比對包埋率影響最大。

對于表2，查F分布臨界表，F(xiàn)0.01(2，2)=99，F(xiàn)0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.1(2，2)=9；當(dāng)F(2，2)>F0.01(2，2)時(shí)顯著記為**，當(dāng)F(2，2)值介于F0.05(2，2)～F0.01(2，2)之間時(shí)顯著記為*，當(dāng)F(2，2)

2.2 冷鮮肉保鮮效果

2.2.1 汁液損失率 在實(shí)際的加工生產(chǎn)和貯存中，冷鮮肉常常會(huì)發(fā)生揮發(fā)、汁液流失等現(xiàn)象，會(huì)嚴(yán)重影響其營養(yǎng)價(jià)值、感官價(jià)值和銷售價(jià)值，故可用汁液損失率來衡量肉質(zhì)持水力[10]。各實(shí)驗(yàn)組中汁液損失率見圖4。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組中汁液損失率的變化Fig.4 Changes of the juice loss rate in each experimental group

由圖4可知，冷鮮肉保藏時(shí)間越長，其汁液損失率越大。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，黃酮粗提液組汁液損失率變化幅度最大，酵母微膠囊組和空白組次之，而殼聚糖組汁液損失率變化幅度最小。在實(shí)驗(yàn)的前5 d 里，酵母微膠囊組的汁液損失率變化最小，這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)初期，即前5 d的時(shí)間里，微膠囊組冷鮮肉的表面黃酮濃度較低，故與黃酮粗提液組相比，滲透到肉內(nèi)部的黃酮量更少，故持水力與空白組接近，且好于黃酮粗提液組；但隨保存時(shí)間延長，第5 d以后，微膠囊組中的黃酮不斷被釋放出來，造成冷鮮肉表面不斷滲透進(jìn)黃酮，形成濃度差，從而導(dǎo)致冷鮮肉失水加劇。綜上分析可知，酵母微膠囊及殼聚糖都有一定的持水作用。

2.2.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 由于冷鮮肉自身含有酶類及微生物，此外還受到來自于環(huán)境中微生物的污染，故在貯存期間，其所含蛋白質(zhì)會(huì)被酶及微生物分解，從而產(chǎn)生具有揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì)，如氨及胺類等。變質(zhì)肉中揮發(fā)性鹽基氮含量高(TVB-N)，大于20 mg/100 g[5]。不同實(shí)驗(yàn)組的TVB-N含量見圖5。

由圖5可知，不同實(shí)驗(yàn)組的TVB-N含量不同，但變化規(guī)律一致。酵母微膠囊處理、黃酮粗提液組以及殼聚糖組在第9 d時(shí)，其所含TVB-N含量均低于20 mg/100 g，均未超標(biāo)。但空白組TVB-N含量一直高于其他三組，且在第7 d時(shí)數(shù)值高于20 mg/100 g，說明此時(shí)肉質(zhì)已經(jīng)變質(zhì)。結(jié)果表明，酵母微膠囊組TVB-N明顯小于空白組，其能有效抑制微生物的生長繁殖，延長貨架期。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組中揮發(fā)性鹽基氮的變化Fig.5 Changes of TVB-N in each experimental group

2.2.3 pH值 冷鮮肉在貯存過程中pH值會(huì)逐漸增大，肉質(zhì)變差，這主要是因?yàn)槔漉r肉中蛋白質(zhì)會(huì)被其所含酶和微生物分解而產(chǎn)生氨及胺類等堿性化合物[10]。各實(shí)驗(yàn)組中冷鮮肉pH值見圖6。

圖6 各實(shí)驗(yàn)組中pH的變化Fig.6 Changes of pH in each experimental group

由圖6可知，各實(shí)驗(yàn)組中冷鮮肉pH值均隨時(shí)間延長而不斷增大，但增長幅度各不相同，即黃酮粗提液組<殼聚糖組<酵母微膠囊組<空白組，即黃酮粗提液組能較好地抑制pH增長。這是黃酮粗提液組中黃酮含量很高，能效抑制微生物生長，延緩蛋白質(zhì)分解，使pH保持較低值。殼聚糖組中殼聚糖具有成膜性，能減小肉質(zhì)與氧氣的接觸，抑制微生物生長繁殖以及對蛋白質(zhì)的分解作用。酵母微膠囊組pH值比前兩組稍高一些，主要是由于酵母微膠囊組具有緩慢釋放黃酮的作用，開始幾天黃酮濃度較低，抑菌作用較弱，隨時(shí)間延長，大量黃酮被釋放出來，有效抑制微生物的生長，故第7 d以后，pH值激增的趨勢被抑制。綜上可知，3種保鮮液對冷鮮肉均具有一定的保鮮作用。

2.2.4 菌落總數(shù) 隨保存時(shí)間延長，冷鮮肉中的菌落總數(shù)逐漸增多，當(dāng)達(dá)到6 lgcfu/g時(shí)，說明肉已經(jīng)腐敗變質(zhì)[3]。指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：一級(jí)鮮肉菌落總數(shù)≤104cfu/g；二級(jí)鮮肉104cfu/g<菌落總數(shù)≤106cfu/g；腐敗肉菌落總數(shù)>106cfu/g[10-11]。各實(shí)驗(yàn)組冷鮮肉中的菌落總數(shù)見圖7。

圖7 各實(shí)驗(yàn)組中菌落總數(shù)的變化Fig.7 Changes of colonies number in each experimental group

由圖7可知，各實(shí)驗(yàn)組中保鮮劑的抑菌性能力不同，即酵母微膠囊組>殼聚糖組>黃酮粗提液組>空白組。經(jīng)過不同保鮮液處理的實(shí)驗(yàn)組，其菌落總數(shù)均明顯低于空白組。且空白組在第9 d時(shí)菌落總數(shù)為8.15 lgcfu/g，已達(dá)到腐敗肉的標(biāo)準(zhǔn)。而另外三組在實(shí)驗(yàn)的9 d內(nèi)，仍處于二級(jí)鮮肉標(biāo)準(zhǔn)。其中，酵母微膠囊組表現(xiàn)的抑菌性最佳，這是由于黃酮較好的抑菌性以及微膠囊的緩釋作用而實(shí)現(xiàn)的，且在第9 d時(shí)菌落總數(shù)為6.51 lgcfu/g，為所有實(shí)驗(yàn)組中的最低值。表明酵母微膠囊組具有較好的抑菌效果。

3 結(jié)論

(1)金花葵花總黃酮的酵母微膠囊化最適條件：芯壁比1∶3，振蕩溫度30 ℃，振蕩時(shí)間7 h，此時(shí)微膠囊包埋率可達(dá)53.86%。

(2)與空白組相比，各保鮮液對冷鮮肉都有一定保鮮作用，酵母微膠囊與殼聚糖的保鮮效果十分接近。金花葵花總黃酮酵母微膠囊在汁液損失率、揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了較好的保鮮，可保鮮9 d左右。