劉進(jìn)杰 呂娟娟 陳國(guó)忠

摘要：純化從煙臺(tái)海域沙質(zhì)土壤分離得到的莫海威芽孢桿菌菌株amyP216來(lái)源殼聚糖酶，并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。以發(fā)酵液為原料，依次進(jìn)行超聲波破碎菌體、20%～70%硫酸銨分級(jí)鹽析、纖維素DE-32陰離子交換層析、葡聚糖凝膠G-75過(guò)濾層析，得到殼聚糖酶。采用SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定分子量為30 ku，全波段掃描結(jié)果顯示在 324 nm 處出現(xiàn)最高峰。然后對(duì)殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最適反應(yīng)溫度為55 ℃，且在一定范圍內(nèi)溫度越低，其熱穩(wěn)定性越高;最適反應(yīng)pH值為5.5，中性條件下酶活性最穩(wěn)定;在金屬離子中Mn2+對(duì)其激活作用最明顯，其他金屬離子對(duì)其有抑制作用;該酶具有相對(duì)較好的底物特異性。

關(guān)鍵詞：殼聚糖酶;莫海威芽孢桿菌;分離純化;酶學(xué)性質(zhì);底物特異性

中圖分類號(hào)： S188+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0231-05

殼寡糖在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)都有著很高的應(yīng)用價(jià)值，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力和抗腫瘤的功效[1-4]，可有效抑制肝損傷[5-6]，還具有降血脂、降血糖的功能[6-9]。殼寡糖還可用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、延長(zhǎng)果蔬保鮮等[10-13]。殼寡糖是由殼聚糖酶專一性地降解殼聚糖后生成的，因此尋求具備高效降解能力的殼聚糖酶，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

殼聚糖酶是一類可催化氨基葡萄糖間的β-1，4-糖苷鍵斷裂的酶[14]，其來(lái)源廣泛，廣泛存在于一些真菌、細(xì)菌、放線菌中，甚至在植物病原菌、病毒中也有存在[15-19]。由于殼聚糖酶來(lái)源不同，酶學(xué)性質(zhì)也就不同，酶解產(chǎn)物殼寡糖的聚合度也會(huì)有所不同[20]。因此，對(duì)不同微生物來(lái)源的殼聚糖酶進(jìn)行分離純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

前期工作中，筆者在煙臺(tái)海域沙質(zhì)土壤中分離到1株殼聚糖酶產(chǎn)生菌株——莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）amyP216，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)生殼聚糖酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化[21]。在本研究中，對(duì)發(fā)酵液中的殼聚糖酶進(jìn)行分離純化，探討其酶學(xué)性質(zhì)，為該殼聚糖酶的更深入研究奠定理論基礎(chǔ)，也為該酶的工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 菌株 莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）菌株amyP216，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從煙臺(tái)海岸帶沙質(zhì)土壤分離篩選獲得。

1.1.2 試劑 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、乙酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉，均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡聚糖凝膠G-75（Pharmacia）、纖維素DE-32，購(gòu)自江蘇南京奧朵福尼生物科技有限公司;殼聚糖，購(gòu)自山東濟(jì)南海得貝生物工程有限公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker，由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所監(jiān)制。

1.1.3 儀器設(shè)備 Ф3.5 cm×70 cm層析柱，購(gòu)自上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;HL-2恒流泵，購(gòu)自上海滬西儀器廠有限公司;SBS-100數(shù)控記滴自動(dòng)部分收集器，購(gòu)自上海青浦滬西儀器廠;Z-323-K高速冷凍離心機(jī)、TDL-60B低速臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;WFJ7200可見(jiàn)光分光光度計(jì)，購(gòu)自尤尼科（上海）儀器有限公司;MD34透析袋（美國(guó)Viskase）;BS224S電子分析天平，購(gòu)自北京賽多利斯儀器有限公司;KDS超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，購(gòu)自浙江寧波新芝科技有限公司;HH-6水浴鍋，購(gòu)自江蘇省金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 菌株培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)基 LB斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 2.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.0。

液體種子培養(yǎng)基：膠體殼聚糖10 g/L、酵母浸粉5 g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO4 2 g/L，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：殼聚糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、MgSO4 0.5 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO4 2 g/L、CaCl2 0.1 g/L，pH值6.5[21]。

1.2.2 培養(yǎng)方法 菌種活化：取甘油管保藏菌種劃線至LB斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。

種子液：挑取單菌落接種至液體種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵：500 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)60 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：按5%接種量將種子液接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L自控發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量 2 L/（L·min），溫度30 ℃[21]。

1.3 殼聚糖酶的分離純化

取發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液，4 ℃、8 000 r/min離心15 min后，收集菌體。超聲波破碎20 min后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取上清液，加入硫酸銨至飽和度20%，4 ℃過(guò)夜，10 000 r/min 低溫離心30 min，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨固體至飽和度70%，4 ℃過(guò)夜，10 000 r/min低溫離心30 min，收集沉淀。將沉淀溶解于0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值8，含1 mol/L NaCl）中，透析濃縮后得粗酶液[16，22]。

取粗酶液3 mL進(jìn)行纖維素DE-32柱層析，并用 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值8，含1 mol/L NaCl）進(jìn)行洗脫，合并有酶活的部分并濃縮。然后采用葡聚糖凝膠G-75柱層析，并用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值8，含1 mol/L NaCl）作為洗脫液進(jìn)行洗脫，合并有酶活的部分并進(jìn)行濃縮[22-24]。

濃縮后的樣品采用SDS-PAGE凝膠電泳的方法進(jìn)行酶蛋白的純度分析以及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%[25]。

1.4 殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1 溫度及最適溫度的測(cè)定 將酶液與殼聚糖底物分別放于35、45、55、65、75、85 ℃水浴中反應(yīng)15 min，以確定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液在上述溫度中保溫120 min，以探討熱穩(wěn)定性。

1.4.2 pH值及最適pH值的測(cè)定 將酶液與殼聚糖底物放于pH值分別為4、5、6、7、8、9的磷酸緩沖液中反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活，以確定最適反應(yīng)pH值。將酶液放于上述的緩沖液中，保溫2 h，測(cè)定酶活性，以探討pH值穩(wěn)定性。

1.4.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 等量酶液與底物混合，加入不同金屬離子，使離子濃度達(dá)到0.5 mmol/L。不同金屬離子分別為Mn2+（MnSO4）、Mg2+（MgSO4）、Ca2+（CaCL2）、Cu2+（CuSO4）、Fe3+[Fe2（SO4）3]、Ba2+（BaSO4）、Li+（Li2SO4）、Zn2+（ZnSO4），以不加金屬離子為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活性并作圖，以探討金屬離子對(duì)酶活性的影響。

1.4.4 底物特異性 分別取1%殼聚糖醋酸溶液、膠體殼聚糖、羧甲基殼聚糖、膠體甲殼素、羧甲基纖維素鈉作為底物反應(yīng)，保溫15 min，以殼聚糖為底物作為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活性并作圖，以探討殼聚糖酶對(duì)底物的專一性。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 殼聚糖酶活性測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）測(cè)定還原糖的方法測(cè)定殼聚糖酶的活性[16，24]。以氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.083 93x+0.033 7。式中：y為吸光度D值;x為濃度，μmol/mL;r2=0.996 77。酶活性單位定義為1 mL發(fā)酵液 1 min 下釋放生成的微摩爾還原糖。

1.5.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法[25]，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.593 43x-0.042 12。式中：y為D值;x為濃度，μmol/mL;r2=0.999 26。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和誤差分析，用Origin 8繪圖軟件繪制圖形。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行試驗(yàn)，以3組數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析以得到準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖酶的分離純化

將破壁、鹽析、透析后殼聚糖酶粗酶液上樣于磷酸鹽緩沖液平衡好的DEAE層析柱，隨后用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值8，含1 mol/L NaCl）進(jìn)行洗脫，洗脫結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)共收集30管樣品，每管2.5 mL。在第18管處出現(xiàn)第1個(gè)酶活性和蛋白質(zhì)濃度最高峰，且酶活性峰值與蛋白濃度峰值基本重合;在第22管處出現(xiàn)第2個(gè)酶活性和蛋白質(zhì)濃度高峰，但其酶活性和蛋白質(zhì)含量明顯低于第1個(gè)峰。可見(jiàn)，殼聚糖酶的酶活性主要集中在第1個(gè)蛋白峰處。

把經(jīng)纖維素DE-32洗脫得到的第1個(gè)蛋白峰處的樣品收集、濃縮，上樣到葡聚糖凝膠G-75層析柱進(jìn)一步分離純化，洗脫圖譜如圖2所示。試驗(yàn)中共收集17管樣品，每管 4 mL，酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第6管和第11管處的蛋白樣有明顯的殼聚糖酶活性，第6管酶活性較高。蛋白峰出現(xiàn)在第5管和第10管處，第5管處蛋白濃度略高。

由表1可知，經(jīng)過(guò)鹽析、纖維素DE-32交換層析和葡聚糖凝膠G-75層析等一系列純化后，殼聚糖酶比活力達(dá)到 8.01 mol/（min·mg），回收率為4.4%。

對(duì)葡聚糖凝膠G-75層析中第6管處樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)其分析純度和相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。樣品為單一條帶，說(shuō)明所分離的殼聚糖酶純度較高，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker比對(duì)，可以得出分子量約為30 ku，這與Shimosaka等（31.9 ku）[19]、孫菲等（30 ku）[23]、段妍等（30.5 ku）[24]所純化的殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量大致相當(dāng);但是與Gao等（41 ku）[26]、Muslim等（45 ku）[18]、韓寶芹等（66.2 ku）[27]、Wang等（21、18 ku）[28]、Shehata等（130 ku）[29]純化相差較大?？梢?jiàn)，不同來(lái)源的殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量有明顯的差異。

由圖4可知，殼聚糖酶在324 nm處有最大吸光度，數(shù)值為0.265，具有一般酶蛋白的紫外吸收特征。

2.2 殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定 由圖5可知，曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，最高點(diǎn)出現(xiàn)在55 ℃處。55～65 ℃，曲線呈直線下降，當(dāng)超過(guò)65 ℃時(shí)，酶活性降至很低，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高使殼聚糖酶變性失去活性?？梢?jiàn)，殼聚糖酶反應(yīng)的最適溫度在55 ℃，這與楊立紅等所純化的殼聚糖酶的最適溫度[16，22，30]相同，但是與Gao等（60 ℃）[26]、Wang等（50 ℃）[28]、Shehata等（40 ℃）[29]所純化的殼聚糖酶的最適溫度不同。

由圖6可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，溫度越低，對(duì)酶的穩(wěn)定性越好。所有曲線都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在保溫60 min后50、60 ℃ 保溫條件下，酶活性均消失，在60 ℃下殼聚糖酶更快失去酶活;保溫90 min后，30、40 ℃也失去了酶活，40 ℃保溫條件下，相對(duì)酶活性下降得更快，即殼聚糖酶更容易失去酶活性。

2.2.2 pH值及pH值穩(wěn)定性測(cè)定 pH值對(duì)殼聚糖酶活性的影響如圖7所示，曲線呈先上升后下降的趨勢(shì)。在pH值5.5之前，酶活性隨pH值的升高而上升，當(dāng)pH值達(dá)到6以后，酶活性急劇下降，在pH值5.5處出現(xiàn)最高峰，可見(jiàn)殼聚糖酶反應(yīng)的最適pH值為5.5，這與Shehata等（40 ℃）[29]、隋斯光等[31]研究的殼聚糖酶的最適pH值相同。當(dāng)pH值為 6.0 時(shí)，本試驗(yàn)所純化得到的殼聚糖酶的活性大大降低，但是Gao等純化的殼聚糖酶的最適pH值卻是6.0[26，32]。這表明不同來(lái)源的殼聚糖酶的最適pH值差距較大，莫海威芽孢桿菌amyP216來(lái)源的殼聚糖酶的最適pH偏酸性。

pH值對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響如圖8所示。時(shí)間越長(zhǎng)，相對(duì)酶活性越小，在pH值為7即中性環(huán)境下，相對(duì)酶活性降低較慢，說(shuō)明保溫時(shí)間對(duì)酶活性的影響最小;pH值6環(huán)境下，酶活性降低程度次之;pH值4和5對(duì)酶活性的穩(wěn)定性影響較大，pH值為4時(shí)相對(duì)酶活性下降最快，對(duì)酶活性穩(wěn)定性影響最大。由此可得，pH值7最適合殼聚糖酶的保存。

2.2.3 金屬離子對(duì)酶活性的檢測(cè) 金屬離子對(duì)殼聚糖酶的影響結(jié)果如圖9所示，本試驗(yàn)所驗(yàn)證的金屬離子中，正1價(jià)金屬離子Li+對(duì)酶活性有明顯的抑制作用，在濃度達(dá)到 0.5 mmol/L 時(shí)，其相對(duì)酶活性為76.7%。正2價(jià)金屬離子中，Mn2+對(duì)酶活性有激活作用，在金屬離子濃度為0.5 mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活性達(dá)到263.1%，其原因可能與酶的活性中心有關(guān)。Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等都有一定的抑制作用，其中Ba2+的抑制作用最弱，相對(duì)酶活性為90.1%，Cu2+的抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活性達(dá)到39.7%。正3價(jià)金屬離子Fe3+對(duì)酶活性同樣有嚴(yán)重的抑制作用，是以上8種離子中抑制作用最強(qiáng)的，相對(duì)酶活性達(dá)到34.3%。

在本試驗(yàn)所研究的金屬離子中，只有Mn2+對(duì)酶活性有激活作用，其他金屬對(duì)酶活性均有抑制作用。這與其他來(lái)源的殼聚糖酶的試驗(yàn)結(jié)果也有所不同。Wang等研究發(fā)現(xiàn)Mn2+會(huì)抑制Serratia marcescens TKU011來(lái)源的殼聚糖酶[28]，周念波等研究發(fā)現(xiàn)Zn2+、Ca2+對(duì)Bacillus sp. LS產(chǎn)的殼聚糖酶有一定的激活作用[22]，這進(jìn)一步表明不同微生物來(lái)源的殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)是有差異的。

2.2.4 底物特異性檢測(cè) 如表2所示，殼聚糖酶對(duì)殼聚糖的水解能力最強(qiáng)，對(duì)羧甲基纖維素鈉、DEAE纖維素和甲殼素也有一定的水解能力，其水解能力依次降低?？梢?jiàn)，純化所得的殼聚糖酶底物特異性較好。

3 結(jié)論

殼聚糖酶是理想的制備殼寡糖的酶制劑，本研究以高產(chǎn)殼聚糖酶的莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis） amyP216發(fā)酵液為原料，經(jīng)過(guò)超聲波破壁處理、硫酸銨分級(jí)沉淀、纖維素DE-32陰離子交換柱層析、葡聚糖凝膠過(guò)濾層析等方法純化后，得到了電泳純殼聚糖酶，純化倍數(shù)達(dá)到25.21倍，相對(duì)酶活性為8.01 mol/（min·mg），回收率為4.4%。電泳法測(cè)定莫海威芽孢桿菌來(lái)源殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量為30 ku，全波段掃描結(jié)果顯示在324 nm處出現(xiàn)最高峰，峰值為0.265 Abs。

經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為 55 ℃，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，溫度越低，酶的穩(wěn)定性越好;最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值7時(shí)酶的穩(wěn)定性較好;在試驗(yàn)范圍內(nèi)，金屬離子Mn2+對(duì)其激活作用最明顯，Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+等金屬離子對(duì)其有抑制作用;該酶具有相對(duì)較好的底物特異性。下一步研究將對(duì)該酶進(jìn)行基因工程研究，以提高酶的表達(dá)量，為其產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

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