瞿運秋 趙文佳 陳繼光
摘要:前期從余甘子中分離鑒定了一系列對α-葡萄糖苷酶有較好抑制活性的沒食子單寧成分,柯里拉京為其中的1個主要活性成分,本試驗進一步對柯里拉京抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用機制進行了研究。采用體外微量96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)模型測定了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制活性,并進行了抑制動力學(xué)試驗,以非線性擬合法分析了其對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù),同時采用分子對接模型研究了柯里拉京與α-葡萄糖苷酶相互作用的機制。結(jié)果表明,柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L,顯著低于陽性對照阿卡波糖的IC50(79.88 μmol/L);非線性擬合結(jié)果發(fā)現(xiàn),柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力。結(jié)果為柯里拉京作為降糖保健品或藥品開發(fā)提供了理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞:余甘子;柯里拉京;α-葡萄糖苷酶;酶動力學(xué);酶抑制;分子對接
中圖分類號: R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)14-0206-03
以胰島素抵抗為特征的Ⅱ型糖尿病占糖尿病發(fā)病總數(shù)90%以上,我國Ⅱ型糖尿病的患病人數(shù)占總?cè)丝?0%左右,成為全球糖尿病患病人數(shù)第二大國[1]。糖尿病主要對眼睛、腎臟、神經(jīng)心血管、下肢血管等造成損害并發(fā)癥,甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭,因此針對糖尿病的治療主要以控制血糖水平,預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生為主。以阿卡波糖為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有很好地控制餐后血糖水平的功效,是臨床常用的治療糖尿病藥物。
α-葡萄糖苷酶是存在于小腸絨毛膜上的一組酶系,能夠催化食物中淀粉、蔗糖和麥芽糖等多糖、寡糖和二糖水解為可吸收的單糖(葡萄糖和果糖)。α-葡萄糖苷酶的抑制劑通過競爭抑制α-葡萄糖苷酶活性,延緩多糖、寡糖和二糖向單糖的轉(zhuǎn)化,控制餐后血糖濃度[2]。最近幾年,以α-葡萄糖苷酶為作用靶點,從藥用、可食性植物或微生物中篩選活性成分是研究熱點[3-6]。對α-葡萄糖苷酶有抑制作用的植物活性成分主要包括萜類、生物堿、醌類、黃酮、多酚、苯丙烷和類固醇化合物等[7]。多酚類化合物可以通過多途徑抑制α-葡萄糖苷酶活性,金銀花花蕾中3,5-二咖啡酰奎寧酸通過非競爭性抑制小腸α-葡萄糖苷酶活性[8];然而,劉雪輝等對從紫甘薯莖葉中分離的4個高純度咖啡?;鼘幩犷愃莆铮ňG原酸、4,5-O-咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-咖啡?;鼘幩峒?,4-O-咖啡?;鼘幩幔┮种痞?葡萄糖苷酶活性機制進行了研究,結(jié)果表明,這些物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制[9]。因此對同一個化合物抑制α-葡萄糖苷酶機制進行研究,不同的學(xué)者會得出不同的結(jié)論,筆者所在課題組前期通過5種方法對阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進行了詳細(xì)地分析,結(jié)果表明,非線性擬合法更加簡便、合理及可靠,可以是研究酶促動力學(xué)的首選方法[10]。
余甘子為大戟科葉下珠屬植物的干燥成熟果實,有機酸類物質(zhì)是其主要成分,前期從余甘子降血糖活性部位分離鑒定出7個酚類活性成分,均具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用[11],尤其是沒食子酸和柯里拉京活性最強??吕锢┦且环N逆沒食子酸鞣質(zhì),主要存在于龍眼核、余甘子、葉下珠全草、龍眼殼、欖仁樹葉和纖梗葉下珠全草等植物中[12],具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗血栓、抑制病毒、抗菌、抗炎、降血壓等藥理作用,具有很大的藥用前景[13]。《中華人民共和國藥典》(2015版)規(guī)定沒食子酸為評價余甘子質(zhì)量的指標(biāo)成分,目前有較多學(xué)者報道增加多酚類成分柯里拉京為余甘子的另一個質(zhì)控指標(biāo)。
為了進一步探討柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機制,本研究采用非線性擬合法對其抑制α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的動力學(xué)數(shù)據(jù)進行分析,采用分子對接技術(shù),初步探討其作用α-葡萄糖苷酶的主要作用位點,以期確定其抑制 α- 葡萄糖苷酶的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
α-葡萄糖苷酶,購自美國Sigma公司;4-硝基苯基-α-D- 吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG),購自美國Sigma公司;阿卡波糖(Acarbose),購自廣東省廣州市億邦醫(yī)藥科技有限公司;對硝基苯酚(PNP),購自上海展云化工有限公司;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀(國產(chǎn)分析純),購自西隴化工股份有限公司;甘油(國產(chǎn)分析純),購自上海瑞楚生物科技有限公司;實驗用水均為超純水。
1.2 主要儀器
SpectraMax M2型酶標(biāo)儀,美國分子儀器有限公司(Molecular Devices);HH60型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱,江蘇南京溫諾儀器設(shè)備有限公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 試劑的配制 PBS(磷酸鹽緩沖液):稱取4.559 g KH2PO4和7.646 g K2HPO4·3H2O,以去離子水定容至 500 mL,調(diào)節(jié)pH值至6.8,121 ℃滅菌20 min,4 ℃貯存?zhèn)溆?α-葡萄糖苷酶:將α-葡萄糖苷酶凍干粉溶于含50%甘油的磷酸鹽緩沖液(pH值6.8),配制成100 U/mL的酶溶液,分裝,-20 ℃凍存?zhèn)溆?PNPG、PNP、阿卡波糖均以磷酸緩沖液配制,置于4 ℃冰箱冷藏備用。
1.3.2 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取不同體積的PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液于96孔板中,以PBS補足至200 μL,配成0、0.03、0.06、0.15、0.30、0.60、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00、48.00、96.00 nmol的系列PNP標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于405 nm處測定吸光度,重復(fù)測定4次。以吸光度(D)為橫坐標(biāo),PNP的物質(zhì)的量為縱坐標(biāo),繪制測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定方法 以微量的96孔板α-葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系為模型進行檢測,具體操作如下:依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)5 μL、待測抑制劑樣品10 μL,混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;加入16 μL的PNPG(2.5 mmol/L),置于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min,于405 nm波長下測定吸光度,重復(fù)檢測3次,每次設(shè)4個平行處理。以阿卡波糖為陽性對照物,濃度設(shè)為1.0 mmol/L;待測抑制劑設(shè)5、10、20、40、80 μmol/L 5個濃度梯度。
酶活抑制率=(D空白-D樣品)/D空白×100%。
式中:D空白為未加抑制劑組的吸光度;D樣品為待測抑制劑組的吸光度。采用Graphpad prism 5.0軟件處理試驗數(shù)據(jù),計算待測抑制劑的半抑制濃度(IC50)。
1.3.4 抑制劑抑制動力學(xué)檢測方法 基于微量的96孔板 α- 葡萄糖苷酶-PNPG反應(yīng)體系進行檢測,具體操作如下:依次往各反應(yīng)孔中加入PBS、α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)5 μL和待測抑制劑溶液10 μL(以阿卡波糖陽性對照物),混勻后置于37 ℃水浴中孵育20 min;每孔分別加入0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600、0.800、1.000 mmol/L 的PNPG,于 37 ℃ 水浴中反應(yīng)6 min,405 nm波長下測定吸光度,計算反應(yīng)速度,重復(fù)檢測3次。采用Origin 8.4軟件,以底物濃度(S)為自變量、反應(yīng)速度(v)為因變量進行非線性擬合,計算抑制劑作用下反應(yīng)體系的表觀vmax和表觀Km,并通過方差分析來判斷vmax和Km的差異顯著性,據(jù)此確定待測抑制劑的抑制作用類型。
1.3.5 酶與抑制劑分子對接方法 參照王雪潔等的方法[14]進行分子對接模擬,具體操作方法如下:
1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶空間立體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB下載α-葡萄糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)文件(PDB ID:2f6d,resolution:1.6 ,其中有配體抑制劑阿卡波糖),在Linux系統(tǒng)下使用Pymol軟件(version:1.7.2.1)去除其中的溶劑分子、磷酸根離子和鈉離子,再提取原配體阿卡波糖分子(ACR),確定結(jié)合位點,然后以Autodock Tools將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式,以此格式進行后續(xù)分子對接。
1.3.5.2 配體小分子的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 從PubChem數(shù)據(jù)中下載柯里拉京(CAS:23094-69-1)3D結(jié)構(gòu)文件,采用MM2力場進行能量最小化,以Autodock Tools程序添加Gasteiger電荷,合并非極性氫原子后,將其轉(zhuǎn)化成pdbqt格式,作為對接配體的初始結(jié)構(gòu)。
1.3.5.3 分子對接 采用Autodock Tools-grids,根據(jù)原有的配體阿卡波糖的坐標(biāo)文件將Grid Box的中心坐標(biāo)設(shè)置為(11.851,11.479,-6.564),格點盒子大小設(shè)置為40×46×40,格點間距設(shè)置為0.375 ,即空間大小為15 ×17.25 ×15 。使用Autodock vina軟件,采用Lamarckian遺傳算法(局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合)進行對接,通過分子對接確定兩者的結(jié)合位置,獲得受體蛋白與配體小分子的結(jié)合自由能,分析配體與受體之間氫鍵結(jié)合的位置和數(shù)量以及酶蛋白與配體之間的疏水相互作用。
2 結(jié)果與分析
2.1 PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線
本研究繪制了PNP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程為y=50.696x,其決定系數(shù)(r2)為0.999 8。
2.2 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制效果
本研究檢測了5.0~80.0 μmol/L柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果,結(jié)果如圖1所示。隨著柯里拉京濃度的升高,抑制率不斷升高,當(dāng)濃度為80.0 μmol/L時,抑制率達(dá)到了59.38%。經(jīng)Graphpad prism 5.0軟件計算,本研究所采用的檢測條件下柯里拉京的半抑制濃度IC50為 15.33 μmol/L,低于阿卡波糖的半抑制劑濃度79.88 μmol/L。由此可知,柯里拉京對α-葡萄糖苷酶有很強的抑制效果,在降糖功能食品和藥物的開發(fā)方面具有很好的前景。
2.3 柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)
采用Origin 8.4軟件對柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)進行了非線性擬合,擬合結(jié)果如圖2所示,所得表觀vmax、表觀Km如表1所示。方差分析結(jié)果表明,與空白模型(無抑制劑作用下)相比,在柯里拉京作用下,反應(yīng)體系的表觀Km顯著提高,而表觀vmax極顯著下降,柯里拉京表現(xiàn)出了顯著的混合抑制作用特點[10],因此確定柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制。
根據(jù)酶促反應(yīng)理論,混合型抑制動力學(xué)的方程為
v=vmax[S]Km1+[I]Ki+[S]1+[I]Ki。
式中:[S]為底物濃度;[I]為抑制劑濃度。
對該方程進行雙倒數(shù)變換,再分別以變換后線性方程的斜率和截距對抑制劑濃度[I]作圖,據(jù)此計算出了柯里拉京的抑制常數(shù)Ki和Ki′,分別為37.37 μmol/L和76.3 μmol/L。
2.4 柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接
柯里拉京與α-葡萄糖苷酶分子對接結(jié)果如圖3和圖4所示。通過對接分析,發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶與柯里拉京分子之間4 以內(nèi)的相互作用的的氨基酸有21個(圖4),具體如下:PRO-61、ASP-62、TYR-63、TRP-67、LYS-127、TYR-135、ALA-138、TRP-139、GLY-140、PHE-206、TRP-209、GLU-210、GLU-211、ARG-345、TYR-351、GLY-353、ASP-354、GLY-355、SER-356、TRP-362、GLU-456。從空間對接模型圖(圖3、圖4)可知,在酶的活性腔中,柯里拉京分子的非極性基團被極性基團包裹,其分子上的羥基與酶蛋白的氨基酸殘基之間形成了12個氫鍵,具體如下:與ARG-345殘基形成了2個氫鍵,與TRP-209殘基形成了1個氫鍵,與GLU-210殘基形成了1個氫鍵,與GLU-211殘基形成了1個氫鍵,與SER-356殘基形成了1個氫鍵,與TYR-63殘基形成了2個氫鍵,與TYR-351殘基形成了4個氫鍵。Autodock vina軟件計算結(jié)果顯示,兩者之間的結(jié)合自由能為-33.91 kJ/mol。以上分析結(jié)果表明,氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶之間相互結(jié)合的主要作用力, 柯里拉京可以很好地結(jié)合于酶的活性口袋之中,結(jié)合自由能較低,模型較好地解釋了柯里拉京對α-葡萄糖苷酶的高抑制活性。
3 結(jié)論
柯里拉京是藏藥余甘子抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分,半抑制濃度IC50為15.33 μmol/L,抑制效果遠(yuǎn)高于陽性對照藥物阿卡波糖,非線性擬合分析表明,其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制;分子對接發(fā)現(xiàn)氫鍵是柯里拉京與α-葡萄糖苷酶主要的相互作用力,后續(xù)將采用糖尿病動物模型進一步研究藏藥余甘子及其柯里拉京成分的降血糖作用,可以進一步開發(fā)為降糖保健品或藥品。
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