彭官清，凌 喬，余舒瑩

(1.浙江省臺州市溫嶺市第一人民醫(yī)院感染科 317500；2.浙江省杭州市兒童醫(yī)院藥劑科 310013)

肺炎是指由理化因素、微生物等造成的終末氣道、肺泡及肺間質(zhì)的炎癥，最常見的為細菌性肺炎，細菌性肺炎最常見的革蘭陰性條件致病菌為肺炎克雷伯桿菌，肺炎克雷伯桿菌是嬰兒和新生兒醫(yī)院獲得性肺炎的常見致病菌，嚴(yán)重可危及患兒生命[1-2]。肺部感染后可產(chǎn)生大量炎性細胞因子加重炎癥癥狀[3]，核因子-κB(NF-κB) p65和IκB激酶α(IκBα)蛋白在呼吸道炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]，為目前肺炎藥物開發(fā)的潛在靶點之一。miRNA-155在炎癥、免疫反應(yīng)、心血管功能等方面具有重要作用，在呼吸系統(tǒng)疾病中，miRNA-155參與肺癌、哮喘、肺結(jié)核等疾病的形成過程[5]，在肺炎的發(fā)生中也具有重要作用[6]，但miRNA-155是否通過NF-κB通路參與肺炎的發(fā)生、發(fā)展過程尚不清楚。本文對重癥肺炎大鼠肺組織中miRNA-155表達及過表達miRNA-155對肺組織NF-κB信號通路及其下游炎性細胞因子水平的影響進行研究，以為臨床重癥肺炎的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：健康、雌雄各半的SD大鼠45只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號為SCXK(滬)2012-0002。主要試劑：兔抗pp65單克隆抗體、兔抗p65單克隆抗體、兔抗磷酸化IκBα(p-IκBα)單克隆抗體、兔抗IκBα單克隆抗體等抗體購自美國Sigma公司，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液購自美國RB公司，肺炎克雷伯桿菌由溫嶺市第一人民醫(yī)院檢驗科提供(將肺炎克雷伯桿菌在瓊脂平皿中培養(yǎng)18 h，調(diào)整濃度為1.5×109cfu/mL)，miRNA-155 mimics由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及處理 將45只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、肺炎組(肺炎模型)、miRNA-155組(肺炎模型+miRNA-155 minics)，每組15只。將大鼠水合氯醛麻醉成功后，消毒頸部皮膚，切開頸部皮膚暴露上段氣管，miRNA-155組將40 μg miRNA-155 mimics滴入氣管，對照組和肺炎組滴入等量生理鹽水，24 h后，肺炎組和miRNA-155組用注射器將0.15 mL菌液滴入氣管，對照組大鼠滴入等量生理鹽水。給藥后將大鼠直立保持30 s，使接種菌液因重力作用進入肺組織，然后縫合傷口，局部消毒。

1.2.2標(biāo)本采集 給藥24 h后，水合氯醛麻醉大鼠，抽取頸靜脈血5 mL，分離血清進行血清中白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平測定；頸動脈放血處死大鼠，迅速開胸，取出左肺組織用于蘇木精-伊紅(HE)染色，右肺組織置于液氮中用于肺組織中miRNA-155、IL-1β、IL-6、TNF-α水平和pp65、p65、p-IκBα、IκBα蛋白水平測定。

1.2.3肺組織中miRNA-155水平測定 取80 mg左右肺組織，按照試劑盒說明書提取肺組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RT-PCR測定肺組織miRNA-155(上游引物：5′-UUA ALU GGU AAU UGU CAU ACG GGU-3′，下游引物：5′-CCC UAU GAC AAU UAC CAU UAA UU-3′)水平，RT-PCR反應(yīng)條件為：56 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；20 ℃ 2 min，以U6為內(nèi)參基因，miRNA-155相對表達量以2-ΔΔCT表示。

1.2.4肺組織HE染色 將肺組織 在多聚甲醛溶液中固定，固定后取出放入脫水機中脫水，透明、浸蠟過夜，包埋機進行石蠟包埋，將石蠟塊切成厚4 μm切片，烤片機中烤片15 min，脫蠟、蘇木精染色8 min，放入鹽酸乙醇中3 s，放入氨水中5 s，放入伊紅中染色2 min，二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色情況。

1.2.5肺組織勻漿中IL-1β、IL-6及TNF-α水平測定 將肺組織于生理鹽水中攪碎勻漿化，再將勻漿的肺組織離心收集上清液，采用ELISA法測定肺組織勻漿中IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

1.2.6血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平測定 將大鼠頸靜脈血5 mL離心取血清，采用ELISA法測定血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

1.2.7肺組織pp65、p65、p-IκBα及IκBα蛋白水平測定 取適量肺組織加入裂解液和蛋白酶抑制劑，采用超聲破碎成組織勻漿，將勻漿組織置于冰中裂解，提取肺組織總蛋白，測定蛋白水平，采用Western blot測定肺組織pp65、p65、p-IκBα、IκBα蛋白水平：將蛋白上樣、凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)膜，加入一抗(兔抗pp65單克隆抗體、兔抗p65單克隆抗體、兔抗p-IκBα單克隆抗體、兔抗IκBα單克隆抗體)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參，加入二抗孵育2 h，加入ECL曝光液曝光，采用Quantity one軟件分析各條帶灰度值。

A：對照組；B：模型組；C：miRNA-155組

圖1 3組大鼠肺組織HE染色(×400)

2 結(jié) 果

2.13組大鼠肺組織中miRNA-155水平比較 3組大鼠肺組織中miRNA-155水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組(1.00±0.07)比較，肺炎組大鼠肺組織miRNA-155水平(0.36±0.05)明顯降低(P<0.05)；與肺炎組比較，miRNA-155組大鼠肺組織miRNA-155水平(0.82±0.06)明顯升高(P<0.05)。

2.23組大鼠肺組織HE染色比較 對照組大鼠肺小葉結(jié)構(gòu)清晰，支氣管黏膜上皮完整，肺泡腔結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無炎性細胞浸潤；模型組大鼠用藥后1 d肺組織結(jié)構(gòu)消失，肺泡萎陷，肺泡腔內(nèi)有滲出、出血，肺泡間隔斷裂、增寬，血管擴張充血，見大量炎性細胞浸潤，表明重癥肺炎模型建模成功；miRNA-155組大鼠肺泡腔滲出、出血和炎性細胞浸潤較肺炎組減輕，見圖1。

2.33組大鼠肺組織勻漿中IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 與對照組比較，肺炎組大鼠肺組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與肺炎組比較，miRNA-155組大鼠肺組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠肺組織中IL-1β及IL-6等

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與肺炎組比較

2.43組大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較 與對照組比較，肺炎組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與肺炎組比較，miRNA-155組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.53組大鼠肺組織NF-κB信號通路蛋白水平比較 3組大鼠肺組織中p65、IκBα蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠肺組織中pp65、p-IκBα蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，肺炎組大鼠肺組織pp65、p-IκBα蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與肺炎組比較，miRNA-155組大鼠肺組織中pp65、p-IκBα蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表2 3組大鼠血清中IL-1β及IL-6等

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與肺炎組比較

表3 3組大鼠肺組織NF-κB信號通路蛋白相對表達水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與肺炎組比較

A：對照組；B：肺炎組；C：miRNA-155組

圖2 3組大鼠肺組織中相關(guān)蛋白Western blot電泳圖

3 討 論

肺炎克雷伯桿菌是非常常見的一種革蘭陰性條件致病菌，當(dāng)侵入下呼吸道時可引起肺泡毛細血管充血水腫，肺泡內(nèi)炎性細胞浸潤和紅細胞滲出[7]，本文通過向大鼠氣道內(nèi)滴入克雷伯桿菌建立大鼠重癥肺炎模型，發(fā)現(xiàn)用藥后1 d，大鼠肺組織結(jié)構(gòu)消失，肺泡萎陷，肺泡腔內(nèi)有滲出、出血，肺泡間隔斷裂、增寬，血管擴張充血，見大量炎性細胞浸潤，表明重癥肺炎模型建模成功。

miRNA是長約22個堿基、非編碼、內(nèi)源性、單鏈RNA，可與靶向mRNA的3′端非編碼區(qū)結(jié)合使其降解或阻止其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關(guān)基因的表達[8-9]。人類大部分基因受miRNA調(diào)控，miRNA的功能涉及細胞分化、增殖、凋亡、代謝等多種細胞進程[10]。miRNA-155為miRNAs重要成員之一，參與病毒感染、造血、免疫應(yīng)答等多種細胞功能調(diào)控[11]；miRNA-155在T細胞應(yīng)答和B細胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，固有免疫中Toll樣受體配體可以通過TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)信號通路或髓樣分化因子88(MyD88)上調(diào)miRNA-155水平，miRNA-155和轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(TAK1)相關(guān)結(jié)合蛋白2(TAB2)結(jié)合抑制Toll樣受體信號通路中的NF-κB表達，負(fù)反饋調(diào)節(jié)脂多糖介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的表達；miRNA-155在肺癌、肺結(jié)核、肺纖維化、哮喘等肺部疾病的形成中也發(fā)揮重要作用，miRNA-155通過介導(dǎo)多種細胞因子表達參與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)重癥肺炎大鼠肺組織中miRNA-155水平降低，表明miRNA-155參與重癥肺炎的發(fā)生、發(fā)展。

炎性細胞因子在重癥肺炎的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，IL-1β為在機體感染時由內(nèi)皮細胞、單核細胞、成纖維細胞等細胞產(chǎn)生的細胞因子，可刺激血小板生長因子、集落刺激因子等細胞因子的產(chǎn)生，可使T細胞產(chǎn)生IL-2，在組織修復(fù)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用；可介導(dǎo)B細胞活化、增殖和分化，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在肺炎患者中IL-1β水平升高[14]。IL-6由T淋巴細胞、單核巨噬細胞、B淋巴細胞、上皮細胞及多種腫瘤細胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)B細胞分化、誘導(dǎo)IL-2表達、增強NK細胞活性等；IL-6也是介導(dǎo)機體炎性反應(yīng)的細胞因子，是炎性反應(yīng)的重要遞質(zhì)，在肺炎中IL-6水平升高[15]。TNF-α由活化的巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，生物活性復(fù)雜，參與感染、炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)控，可促進白細胞聚集到炎癥部位并活化，從而加重炎性反應(yīng)，肺炎中TNF-α水平升高[16]。NF-κB可特異性與增強子κB位點或多種基因啟動子位點結(jié)合，并促進其轉(zhuǎn)錄，NF-κB在細胞最常見的形式為p65和p50形成的二聚體[17]，在未受刺激時，二聚體與IκB結(jié)合，在機體受到刺激時，IκB被降解并磷酸化，釋放p65，使p65從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，從而發(fā)揮對炎癥相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)[4，18]。NF-κB與IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控肺炎的發(fā)生過程[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平和pp65、p-IκBα蛋白水平升高；上調(diào)肺組織中miRNA-155水平后，IL-1β、IL-6、TNF-α水平和pp65、p-IκBα蛋白水平降低?？梢娭匕Y肺炎大鼠肺部炎癥的發(fā)生可能為細菌感染肺組織后激活NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的激活調(diào)控下游的IL-1β、IL-6、TNF-α細胞因子水平，使肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α細胞因子水平升高，從而引起肺組織的炎性損傷；過表達miRNA-155干預(yù)后，可明顯降低肺組織炎性反應(yīng)，其機制可能為過表達miRNA-155干預(yù)增加肺組織miRNA-155水平，miRNA-155參與T細胞應(yīng)答和B細胞應(yīng)答過程，通過和TAB2結(jié)合，抑制Toll樣受體信號通路中的pp65、p-IκBα蛋白水平，抑制NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的抑制負(fù)反饋調(diào)節(jié)肺炎克雷伯桿菌引起的IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達，減輕炎性反應(yīng)對肺組織的損傷，從而發(fā)揮對肺組織的保護作用。

綜上所述，重癥肺炎肺組織中miRNA-155水平降低，過表達miRNA-155可降低重癥肺炎肺組織的炎性反應(yīng)，其機制可能與miRNA-155抑制NF-κB信號通路有關(guān)。由此可見，miRNA-155有望成為重癥肺炎治療的潛在靶點。