潘根，張義，趙立寧，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟，常麗，張翠萍，鄧勇，李德芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙410205）

亞麻（Linum usitatissimumL.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于中國西北和東北地區(qū)。亞麻莖制取的纖維是紡織工業(yè)的重要原料，亞麻種子含油量30%～45%，亞麻油富含亞麻酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，被廣泛用于榨油及保健等行業(yè)［1]。目前而言，亞麻育種以品種間雜交選育為主，對雜交親本親緣關(guān)系正確評價是亞麻品種選育的關(guān)鍵。簡單重復(fù)序列SSR（Simple Sequence Repeat），也稱微衛(wèi)星，是由1～6個核苷酸組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的DNA片段，具有簡便、快捷、穩(wěn)定性好以及等位基因多樣等特點［2]。目前，SSR分子標(biāo)記已成功應(yīng)用于亞麻的遺傳多樣性以及亞麻連鎖圖譜的構(gòu)建等多方面［3-5]。Cloutier等［6]利用EST-SSR引物對23份亞麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞麻品種間遺傳背景狹窄；Wu等［7]利用基因組重測序所獲得的62對基因組SSR引物較好地將48份亞麻品種分為纖用和油用兩大類群。DNA指紋圖譜是指某一品種所具有的區(qū)別于其他品種的特異性DNA片段，其以DNA標(biāo)記為基礎(chǔ)，具有多位點性、高變異性和簡單而穩(wěn)定的遺傳性等優(yōu)點［8]。前人關(guān)于亞麻指紋圖譜構(gòu)建已有相關(guān)報道，郝冬梅等［9]利用32對RAPD引物構(gòu)建了26份亞麻材料的指紋圖譜；李秋芝等［10]同樣利用8對RAPD核心引物構(gòu)建了100份亞麻材料的指紋圖譜，但其所用標(biāo)記主要集中于RAPD，未見利用SSR標(biāo)記構(gòu)建中國現(xiàn)育成的亞麻品種指紋圖譜的研究報道。本研究擬采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過96對SSR引物對24份亞麻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建DNA指紋圖譜，確定亞麻品種遺傳基礎(chǔ)和遺傳多樣性的狀況，旨在為亞麻遺傳育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

24份亞麻品種為中國近期育成，種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所長沙試驗基地，該批材料來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所麻類種質(zhì)資源庫（見表1）。

表1 亞麻品種名稱、編號及系譜信息Table 1 Flax varieties name，number and pedigree information

續(xù)表1

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

取亞麻新鮮葉，參照張友昌等［11]的方法提取亞麻DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

NCBI下載亞麻全基因組序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2），利用 MISA軟件 （MIcroSAtellite identification tool）（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）檢測亞麻基因組序列中的微衛(wèi)星和復(fù)合微衛(wèi)星位點。根據(jù)MISA的SSR檢測結(jié)果，利用Primer 5.0軟件默認(rèn)參數(shù)（長度100～300 bp，Tm值55～60℃，引物長度20～25 bp）進(jìn)行引物設(shè)計，在設(shè)計結(jié)果中挑選打分最高的3對引物用于后續(xù)試驗，共得到71184對SSR引物。隨機(jī)從中挑選96對SSR標(biāo)記對24份亞麻品種進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析，引物由湖南擎科生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為10μL，包含7μL的2×Taq PCR MasterMix，前后引物共1.5μL，基因組DNA 1.5μL。PCR擴(kuò)增程序如下:94℃預(yù)變性3min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)30次；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.3 電泳產(chǎn)物檢測

PCR結(jié)束后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的Loading Buffer，進(jìn)行40%聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為1.5μL 1×TBE，180 V，電泳1～1.5 h（根據(jù)片段大小適當(dāng)延長或縮短電泳時間）。電泳結(jié)束后將膠塊銀染顯色，拍照，對清晰的條帶進(jìn)行讀帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，將同一引物擴(kuò)增出的大小相同的目的條帶視為1個等位變異，并進(jìn)行記錄。用同一引物對24份材料進(jìn)行擴(kuò)增檢測時，相同的帶型用同一數(shù)字賦值，無帶賦值為“0”。采用NTSYS-pc 2.10e軟件計算品種間遺傳相似系數(shù)，并采用非加權(quán)平均法（UPGMA）計算品種遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記在24個亞麻品種之間多態(tài)性分析

96對引物在24個亞麻品種中共檢測出128個等位變異，每對引物檢測出1～5個等位變異，平均每對引物檢測出1.33個等位變異。其中，24對SSR引物在24個亞麻品種中具有多態(tài)性，有7對引物（RM5-1、RM6-2、RM10-6、RM13-5、RM8-1、RM13-2，RM9-4）可以將某一品種與其他品種（系）區(qū)分開，如引物RM5-1在“內(nèi)亞9號”檢測到的等位變異與其他品種不同，因此可以將“內(nèi)亞9號”與其他品種區(qū)分開；同理，RM6-2可以將“壩亞4號”與其他材料區(qū)分開；RM10-6可以將“壩選3號”與其他品種區(qū)分開；RM13-5可將“張亞2號”與其他品種區(qū)分開；RM8-1可將“晉亞8號”、“隴亞雜3號”與其他品種區(qū)分開。此外，利用同一個引物還可以將2～3個品種從24個品種中區(qū)分開，如引物RM7-1可以將“隴亞7號”、“壩亞12號”與其他品種區(qū)分開；引物RM7-3可以將“隴亞7號”、“晉亞8號”和 “壩亞7號”與其他品種區(qū)分開；引物RM13-4可以將“晉亞8號”、“隴亞14號”和“黑亞16號”與其他品種區(qū)分開。其他引物在單獨使用時不能篩選出24個亞麻品種中的一個或幾個材料，但通過這24對引物可以將每個品種從24個品種中鑒定出。

圖1 標(biāo)記RM9-4在亞麻品種中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of flax varieties using SSR primer“RM9-4”

2.2 24份亞麻品種材料DNA指紋數(shù)據(jù)庫的初步構(gòu)建

因只有24對引物在品種間存在差異，故利用這24對引物對24個品種進(jìn)行了DNA指紋圖譜的構(gòu)建，對每一對引物所擴(kuò)增的條帶進(jìn)行統(tǒng)計，得到了每個品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫（表2）。24對引物共鑒定出56個等位變異，所檢測的等位變異數(shù)目見表3。

表2 24對SSR引物構(gòu)建的24個亞麻品種（系）的SSR指紋圖譜Table 2 Construction of the SSR fingerprint bands of 24 flax varieties using 24 pairs of SSR primer

表3 品種間具有多態(tài)性的24對SSR引物Table 3 The information of 24 SSR primers

續(xù)表3

2.3 24份亞麻品種遺傳多樣性分析

利用聚類分析軟件NTSYS對24對引物所檢測到的56個變異位點進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.25～0.87之間，平均值為0.56。24個品種被分為三大類:第一大類包括“內(nèi)亞9號”、“隴亞8號”、“壩亞13號”等10個品種；第二大類包括“張亞2號”、“隴亞12號”、“隴亞14號”等13個品種；第三大類只包括“壩選三號”1個品種。該聚類分析結(jié)果能在一定程度上反映這些品種間的親緣關(guān)系，“定亞21號”的母本為“隴亞7號”，所以“定亞21號”和“隴亞7號”被聚類到同一小類群；“晉亞8號”和“壩亞7號”均以“紅木-65”為其中一個親本選育而來，因此聚為同一小類群。但同時也存在親緣關(guān)系近，SSR聚類不一致的現(xiàn)象，如“張亞2號”、“隴亞12號”、“隴亞14號”為油用亞麻品種，但同“黑亞15號”、“黑亞16號”、“黑亞23號”及“中亞麻5號”等纖用亞麻品種聚為同一小類群。

圖2 24份亞麻品種的SSR聚類分析（非加權(quán)平均法）Fig.2 SSR cluster analysis of 24 flax varieties（UPGMA）

3 討論與結(jié)論

目前，品種間雜交仍是亞麻品種選育的主要途徑，但由于長期的品種間雜交選育，亞麻品種間遺傳變異小，遺傳基礎(chǔ)狹窄，一定程度上阻礙了亞麻遺傳改良的進(jìn)程。亞麻品種間遺傳差異的研究對于亞麻遺傳改良具有重要的意義。微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）具有擴(kuò)增穩(wěn)定、分布廣泛、多態(tài)性高、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛地用于作物遺傳多樣性研究［12-13]。本研究利用96對SSR引物對中國不同地域選育的24份亞麻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，其SSR標(biāo)記在24個品種中多態(tài)性為25%，低于Soto-Cerda等（68.18%）［5]、Deng等（39.8%）［14]的研究結(jié)果，其可能原因為本研究所選品種均為我國北方近代選育品種。

利用分子標(biāo)記對亞麻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究已有相關(guān)報道。利用275對EST-SSR引物，Cloutier等［6]分析了23份亞麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，研究顯示亞麻品種間遺傳背景狹窄；Wu等［7]利用62對基因組SSR引物較好地將48份亞麻品種分為纖用和油用兩大類群；黃文功等［15]利用10對ISSR引物對來自7個國家48份亞麻資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，地理位置相近的品種基本被聚為一類。與Wu等研究結(jié)果相近，基于亞麻最新的基因組序列信息［16]，本研究利用24對SSR引物對24份亞麻品種進(jìn)行聚類分析，其纖用品種也較好地聚為一個小類群，以“內(nèi)亞9號”和“隴亞8號”為代表的油用品種也被聚類到一個類群，這些研究表明，SSR標(biāo)記能有效地用于品種間遺傳多樣性分析。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，“張亞2號”、“隴亞12”、“隴亞14號”為油用亞麻品種，但和“黑亞15號”、“黑亞16號”、“黑亞23號”及“中亞麻5號”等纖用亞麻品種聚為同一小類群。出現(xiàn)這一現(xiàn)象一方面可能因為本研究所用SSR標(biāo)記數(shù)目偏少，未能平均分布于亞麻染色體上；另一方面可能與當(dāng)前亞麻資源頻繁的異地引種有關(guān)。