王田田, 孟小靖, 馬沁沁, 雍彬, 苗玉志

四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤內(nèi)可培養(yǎng)放線菌功能多樣性

王田田, 孟小靖, 馬沁沁, 雍彬, 苗玉志*

四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 四川成都 610101

以四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤為對(duì)象, 利用4種放線菌分離培養(yǎng)基篩選其中的放線菌, 采用基于16S rRNA 基因的PCR-RFLP方法結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行鑒定。通過(guò)測(cè)定各分離菌株搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液中酶活性或代謝產(chǎn)物獲取各菌株降解碳水化合物以及產(chǎn)促生劑的能力, 采用平板對(duì)峙法測(cè)定各菌株抗病原真菌活性。結(jié)果共分離得到125株放線菌, 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察去重復(fù)得到57株(W1-W57), 經(jīng)多樣性分析將其歸于3個(gè)屬的23個(gè)種, 其中以鏈霉菌屬最多(91.3%), 功能分析表明: 有23株、17株、15株和18株放線菌能分別降解1,3--葡聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素和果膠, 其中有47.8%、26.1%和26.1%的菌株能同時(shí)降解4、3和2類碳水化合物; 有19株、3株和2株放線菌分別能產(chǎn)含鐵載體、IAA和ACC脫氨酶, 其中有21.7%、56.6%和21.7%的菌株能分別產(chǎn)生3、2和1種根際促生劑; 有10株放線菌表現(xiàn)出對(duì)不止一種病源真菌的拮抗能力, 其中菌株W2和W19對(duì)4種病源真菌同時(shí)具有拮抗活性, 且這2株菌對(duì)4種病源真菌抑菌能力比其他菌強(qiáng); 同時(shí)獲得了包括W2、W3、W17、W19、W20、W34、W36和W54等在內(nèi)的多功能高活性菌株, 該研究表明四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根土壤內(nèi)含豐富的多功能放線菌。所獲結(jié)果可為我國(guó)印度塊菌人工種植新技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新思路。

印度塊菌; 根際土壤; 可培養(yǎng)放線菌; 功能多樣性

0 前言

塊菌屬于典型的地下共生菌根真菌, 由于生長(zhǎng)過(guò)程中菌絲體和共生菌根分泌代謝產(chǎn)物的化感作用, 在其菌根根際土壤中產(chǎn)生了獨(dú)特的微生物群落, 它們?cè)谧匀坏乩硪蜃拥拿{迫下作用于生境土壤, 形成了具有多重營(yíng)養(yǎng)功能的生態(tài)復(fù)合體, 對(duì)塊菌的生長(zhǎng)起著重要作用[1-2]。因而塊菌菌根土壤細(xì)菌群落功能的研究成為了塊菌生物學(xué)當(dāng)前的熱點(diǎn)[3]。在塊菌菌根土壤細(xì)菌群落功能研究中, Antony-Babu等[4]采用溫度梯度凝膠電泳(TGGE)和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對(duì)黑孢塊菌(Tuber melanosporum)菌根土壤細(xì)菌群落進(jìn)行了分析, 預(yù)測(cè)了它們?cè)趬K菌生長(zhǎng)中的重要作用。Picceri等[5]和Gryndler等[6]發(fā)現(xiàn)塊菌菌根土壤細(xì)菌群落同塊菌生境中營(yíng)養(yǎng)組分的變化密切相關(guān), 并且其土壤有效營(yíng)養(yǎng)的改變依賴不同細(xì)菌群落的具體功能。Antony等[7]通過(guò)采用時(shí)相溫度梯度凝膠電泳(TTGE)和功能基因芯片技術(shù)(FAGs)對(duì)黑孢塊菌生境細(xì)菌群落及功能研究表明它們?cè)趬K菌子囊果形成階段具有提供有效營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)共生競(jìng)爭(zhēng)和促進(jìn)滲透吸收等重要作用。王冉等[8]將印度塊菌(T. inducum)菌根土壤中分離到的細(xì)菌與不同濃度的塊菌孢子混合接種于華山松上, 揭示了菌根土壤細(xì)菌對(duì)塊菌菌絲生長(zhǎng)的顯著促進(jìn)作用。Sbrana等[9]通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)的方法篩選到17株能促進(jìn)塊菌子囊果形成的芽孢桿菌。Alfonso等[10]通過(guò)功能菌株分離鑒定以及促生實(shí)驗(yàn), 獲得了大量的活性功能菌株, 證實(shí)了它們具有促進(jìn)塊菌菌根化和刺激生長(zhǎng)等功能。但這些成果缺乏對(duì)特定生境塊菌菌根土壤細(xì)菌群落功能進(jìn)行系統(tǒng)研究。因而, 塊菌特定生長(zhǎng)區(qū)域菌根土壤功能細(xì)菌群落的研究仍需我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

放線菌屬微生物是眾所周知的胞外酶生產(chǎn)者, 包括纖維素酶, 葡聚糖酶, 淀粉酶, 蛋白酶, 幾丁質(zhì)酶和其他重要次級(jí)代謝產(chǎn)物。大量研究表明, 放線菌廣泛分布于不同的土壤生態(tài)環(huán)境中, 它們通過(guò)產(chǎn)生各種功能酶高效調(diào)節(jié)土壤中有機(jī)質(zhì)的分解或合成, 改善土壤肥力, 促進(jìn)植物生長(zhǎng)[11-13], 這些研究表明放線菌的作用在維持土壤生態(tài)功能方面具有非常重要的作用, 表現(xiàn)出極為顯著的功能多樣性[14]。Barbieri等[15]研究表明在黑孢塊菌生境中含豐富的放線菌屬微生物, Pavic等[16]從黑孢塊菌子囊果中分離到屬于放線菌屬的萎蔫短小桿菌()和紅球菌(sp.)進(jìn)行了特征化并對(duì)其功能研究, 發(fā)現(xiàn)它們具有降解幾丁質(zhì)、溶解Ca3(PO4)2、富集鐵離子和固氮等功能, 用以提供塊菌生長(zhǎng)過(guò)程中所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Goudjal等[17]對(duì)沙漠塊菌(Tul.)共生放線菌進(jìn)行了分離, 獲得了鏈霉菌(sp.strain TL7)等7株鏈霉菌, 對(duì)其功能研究表明它們具有抗真菌活性、產(chǎn)鐵載體活性以及調(diào)控和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用。這些研究表明塊菌生境中的放線菌都具有特定的功能作用。

四川攀枝花是中國(guó)塊菌產(chǎn)區(qū)的天然分布中心區(qū)域, 是中國(guó)塊菌之鄉(xiāng), 其中印度塊菌是其目前產(chǎn)量最大且分布最廣的塊菌種類[18], 其菌根根際土壤細(xì)菌群落已經(jīng)得到廣大科研工作者的研究[19-20], 但均未涉及特定功能放線菌。因此, 有必要開(kāi)展該地區(qū)塊菌菌根根際土壤中可培養(yǎng)放線菌功能的研究。本文以四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤為對(duì)象, 利用4種放線菌分離培養(yǎng)基篩選放線菌, 采用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP方法結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行鑒定, 通過(guò)測(cè)定各分離菌株搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液中酶活性或代謝產(chǎn)物獲取各菌株降解碳水化合物以及產(chǎn)促生劑的能力, 采用平板對(duì)峙法測(cè)定各菌株抗病源真菌活性, 所獲結(jié)果可為我國(guó)印度塊菌人工種植新技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新思路及提供工業(yè)化的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

樣品采集分別選擇四川攀枝花地區(qū)印度塊菌產(chǎn)量相對(duì)較高的阿拉鄉(xiāng)(26°35'02N; 101°66'76E)、中壩鄉(xiāng)(26°38'96N; 101°67'01E)、格里坪鎮(zhèn)(226°62'66N; 101°51'44E)共計(jì)3個(gè)代表位點(diǎn)進(jìn)行土壤樣本采集。為保證樣本采集的有效性, 通過(guò)探測(cè)到各位點(diǎn)共生菌根根際土壤附近有成熟塊菌子囊果后確定為土壤樣本采集菌塘。取樣于2017 年11 月22日和23日進(jìn)行, 每個(gè)位點(diǎn)選擇3個(gè)菌塘, 用無(wú)菌小鏟于土層深度5—8 cm處分別取約200 g菌根根際土壤混合均勻作為一個(gè)位點(diǎn)的土樣, 3個(gè)位點(diǎn)的土壤樣本各取200 g混合后作為代表性樣本分裝于無(wú)菌袋帶回實(shí)驗(yàn)室立即處理。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性核酸內(nèi)切酶(I、II和III)、DNA Taq聚合酶和DNA Marker: 上海英俊生物公司; 幾丁質(zhì): 成都康迪生物公司, N-乙酰-D-氨基葡萄糖和大豆粉: 博奧維新公司生產(chǎn); 細(xì)菌DNA提取試劑盒: 天根生物公司; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。恒溫培養(yǎng)箱(THZ-300): 上海恒科儀器有限公司; 全自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(G154DW): 廈門致微儀器有限公司; PCR儀: 德國(guó)耶拿公司; 電泳儀和凝膠成像系統(tǒng): Bio-RAD公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)四種放線菌分離培養(yǎng)基: 高氏1號(hào)(g·L-1): 可溶性淀粉20, MgSO4?7H2O 0.5, FeSO4?7H2O 0.01, K2HPO40.5, NaCl 0.5, KNO31.0, 瓊脂15、Tap Water Yeast瓊脂[17]、Waksman培養(yǎng)基和Waksman albumin瓊脂[21]; 每個(gè)培養(yǎng)基補(bǔ)充50 mg·L-1的制霉菌素和50 mg·L-1萘啶酮酸抑制真菌和其他細(xì)菌的生長(zhǎng); (2)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶放線菌分離培養(yǎng)基(g·L-1): 膠體幾丁質(zhì) 12.5、蛋白胨 2、K2HPO40.5、KNO31、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01; 產(chǎn)1,3--葡聚糖酶放線菌分離培養(yǎng)基(g·L-1): 燕麥粉 3.0、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO40.1、CaCO30.5、(NH4)2SO40.5、MgSO4·7H2O 0.01、NaNO30.4; 產(chǎn)纖維素酶放線菌分離培養(yǎng)基(g·L-1): CMC 20、Na2HP042.5、KH2P041.5、蛋白胨 2.5、酵母膏 0.5; 果膠酶: 蔗糖 20, 果膠 10, (NH4)2SO40.2, K2HPO40.3, MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 放線菌的分離及初篩

各取1 g菌根土壤溶于10 mL無(wú)菌水中充分搖勻后按照10-1到10-6進(jìn)行梯度稀釋, 取各稀釋梯度100 μL分別涂布于四種不同放線菌分離平板28 ℃培養(yǎng)15 d, 挑取單菌落菌株分別劃線涂布各分離平板培養(yǎng)獲得單菌落用于初篩。初篩采用形態(tài)學(xué)觀察: 觀察放線菌在各平板上的形態(tài)以及培養(yǎng)特征并記錄; 然后挑取菌體顯微涂片, 于普通光學(xué)顯微鏡下觀察, 記錄各菌株的顯微形態(tài), 根據(jù)培養(yǎng)特征和顯微特征進(jìn)行分類并去重復(fù), 然后挑取不同菌株制備菌懸液, 用25%的甘油于-20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 放線菌多樣性分析

1.3.1 基因組提取和16S rRNA擴(kuò)增

所有菌株基因組的提取采用天根基因組試劑盒并按操作說(shuō)明進(jìn)行。16S rRNA擴(kuò)增引物為27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TAC-GGYTACCTTGTTACGACTT), 擴(kuò)增體系為: 10× Buffer 2.5 μL, 模板DNA 1 μL, Taq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL, dNTPs (2.5 mmol·μL-1) 2 μL, 引物(10 pmol·μL-1)各1 μL, 補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30s, 48 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min, 將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)后用于限制性核酸內(nèi)切酶酶切。

1.3.2 PCR-RFLP分析

將擴(kuò)增檢測(cè)合格的16S rRNA產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶I、II和III同時(shí)酶切: 取各菌株的16S rRNA產(chǎn)物8 μL各加入10 U的3種內(nèi)切酶, 用緩沖液補(bǔ)充體積到20 μL, 37 °C酶切過(guò)夜, 酶切產(chǎn)物用5%瓊脂糖電泳(80 V, 3 h)檢測(cè), 用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照保存, 應(yīng)用NTsys軟件分析RFLP酶切電泳譜型并歸類, 選取不同RFLP酶切電泳譜型代表菌株的16S rRNA基因序列由擎科生物成都公司測(cè)序, 所得序列去除無(wú)效序列后在NCBI上利用Blastn程序搜索GenBank核酸蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)序列, 確定各類群的種屬特性, 選取參比菌株用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 提交各菌株序列到Genbank獲取登錄號(hào)。

1.4 降解碳水化合物活性分析

各菌株對(duì)塊菌生境不同碳水化合物的降解通過(guò)測(cè)定各菌株裂解真菌細(xì)胞壁的組分(幾丁質(zhì)和1, 3--葡聚糖)或者植物來(lái)源的土壤材料(纖維素, 果膠)來(lái)確定。分別接種各菌株到幾丁質(zhì)酶、1,3--葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶等發(fā)酵培養(yǎng)基中, 于28 ℃、180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)5 d, 發(fā)酵液用于各酶活性測(cè)定。

幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定通過(guò)使用Chernin等[22]描述的方法進(jìn)行; 1,3--葡聚糖酶活性測(cè)定通過(guò)Mahasneh等[23]描述的方法進(jìn)行; 纖維素酶活性測(cè)定通過(guò)Hendrick等[24]描述的方法進(jìn)行; 果膠分解酶活性測(cè)定通過(guò)Hankin等[25]描述的方法進(jìn)行。

1.5 產(chǎn)促生劑能力檢測(cè)

產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)試驗(yàn)采用Ruanpanun等[26]的方法進(jìn)行; ACC脫氨酶活力測(cè)定參考Seleh等[27]的方法進(jìn)行; 鐵載體的生產(chǎn)使用缺鐵礦物鹽培養(yǎng)基(MM9), 產(chǎn)量測(cè)定參照Sadeghi等[28]的方法進(jìn)行。

1.6 抗真菌活性分析

目標(biāo)菌采用4株主要浸染植物致病的真菌, 分別為: 黃瓜尖孢鐮刀菌(sp), 立枯絲核菌(Kühn), 禾谷鐮刀菌()和大豆核盤菌()。參照Bredholdt等[29]的方法進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010統(tǒng)計(jì), 用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離和多樣性

采用放線菌分離培養(yǎng)基, 從四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤中分離到125株放線菌, 經(jīng)純化后再平板培養(yǎng)獲得各菌株單菌落, 對(duì)各菌株菌落形態(tài)和顯微涂片觀察, 根據(jù)各菌株菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)初篩去重復(fù)得到57株放線菌, 對(duì)這些菌株編號(hào)為W1-W57(見(jiàn)表1)。

表1 57株塊菌菌根土壤放線菌16S rRNA基因的RFLP 分型及親緣關(guān)系

圖1 塊菌菌根根際土壤放線菌菌株16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

Figure 1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of actinomycetes strains from mycorrhizal soil

用限制性內(nèi)切酶I、II和III對(duì)上述57株菌的16S rRNA 基因進(jìn)行三酶切后電泳獲得酶切圖譜, 應(yīng)用NTsys軟件分析將57株放線菌歸為23類譜型(見(jiàn)表1)。由于每類譜型的菌株形態(tài)特征和分子水平相近, 因而從每個(gè)譜型的菌株中隨機(jī)選取1株代表進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果同NCBI中的核酸序列比對(duì)并進(jìn)行序列相似度分析, 23株放線菌同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性最高的菌株的相似性在98—100%, 其中相似度低于99%的有3株菌, 相似度在99—100%的有13株, 7株菌的相似度為100%, 但沒(méi)有相似度低于97%的菌株獲得(見(jiàn)表1)。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示這些菌株能夠被完全區(qū)分開(kāi), 表明這些菌株間存在不同的遺傳多樣性, 也表明了一個(gè)相對(duì)較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系(見(jiàn)圖1)。23類菌株產(chǎn)生了三個(gè)不同的分類單元, 分布于鏈霉菌屬()、北里孢菌屬()以及厄氏菌屬)共3個(gè)屬, 其中歸于鏈霉菌屬的放線菌21株(91.3%), 另外兩個(gè)屬各僅有1株菌, 基于進(jìn)化樹(shù)分析, 23株放線菌被鑒定得到, 并獲取登錄號(hào)(見(jiàn)表1)。

2.2 碳水化合物降解活性

通過(guò)分別測(cè)定23個(gè)代表菌株發(fā)酵液中酶產(chǎn)量, 獲得各菌株對(duì)幾丁質(zhì)、1,3--葡聚糖、纖維素和果膠降解活性見(jiàn)表2。結(jié)果表明, 有18株(78.3%)具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性, 其產(chǎn)量范圍為5.5—30.0 U·mL-1, 產(chǎn)量最高的為W3菌株, 最低為W49菌株; 所有23個(gè)放線菌(100%)都表現(xiàn)出對(duì)1,3--葡聚糖的降解活性, 其降解程度明顯不同, 水平范圍從最低的2.92 U·mL-1到最高的35.26 U·mL-1, 降解能力最強(qiáng)的菌株是W34; 有8株菌(34.8%)不具備分解纖維素的能力, 分別為菌株W1、W2、W11、W15、W17、W19、W47和W50, 而其余15株菌(65.2%)具備纖維素降解能力, 菌株W54的降解能力最強(qiáng)為11.43 U·mL-1; 有18株菌(78.3%)具備分解果膠的能力, 有5株菌(21.7%)不能降解果膠, 分別是菌株W01、W02、W20、W30和W41, 果膠酶產(chǎn)量范圍為101.44— 4270.0 U·mL-1, 其中菌株W54的果膠酶活性最高為4270.0 U·mL-1, 菌株W19的果膠酶活性最低為101.44 U·mL-1?？傮w上, 23株可培養(yǎng)放線菌都表現(xiàn)出了不同程度的碳水化合物降解活性, 其中有13株菌(56.5%)同時(shí)具備降解幾丁質(zhì)、1,3--葡聚糖、纖維素和果膠的能力, 有6株菌(26.1%)同時(shí)具備降解3類碳水化合物的能力。因此, 塊菌菌根根際土壤中的放線菌表現(xiàn)出極大的碳水化合物利用活性。

表2 23株塊菌菌根土壤放線菌碳水化合物降解活性

注:a表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差; 同列不同字母表示顯著差異(LSD,< 0.05), 陰性未檢出: -。

2.3 產(chǎn)促生劑活性

各菌株產(chǎn)鐵載體活性、IAA、ACC脫氨酶的生產(chǎn)和溶磷能力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明, 在23個(gè)待測(cè)菌株中, 19個(gè)菌株(82.6%)能夠產(chǎn)鐵載體活性, 其產(chǎn)量范圍為0.86—257.79 μg·mL-1, 菌株W31產(chǎn)量最高; 22個(gè)菌株(95.6%)表現(xiàn)出溶解磷酸鹽的能力, 其范圍為0.26—15.90 μg·mL-1, 菌株W36溶解磷酸鹽能力最強(qiáng); 有W31、W34和W50共3個(gè)菌株(13.0%)被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生IAA, 其生產(chǎn)范圍為7.6— 78.1 μg·mL-1, 菌株W31產(chǎn)量最高為97.6 μg·mL-1; ACC脫氨酶的生產(chǎn)僅僅在菌株W31和 W50中被觀察到, 其產(chǎn)量分別為57.6 μg·mL-1和45.8 μg·mL-1?？傮w而言, 本研究中所有23個(gè)菌株都表現(xiàn)出產(chǎn)促生劑的能力, 其中5個(gè)菌株(21.7%)能同時(shí)產(chǎn)3種不同的促生劑, 13個(gè)菌株(56.5%)具備產(chǎn)2種不同促生劑的能力, 4個(gè)菌株(17.4%)可產(chǎn)1種不同的促生劑, 但沒(méi)有菌株同時(shí)具備產(chǎn)4種促生劑的能力。

表3 23株塊菌菌根土壤放線菌產(chǎn)鐵載體活性、IAA和ACC脫氨酶

注:a表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差; 同列不同字母表示顯著差異(LSD,< 0.05), 陰性未檢出: -.

2.4 抗真菌活性

對(duì)23株塊菌菌根根際土壤放線菌進(jìn)行了抗真菌活性的初步檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)獲得的這些放線菌菌株表現(xiàn)出不同程度的對(duì)真菌拮抗能力, 結(jié)果見(jiàn)圖2和表4。

由圖2和表4可知, 其中包括W1、W2、W19、W20、W22和W49共計(jì)6株菌(26%)對(duì)具有抑制能力, 其抑菌效果明顯不同, 其中W19產(chǎn)生的抑菌圈直徑為14.1 mm為最大, 其次是菌株W2, 抑菌圈直徑為8.3 mm; 同樣有W1、W2、W17、W18、W19和W49共計(jì)6株菌(26%)對(duì)Kühn具有抑制能力, 其中W12產(chǎn)生的抑菌圈直徑為23.3 mm最大, 其次是菌株W19, 抑菌圈直徑為16.4 mm; 對(duì)具有抑制作用的也是6株菌(26%), 分別是W2、W17、W19、W22、W42和W55, 其中W19產(chǎn)生的抑菌圈直徑為27.7 mm為最大, 其次是菌株W2, 抑菌圈直徑為8.5 mm; 另外, 有3株菌(13%)對(duì)f. sp.具有抑制作用, 分別是W2、W19和W49, 但這3株菌對(duì)f. sp.的抑制能力較弱, W2產(chǎn)生的抑菌圈直徑1.1 mm為最大, 其次是W19為0.7 mm。但發(fā)現(xiàn)有2株放線菌(W2和W19)能夠同時(shí)對(duì)這4種植物真菌病原菌產(chǎn)生抑制作用, 有1株放線菌(W49)能夠抑制3種植物真菌病原菌, 有3株放線菌(W1、W17和W22)能夠抑制2種植物真菌病原菌, 有4株放線菌(W18、W20、W42和W55)能夠抑制1種植物病原真菌。其中, 以菌株W2和W19抑菌作用全面而且抑制作用相對(duì)最強(qiáng), 是本試驗(yàn)篩出的促生和生防功能理想菌株。

3 討論

過(guò)去20多年里, 在可控條件下的塊菌菌根苗合成技術(shù)及應(yīng)用研究已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)步, 但人工培育塊菌的漫長(zhǎng)生長(zhǎng)周期和極低的產(chǎn)出一直是困擾塊菌產(chǎn)業(yè)的難題?，F(xiàn)有研究表明塊菌菌根根際細(xì)菌能夠促進(jìn)菌根苗的合成、塊菌菌絲生長(zhǎng)和子囊果的產(chǎn)生, 同時(shí)還具有對(duì)塊菌根際植物病原菌的生防作用[2], 而具有高度適應(yīng)性并生長(zhǎng)于菌根根際的放線菌能產(chǎn)生抗生素、多種酶和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[30-31], 因此開(kāi)展塊菌自然生境菌根根際放線菌的促生和生防功能研究是實(shí)現(xiàn)塊菌人工栽培和增產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)[32]。

圖2 23株塊菌菌根土壤放線菌在4種真菌固體培養(yǎng)平板上產(chǎn)生的抑菌圈

Figure 2 Halo of 23 actinomycetes from the truffle mycorrhizal soil on 4 fungal solid media plate. A:B:Kühn, C:D:f. sp.

表4 23株塊菌菌根土壤放線菌在4種真菌固體平板上抑菌圈直徑

注:a表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差; 同列不同字母表示顯著差異(LSD,< 0.05), 陰性未檢出: -.

在這一研究中, 采用四種不同放線菌分離培養(yǎng)基從四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤中共分離到125株放線菌, 基于形態(tài)結(jié)構(gòu)和16S rRNA基因序列的進(jìn)化樹(shù)分析, 這些菌株歸屬于23個(gè)不同的物種, 分布于鏈霉菌屬()、北里孢菌屬()以及厄氏菌屬)三個(gè)屬, 該結(jié)果明顯多于Pavic等報(bào)道的從黑孢塊菌生境中分離到2株放線菌[16]以及Goudjal等報(bào)道的從沙漠塊菌生境中分離到鏈霉菌屬的7株放線菌[17], 但明顯比來(lái)源于其它類型土壤放線菌分離結(jié)果少[33], 這表明塊菌菌根根際土壤中放線菌物種多樣性同塊菌生境及形成的菌根共生體的存在密切相關(guān)。另外, 我們分離到的北里孢菌屬以及厄氏菌屬作為塊菌根際土壤放線菌, 在以前的研究中未見(jiàn)報(bào)道[34-35], 這進(jìn)一步表明塊菌菌根根際土壤放線菌的特異性。

迄今為止, 雖然有大量關(guān)于塊菌菌根根際土壤細(xì)菌及其功能的研究, 但是針對(duì)特定生境塊菌菌根根際放線菌功能的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道[4, 36]。本研究通過(guò)對(duì)所分離獲得的放線菌菌株及其功能進(jìn)行系統(tǒng)分析, 分別獲得了具有能分解纖維素和果膠, 產(chǎn)鐵載體活性、IAA和ACC脫氨酶的菌株; 并獲得同時(shí)降解不同多糖類物質(zhì), 產(chǎn)多種植物根際促生劑和拮抗真菌的多功能高活性菌株, 這些數(shù)據(jù)表明放線菌可能是攀枝花地區(qū)印度塊菌生長(zhǎng)的一類重要菌根根際促生菌, 這是在已經(jīng)報(bào)道的塊菌根際促生菌的基礎(chǔ)上的一個(gè)很好補(bǔ)充[4, 10, 16-17]。

雖然土壤和氣候條件對(duì)塊菌生長(zhǎng)的重要性已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同[37-39], 但是塊菌栽培的不完全成功揭示了塊菌根際促生菌在這一過(guò)程中的重要性[40]。毫無(wú)疑問(wèn), 進(jìn)行塊菌促生菌株有關(guān)營(yíng)養(yǎng)交換和吸收的功能研究將為真菌-細(xì)菌-宿主植物間的相互作用提供一個(gè)直接的證據(jù)[41-42]。但是, 不同生境塊菌菌根根際土壤細(xì)菌群落和功能及同塊菌生長(zhǎng)相關(guān)性的研究仍需要我們?nèi)ヌ剿鳌４送? 如何將塊菌菌根土壤中的促生菌有效構(gòu)建到塊菌人工培育體系中以真正實(shí)現(xiàn)模擬自然生境的塊菌人工栽培仍是下一步研究的重要工作。

4 結(jié)論

本研究從四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根土壤中共分離到125株放線菌, 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察去重復(fù)得到57株(W1—W57), 經(jīng)多樣性分析將其歸于3個(gè)屬的23個(gè)種, 其中以鏈霉菌屬最多(91.3%), 功能分析表明: 有23株、17株、15株和18株放線菌能分別降解1,3--葡聚糖、幾丁質(zhì)、纖維素和果膠, 其中有47.8%、26.1%和26.1%的菌株能同時(shí)降解4、3和2類碳水化合物; 分別有19株、3株和2株放線菌分別能產(chǎn)鐵載體、IAA和ACC脫氨酶, 其中有21.7%、56.6%和21.7%的菌株能分別產(chǎn)生3、2和1種根際促生劑; 有10株菌表現(xiàn)出對(duì)不止一種病源真菌的拮抗能力, 其中菌株W2和W19對(duì)4種病源真菌同時(shí)具有拮抗活性, 且這2株菌對(duì)4種病源真菌抑菌能力比其它菌強(qiáng); 同時(shí)獲得了包括W2、W3、W17、W19、W20、W34、W36和W54等在內(nèi)的多功能高活性菌株。該研究表明四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根土壤含豐富的放線菌, 且這些放線菌均表現(xiàn)出一種或多種功能活性, 所獲結(jié)果可為我國(guó)印度塊菌人工種植新技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新思路。

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Functional diversity of culturable actinomycetes isolated frommycorrhizal soils in Panzhihua, Sichuan

WANG Tiantian, MENG Xiaojin, MA Qinqin, YONG Bin, MIAO Yuzhi*

College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China

In this study, we isolated actinomyces frommycorrhizal soils in Panzhihua, Sichuan by four types of medium, and all isolates were identified by PCR-RFLP based on 16S rRNA gene in combination with morphological observation. The abilities of each strain to degrade carbohydrates and produce growth promoters were obtained by measuring the enzyme activity or metabolites in shaking flask fermentation broth of each isolate. Then, dual-culture inhibition was adopted for screening strains antifungal activity. A total of 125 actinomyces were isolated, of which 57 strains (W1-W57) were selected after morphological character observation and assigned to 3 genera. Actinomyces could be divided into 23 species, and among all isolates the Streptomyces were the most (91.3%). Result of functional analysis was as follows: 23, 17, 15, and 18 strains of all isolates degraded 1,3--glucan, chitin and cellulose and pectin, respectively, of which 47.8%, 26.1% and 26.1% were able to degrade simultaneously 4, 3 and 2 carbohydrates, respectively. 19 isolates produced the siderophore, 3 isolates secreted indoleacetic acid, and 2 strains produced ACC deaminase, of which 21.7%, 56.6% and 21.7% respectively had simultaneously the above bioactivities of 3, 2 and 1, respectively. 10 isolates had more than one ability to resist pathogenic fungi; W2 and W19 showed better inhibitory ability to four pathogenic fungi than other isolates. At the same time, the multifunctional functions and high bioactive strains including W2, W3, W17, W19, W20, W34, W36 and W54 were obtained. This study shows that there are lots of multifunctional actinomycetes inmycorrhizal of Panzhihua, Sichuan, and the results can also provide new ideas for the development of new planting techniques in artificial cultivation of.

Tuber inducum; rhizospheric soil; culturable actinomycetes; functional diversity

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.05.017

CLCQ939.96

A

1008-8873(2019)05-127-11

2018-07-10;

2018-10-08

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2017JY0147); 四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(15ZA0036)

王田田(1992—), 女, 四川自貢人, 碩士研究生, 主要從事微生物多樣性研究, E-mail: 1120152047@qq.com

苗玉志, 男, 博士, 副教授, 主要從資源微生物研究, E-mail: skymyz88@163.com

王田田, 孟小靖, 馬沁沁,等. 四川攀枝花地區(qū)印度塊菌菌根根際土壤內(nèi)可培養(yǎng)放線菌功能多樣性[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(5): 127-137.

WANG Tiantian, MENG Xiaojin, MA Qinqin, et al. Functional diversity of culturable actinomycetes isolated frommycorrhizal soils in Panzhihua, Sichuan[J]. Ecological Science, 2019, 38(5): 127-137.