朱彥明，金錦游，崔永一*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.岱山縣農(nóng)林水利圍墾局，浙江 舟山 316200)

鐵皮石斛(DendrobiumcandidumLindl.)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴瀕危中藥材，具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鐵皮石斛的種植和培育時(shí)，往往因缺少有益的內(nèi)生真菌參與，導(dǎo)致組培苗移栽成活率低，種苗生長(zhǎng)緩慢、品質(zhì)較差，這種狀況限制了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展[1]。

內(nèi)生真菌不同于菌根真菌只能定殖在植物的根部，其存在于植物組織的內(nèi)部，部分存在于根、莖、葉之中，在植物衰老組織中產(chǎn)生孢子[2]。內(nèi)生真菌與宿主通過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，與生存在宿主表面的表面菌相比，有本質(zhì)性的區(qū)別，具有更穩(wěn)定的生態(tài)功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠與植物建立互惠共生的關(guān)系,提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收,促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植物對(duì)蟲(chóng)害、病害的抗性和對(duì)非生物脅迫的耐受性[4]。

本試驗(yàn)采用3種內(nèi)生真菌與鐵皮石斛種苗共生培養(yǎng)的方法，探討內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛種苗生長(zhǎng)的作用，旨在構(gòu)建鐵皮石斛共生培養(yǎng)體系，尋求能夠有效促進(jìn)鐵皮石斛種苗生長(zhǎng)、品質(zhì)提升的新途徑，為鐵皮石斛仿生態(tài)栽培、生物肥(菌劑)的研究和應(yīng)用等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

已移栽馴化的一年生鐵皮石斛種苗，該種苗來(lái)自于杭州市臨安成蹊農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司所生產(chǎn)的天斛一號(hào)組培苗。將長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)健壯的鐵皮石斛種苗種植于直徑17.5 cm的花盆中。

1.2 處理設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共2個(gè)因子，分別為供試菌株(FC6、FC8、FC9)和接種體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%)。以無(wú)菌水澆灌為對(duì)照(CK)，處理1～3接種FC6濃度分別為20%、40%和60%，處理4～6接種FC8濃度分別為20%、40%和60%，處理7～9接種FC9濃度分別為20%、40%和60%。每處理20盆。由于鐵皮石斛具有較強(qiáng)的群體生長(zhǎng)效應(yīng)[5]，本試驗(yàn)將種苗以每叢為單位開(kāi)展研究和生物量測(cè)定。試驗(yàn)材料每盆3叢，共6～9株，重復(fù)3次。在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上(基肥：奧綠肥，每盆5～8顆，3～4個(gè)月施用1次。追肥：花寶二號(hào)，稀釋1 000倍，春、秋季每半月噴施1次)進(jìn)行菌液澆灌處理。其中，菌液共澆灌5次，間隔天數(shù)為15 d，每盆種苗每次澆灌菌液100 mL。共培養(yǎng)150 d后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)各處理鐵皮石斛種苗生物量，顯微觀察真菌侵染情況。另外從處理組和對(duì)照組種苗中隨機(jī)抽取10盆進(jìn)行重分離真菌，并鑒定。

1.3 金釵石斛內(nèi)生真菌分離純化

從金釵石斛較老的根部向上剪取4～6 cm的小段，洗潔精刷洗干凈，流水下沖洗1 h；在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇消毒1 min、0.1% HgCl2消毒6 min，最后再用無(wú)菌水沖洗3次[6]。無(wú)菌濾紙吸干根段表面水分后，先用剪刀把根段兩端剪掉約3 mm，然后再剪成約1 cm長(zhǎng)的小段，接于PDA(馬鈴薯、葡萄糖)固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行真菌的分離、純化。另將最后一次沖洗過(guò)的無(wú)菌水接入PDA固體培養(yǎng)基上作對(duì)照，若表面無(wú)雜菌產(chǎn)生，表明金釵石斛根部表面消毒徹底。

1.4 內(nèi)生真菌形態(tài)觀察鑒定

將1.3節(jié)分離的菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，然后放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，暗培養(yǎng)溫度設(shè)置為26 ℃。培養(yǎng)7～15 d后，通過(guò)菌落特征和顯微觀察初步鑒定篩選菌株。

1.5 內(nèi)生真菌分子鑒定

將發(fā)酵培養(yǎng)(PDA液體培養(yǎng)基)的菌絲球用無(wú)菌紗布過(guò)濾，再用無(wú)菌濾紙吸干后放入研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀，用CTAB法提取真菌基因組DNA，核酸分析儀檢測(cè)DNA純度和濃度。分別以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)為上、下游引物PCR擴(kuò)增其ITS區(qū)。PCR反應(yīng)體系為25 μL：Master mix(綠酶)12.5 μL，引物(稀釋為10 μmol·L-1)ITS1和ITS4各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，加滅菌ddH2O至25 μL，混合均勻后離心。PCR條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，25 ℃保溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

用核酸分析儀檢測(cè)擴(kuò)增后的DNA純度和濃度，取21 μL擴(kuò)增產(chǎn)物送Sangon公司進(jìn)行單向序列測(cè)通[7]。測(cè)序成功的核酸序列以AB1格式保存，運(yùn)用Chromas軟件進(jìn)行兩兩比對(duì)。以每個(gè)形態(tài)型菌株的ITS和5.8S基因?yàn)榘行蛄?，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序搜索同源序列，與已知真菌堿基序列相似度大于或等于97%的菌株被鑒定到種水平，以此為標(biāo)準(zhǔn)鑒定分離純化后的真菌科屬[8]。

1.6 液體菌劑配制

將PDA固體培養(yǎng)基中的菌株用直徑0.5 cm的打孔器在其菌落邊緣打取2個(gè)菌餅，接種到300 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1條件下恒溫暗培養(yǎng)約5 d，將懸浮在PDA液體培養(yǎng)基中的菌絲球打碎和發(fā)酵液一起與無(wú)菌水配制成不同濃度、均勻的液體菌劑[4]。

1.7 生物量測(cè)定

鐵皮石斛種苗與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)150 d后，從處理組和對(duì)照組中各選取10盆長(zhǎng)勢(shì)均勻、健壯的植株，以每叢為單位測(cè)定植株的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、分蘗數(shù)、株高、莖粗、莖節(jié)數(shù)、根長(zhǎng)、根條數(shù)和葉片數(shù)，并計(jì)算出各指標(biāo)平均值。在SPSS 22.0軟件中進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，采用Duncan法分析差異顯著性。

1.8 共生結(jié)構(gòu)觀察

分別從鐵皮石斛種苗處理組和對(duì)照組中隨機(jī)抽取10盆，每盆取2～3條約5 cm長(zhǎng)的根段，在流水下沖洗干凈，剪成約0.5 cm長(zhǎng)的小段。迅速放于FAA固定液中，酒精系列脫水、石蠟包埋、切片脫蠟、番紅固綠染色。切片厚度為8 μm，光學(xué)顯微鏡400倍下觀察真菌侵染情況并照相記錄。

重分離真菌鑒定方法同1.5節(jié)金釵石斛根部真菌分離的分子鑒定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌rDNA ITS序列分析

用CTAB法提取從金釵石斛根部分離所得的3種真菌的菌絲體DNA，PCR擴(kuò)增均得到單一的ITS片段。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，獲得3種真菌的rDNA ITS區(qū)段的序列，序列長(zhǎng)度均在610 bp左右，測(cè)序結(jié)果在NCBI中利用BLAST與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知真菌堿基序列進(jìn)行比對(duì)，序列相似度均達(dá)到97%以上(表1)。其中菌株FC6和毛殼菌屬ChaetomiumKunze真菌相似度最高；菌株FC8和蠟殼耳屬Sebacinasp.真菌相似度最高；菌株FC9和踝節(jié)菌屬Talaromycessp.真菌相似度最高。

表1 內(nèi)生真菌ITS序列BLAST比對(duì)結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛種苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，不同菌株、不同濃度處理組對(duì)鐵皮石斛種苗的鮮質(zhì)量有不同的影響。60%菌株FC6處理組鮮質(zhì)量最大，極顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.6倍。20%菌株FC6處理組顯著高于對(duì)照組。60%菌株FC6、20%菌株FC8處理組的干質(zhì)量極顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.76、1.63倍。菌株FC6和FC9處理組隨著接種濃度的提高，鐵皮石斛種苗的干質(zhì)量逐漸增加，而菌株FC8處理組相反。鐵皮石斛種苗經(jīng)菌液處理后分蘗數(shù)明顯增加，20%的FC6、FC8菌株處理組的分蘗數(shù)極顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的2.0、1.1倍。

表2 不同菌株和接種劑量對(duì)鐵皮石斛種苗生長(zhǎng)的影響

注：*與**分別表示與對(duì)照相比在0.05和0.01水平上差異顯著。

60%菌株FC6處理組的株高顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.26倍。菌株FC9對(duì)鐵皮石斛種苗的株高產(chǎn)生抑制作用。菌液處理對(duì)鐵皮石斛種苗的莖粗影響較小。在莖節(jié)數(shù)方面，40%菌株FC8處理組比對(duì)照組多出2.72節(jié)。20%菌株FC6處理組鐵皮石斛種苗的莖節(jié)數(shù)低于對(duì)照組，提高FC6接種濃度對(duì)莖節(jié)數(shù)的增加有明顯的促進(jìn)作用。

20%、40%菌株FC6和40%菌株FC8處理組的根長(zhǎng)均極顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.74、1.62和1.44倍。菌株FC9處理組的根長(zhǎng)小于對(duì)照組。20%菌株FC8處理組的根條數(shù)極顯著大于對(duì)照組，比對(duì)照組增加10.92條。鐵皮石斛種苗經(jīng)菌液處理后葉片的數(shù)量有明顯增加。20%、40%、60%菌株FC6，20%、40%菌株FC8和60%菌株FC9處理組均極顯著多于對(duì)照組。

2.3 鐵皮石斛種苗真菌侵染情況觀察

鐵皮石斛種苗根部顯微觀察表明，其結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為根被、皮層(外皮層、中皮層和內(nèi)皮層)和中柱。最外層為根被，由4～6層長(zhǎng)筒形、多角死細(xì)胞組成，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁增厚。中層為發(fā)達(dá)的皮層細(xì)胞，由10～12層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，分布有質(zhì)粒、淀粉顆粒等結(jié)構(gòu)；中心部分為中柱，是鐵皮石斛根的輸導(dǎo)組織，包括中柱鞘和維管束組織。維管束的數(shù)量不一，與其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性具有一定的正相關(guān)性，另外與植株種類(lèi)也有一定關(guān)系。針狀結(jié)晶結(jié)構(gòu)不均勻的分布于整個(gè)根部細(xì)胞中。

菌株FC6和FC8均能夠侵入鐵皮石斛種苗根部組織，其侵染方式是直接破壞鐵皮石斛種苗根被組織進(jìn)入皮層細(xì)胞，形成菌絲、菌絲結(jié)。菌株FC9侵染現(xiàn)象不明顯。菌液處理組鐵皮石斛根部外皮層細(xì)胞存在少量菌絲，此層細(xì)胞可以清晰地觀察到菌絲由根被細(xì)胞向外皮層細(xì)胞侵入的現(xiàn)象(圖1中A)。菌絲主要在皮層細(xì)胞內(nèi)形成大量著色較深、形狀不規(guī)則的菌絲結(jié)(圖1中B)，多數(shù)存在于細(xì)胞核附近，原因是其圍繞細(xì)胞核形成的。在種苗根部也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中柱外圍的內(nèi)皮層細(xì)胞中分布有大量淀粉顆粒(圖1中E)，皮層細(xì)胞中存在著針狀的結(jié)晶體，稱(chēng)為針狀結(jié)晶(圖1中F)，其排列不整齊、分布不均勻(表皮細(xì)胞中也有少量分布)，顏色較淺，容易識(shí)別。有研究表明針狀結(jié)晶的化學(xué)成分為植酸鈣鎂[9]。

A，菌絲聚集在表皮細(xì)胞表面100×，(bar=200 μm)；B，皮層細(xì)胞內(nèi)的菌絲結(jié)100×，(bar=200 μm)；C，菌絲團(tuán)1 000×，(bar=20 μm)；D，菌絲纏繞細(xì)胞核現(xiàn)象400×，(bar=50 μm)；E，分布于皮層細(xì)胞的淀粉顆粒200×，(bar=100 μm)；F，皮層細(xì)胞內(nèi)的針狀結(jié)晶200×，(bar=40.6 μm)。P，菌絲結(jié)；CN，細(xì)胞核；HB，菌絲團(tuán)；SG，淀粉顆粒；AC，針狀結(jié)晶。圖片均為鐵皮石斛根部的橫切面。圖1 真菌侵染鐵皮石斛種苗情況

2.4 重分離真菌及其rDNA ITS序列分析

對(duì)試驗(yàn)處理組和對(duì)照組鐵皮石斛種苗根部進(jìn)行重分離真菌，處理組均分離得到真菌，對(duì)照組未分離到真菌。其中，處理組真菌經(jīng)純化、形態(tài)觀察后初步篩選出與原接種真菌相似的菌株，再分別提取其菌絲體DNA，PCR擴(kuò)增均得到單一的ITS片段(圖2)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與原接種真菌序列進(jìn)行比對(duì)，序列相似度均達(dá)到99%以上，確定重分離得到了原接種真菌。

M，DL 2 000 Marker；6、8、9分別表示重分離篩選出的與原接種真菌FC6、FC8和FC9相似的菌株。圖2 3種重分離菌株rDNA ITS基因電泳圖譜

3 討論

菌株FC6對(duì)鐵皮石斛種苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、分蘗數(shù)、株高、根長(zhǎng)和根條數(shù)均有顯著促進(jìn)作用。菌株FC8的促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在鐵皮石斛種苗的分蘗數(shù)、根條數(shù)和莖節(jié)數(shù)3個(gè)方面。菌株FC9對(duì)鐵皮石斛種苗的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。本試驗(yàn)處理的菌株FC6和FC8分離自金釵石斛，但其對(duì)同為石斛屬的鐵皮石斛種苗生長(zhǎng)也有顯著的促進(jìn)作用。郭順星等[10]曾在金釵石斛中分離獲得1種能促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)的菌株，同時(shí)也從鐵皮石斛根中分離獲得3種能促進(jìn)金釵石斛幼苗生長(zhǎng)的菌株。另有研究發(fā)現(xiàn)，分離自野生美花石斛的菌根真菌對(duì)同屬的鐵皮石斛和重唇石斛也有較好的促生效果[11]。這種現(xiàn)象體現(xiàn)了一種植物對(duì)多個(gè)菌株、一個(gè)菌株對(duì)多種植物的潛在專(zhuān)一性，以及蘭科植物同屬之間真菌的相似性。

孟娉等[12]研究表明，內(nèi)生真菌混合接種均具有正效應(yīng)，但不是全部?jī)?yōu)于單一接菌?；旌辖臃N的效果與混合的方式和方法有關(guān)系，這可能是因?yàn)楣采婢g在接種勢(shì)、菌絲發(fā)展、菌根分泌物、根系生理變化和養(yǎng)分吸收等方面產(chǎn)生了抑制或排斥[13]。而本試驗(yàn)是采用單一菌株的接種方式處理鐵皮石斛種苗，與混合菌株接種方式的效果差異尚待進(jìn)一步探討。

石蠟切片法觀察鐵皮石斛種苗根部組織發(fā)現(xiàn)，菌株FC6和FC8均能夠在皮層細(xì)胞定殖，形成菌絲、菌絲結(jié)，表明這2種真菌可以與鐵皮石斛種苗形成典型的共生結(jié)構(gòu)和良好的共生關(guān)系，為鐵皮石斛的有益真菌。菌株FC9也可以侵入鐵皮石斛種苗根部根被細(xì)胞和少量皮層細(xì)胞，但侵染形成的菌絲、菌絲結(jié)現(xiàn)象不明顯，對(duì)鐵皮石斛種苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，表明其不能和鐵皮石斛種苗形成共生結(jié)構(gòu)。這可能是相對(duì)于另外2種菌株而言，菌株FC9侵染力較弱，無(wú)法在有限的時(shí)間內(nèi)與鐵皮石斛種苗形成共生關(guān)系[14]。

真菌菌絲多集中分布在鐵皮石斛種苗根部中皮層細(xì)胞，而在靠近中柱的內(nèi)皮層細(xì)胞和中柱內(nèi)分布較少。在鐵皮石斛種苗根部皮層細(xì)胞中，真菌多以1條或多條菌絲卷曲，呈現(xiàn)出典型的菌絲圈結(jié)構(gòu)，或變?yōu)榱闼榈木z段[15]。一方面真菌利用發(fā)達(dá)的菌絲幫助寄主植株吸收生長(zhǎng)發(fā)育所需的碳源、氮源、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[16]、水分等物質(zhì)，直接促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育；另一方面，消解的菌絲為蘭科植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌絲被消解后的復(fù)合物中有的成分扮演著誘導(dǎo)子的角色，而后者更為重要[17]。本試驗(yàn)中菌株FC6和FC8在提高其菌液的接種劑量時(shí)，鐵皮石斛種苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和莖粗等均有增加，這可能與真菌利用其發(fā)達(dá)的菌絲和消解的菌絲為鐵皮石斛種苗直接或間接提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。