潘根，張義，趙立寧，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟，常麗，張翠萍，鄧勇，李德芳

（中國農業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙410205）

亞麻（Linum usitatissimumL.）是一種重要的經濟作物，廣泛種植于中國西北和東北地區(qū)。亞麻莖制取的纖維是紡織工業(yè)的重要原料，亞麻種子含油量30%～45%，亞麻油富含亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，被廣泛用于榨油及保健等行業(yè)［1]。目前而言，亞麻育種以品種間雜交選育為主，對雜交親本親緣關系正確評價是亞麻品種選育的關鍵。簡單重復序列SSR（Simple Sequence Repeat），也稱微衛(wèi)星，是由1～6個核苷酸組成的基本序列串聯重復構成的DNA片段，具有簡便、快捷、穩(wěn)定性好以及等位基因多樣等特點［2]。目前，SSR分子標記已成功應用于亞麻的遺傳多樣性以及亞麻連鎖圖譜的構建等多方面［3-5]。Cloutier等［6]利用EST-SSR引物對23份亞麻種質資源進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現亞麻品種間遺傳背景狹窄；Wu等［7]利用基因組重測序所獲得的62對基因組SSR引物較好地將48份亞麻品種分為纖用和油用兩大類群。DNA指紋圖譜是指某一品種所具有的區(qū)別于其他品種的特異性DNA片段，其以DNA標記為基礎，具有多位點性、高變異性和簡單而穩(wěn)定的遺傳性等優(yōu)點［8]。前人關于亞麻指紋圖譜構建已有相關報道，郝冬梅等［9]利用32對RAPD引物構建了26份亞麻材料的指紋圖譜；李秋芝等［10]同樣利用8對RAPD核心引物構建了100份亞麻材料的指紋圖譜，但其所用標記主要集中于RAPD，未見利用SSR標記構建中國現育成的亞麻品種指紋圖譜的研究報道。本研究擬采用SSR分子標記技術，通過96對SSR引物對24份亞麻品種進行遺傳多樣性分析，構建DNA指紋圖譜，確定亞麻品種遺傳基礎和遺傳多樣性的狀況，旨在為亞麻遺傳育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

24份亞麻品種為中國近期育成，種植于中國農業(yè)科學院麻類研究所長沙試驗基地，該批材料來自中國農業(yè)科學院麻類研究所麻類種質資源庫（見表1）。

表1 亞麻品種名稱、編號及系譜信息Table 1 Flax varieties name，number and pedigree information

續(xù)表1

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

取亞麻新鮮葉，參照張友昌等［11]的方法提取亞麻DNA。

1.2.2 PCR擴增

NCBI下載亞麻全基因組序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2），利用 MISA軟件 （MIcroSAtellite identification tool）（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）檢測亞麻基因組序列中的微衛(wèi)星和復合微衛(wèi)星位點。根據MISA的SSR檢測結果，利用Primer 5.0軟件默認參數（長度100～300 bp，Tm值55～60℃，引物長度20～25 bp）進行引物設計，在設計結果中挑選打分最高的3對引物用于后續(xù)試驗，共得到71184對SSR引物。隨機從中挑選96對SSR標記對24份亞麻品種進行DNA指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析，引物由湖南擎科生物公司合成。PCR反應體系為10μL，包含7μL的2×Taq PCR MasterMix，前后引物共1.5μL，基因組DNA 1.5μL。PCR擴增程序如下:94℃預變性3min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)30次；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.3 電泳產物檢測

PCR結束后在擴增產物中加入適量的Loading Buffer，進行40%聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為1.5μL 1×TBE，180 V，電泳1～1.5 h（根據片段大小適當延長或縮短電泳時間）。電泳結束后將膠塊銀染顯色，拍照，對清晰的條帶進行讀帶。

1.3 數據處理與分析

根據PCR擴增結果，將同一引物擴增出的大小相同的目的條帶視為1個等位變異，并進行記錄。用同一引物對24份材料進行擴增檢測時，相同的帶型用同一數字賦值，無帶賦值為“0”。采用NTSYS-pc 2.10e軟件計算品種間遺傳相似系數，并采用非加權平均法（UPGMA）計算品種遺傳相似系數。

2 結果與分析

2.1 SSR標記在24個亞麻品種之間多態(tài)性分析

96對引物在24個亞麻品種中共檢測出128個等位變異，每對引物檢測出1～5個等位變異，平均每對引物檢測出1.33個等位變異。其中，24對SSR引物在24個亞麻品種中具有多態(tài)性，有7對引物（RM5-1、RM6-2、RM10-6、RM13-5、RM8-1、RM13-2，RM9-4）可以將某一品種與其他品種（系）區(qū)分開，如引物RM5-1在“內亞9號”檢測到的等位變異與其他品種不同，因此可以將“內亞9號”與其他品種區(qū)分開；同理，RM6-2可以將“壩亞4號”與其他材料區(qū)分開；RM10-6可以將“壩選3號”與其他品種區(qū)分開；RM13-5可將“張亞2號”與其他品種區(qū)分開；RM8-1可將“晉亞8號”、“隴亞雜3號”與其他品種區(qū)分開。此外，利用同一個引物還可以將2～3個品種從24個品種中區(qū)分開，如引物RM7-1可以將“隴亞7號”、“壩亞12號”與其他品種區(qū)分開；引物RM7-3可以將“隴亞7號”、“晉亞8號”和 “壩亞7號”與其他品種區(qū)分開；引物RM13-4可以將“晉亞8號”、“隴亞14號”和“黑亞16號”與其他品種區(qū)分開。其他引物在單獨使用時不能篩選出24個亞麻品種中的一個或幾個材料，但通過這24對引物可以將每個品種從24個品種中鑒定出。

圖1 標記RM9-4在亞麻品種中的擴增結果Fig.1 Amplification results of flax varieties using SSR primer“RM9-4”

2.2 24份亞麻品種材料DNA指紋數據庫的初步構建

因只有24對引物在品種間存在差異，故利用這24對引物對24個品種進行了DNA指紋圖譜的構建，對每一對引物所擴增的條帶進行統計，得到了每個品種的DNA指紋圖譜數據庫（表2）。24對引物共鑒定出56個等位變異，所檢測的等位變異數目見表3。

表2 24對SSR引物構建的24個亞麻品種（系）的SSR指紋圖譜Table 2 Construction of the SSR fingerprint bands of 24 flax varieties using 24 pairs of SSR primer

表3 品種間具有多態(tài)性的24對SSR引物Table 3 The information of 24 SSR primers

續(xù)表3

2.3 24份亞麻品種遺傳多樣性分析

利用聚類分析軟件NTSYS對24對引物所檢測到的56個變異位點進行聚類分析，結果如圖2所示，供試材料的遺傳相似系數在0.25～0.87之間，平均值為0.56。24個品種被分為三大類:第一大類包括“內亞9號”、“隴亞8號”、“壩亞13號”等10個品種；第二大類包括“張亞2號”、“隴亞12號”、“隴亞14號”等13個品種；第三大類只包括“壩選三號”1個品種。該聚類分析結果能在一定程度上反映這些品種間的親緣關系，“定亞21號”的母本為“隴亞7號”，所以“定亞21號”和“隴亞7號”被聚類到同一小類群；“晉亞8號”和“壩亞7號”均以“紅木-65”為其中一個親本選育而來，因此聚為同一小類群。但同時也存在親緣關系近，SSR聚類不一致的現象，如“張亞2號”、“隴亞12號”、“隴亞14號”為油用亞麻品種，但同“黑亞15號”、“黑亞16號”、“黑亞23號”及“中亞麻5號”等纖用亞麻品種聚為同一小類群。

圖2 24份亞麻品種的SSR聚類分析（非加權平均法）Fig.2 SSR cluster analysis of 24 flax varieties（UPGMA）

3 討論與結論

目前，品種間雜交仍是亞麻品種選育的主要途徑，但由于長期的品種間雜交選育，亞麻品種間遺傳變異小，遺傳基礎狹窄，一定程度上阻礙了亞麻遺傳改良的進程。亞麻品種間遺傳差異的研究對于亞麻遺傳改良具有重要的意義。微衛(wèi)星標記（SSR）具有擴增穩(wěn)定、分布廣泛、多態(tài)性高、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛地用于作物遺傳多樣性研究［12-13]。本研究利用96對SSR引物對中國不同地域選育的24份亞麻品種進行遺傳多樣性分析，其SSR標記在24個品種中多態(tài)性為25%，低于Soto-Cerda等（68.18%）［5]、Deng等（39.8%）［14]的研究結果，其可能原因為本研究所選品種均為我國北方近代選育品種。

利用分子標記對亞麻種質資源進行遺傳多樣性研究已有相關報道。利用275對EST-SSR引物，Cloutier等［6]分析了23份亞麻種質資源的遺傳多樣性，研究顯示亞麻品種間遺傳背景狹窄；Wu等［7]利用62對基因組SSR引物較好地將48份亞麻品種分為纖用和油用兩大類群；黃文功等［15]利用10對ISSR引物對來自7個國家48份亞麻資源進行了遺傳多樣性分析，地理位置相近的品種基本被聚為一類。與Wu等研究結果相近，基于亞麻最新的基因組序列信息［16]，本研究利用24對SSR引物對24份亞麻品種進行聚類分析，其纖用品種也較好地聚為一個小類群，以“內亞9號”和“隴亞8號”為代表的油用品種也被聚類到一個類群，這些研究表明，SSR標記能有效地用于品種間遺傳多樣性分析。同時本研究也發(fā)現，“張亞2號”、“隴亞12”、“隴亞14號”為油用亞麻品種，但和“黑亞15號”、“黑亞16號”、“黑亞23號”及“中亞麻5號”等纖用亞麻品種聚為同一小類群。出現這一現象一方面可能因為本研究所用SSR標記數目偏少，未能平均分布于亞麻染色體上；另一方面可能與當前亞麻資源頻繁的異地引種有關。