李偉偉 衣啟君 趙國(guó)光

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，山東 泰安 271000

缺血缺氧性腦病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，致死率與致殘率均較高，存活者大多留有不同程度的神經(jīng)功能缺損，挽救缺血半暗帶瀕死的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)是治療的關(guān)鍵。如何應(yīng)用各種措施更好使病人神經(jīng)功能得到改善一直是各方學(xué)者研究的重點(diǎn)。外源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植用于腦缺血模型中，并在腦組織中遷移分化國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，并且多項(xiàng)研究表明綠色熒光蛋白(green fluorescent Protein,GFP)可以作為外源性神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)遷移分化的良好示蹤。高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)用于治療缺血缺氧性腦病的療效已經(jīng)得到證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)重在研究HBO對(duì)外源性GFP-標(biāo)記NSCs在局灶性腦缺血大鼠腦組織遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

39只雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重250～300 g，自由飲食水，保持12 h日夜交替，隨機(jī)分為3組(n=13)：神經(jīng)干細(xì)胞移植組(NSCs組),神經(jīng)干細(xì)胞+高壓氧組(HBO+NSCs組)與神經(jīng)干細(xì)胞+常壓氧組(Cyy+NSCs組)。

1.2 MACO模型

各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥50 mg/kg麻醉,參照Longa法略加改進(jìn)制作腦缺血模型，即分離、結(jié)扎并切斷右側(cè)頸外動(dòng)脈，由頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入直徑為(0.36±0.02)mm的單尼龍栓線，進(jìn)線深度距頸動(dòng)脈分叉處(1.8±0.1)cm，阻塞大腦中動(dòng)脈入口，造成缺血。再灌注24 h后，按Longa的5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分即0分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，1分：左前肢不能完全伸直，2分：向左旋轉(zhuǎn)，3分：向左傾倒，4分：不能自己行走或昏迷；1～3分為有效模型。

1.3 神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)蘇

GFP-標(biāo)記的SD大鼠NSCs(購(gòu)于賽業(yè)廣東技術(shù)有限公司),取出細(xì)胞迅速放入37℃水浴中快速晃動(dòng)直至凍存液完全溶解, 吸出細(xì)胞懸液并加入10倍DMEM/F12(1∶1)的無(wú)血清培養(yǎng)基(內(nèi)含bFGF 20 μg/L, EGF 20 μg/L,B27 20 mL/L, L-谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素和鏈霉素1×105u/L)，離心棄上清，重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。5～7 d傳代一次，細(xì)胞傳至第3代神經(jīng)細(xì)胞球形成時(shí)，行神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(neuoepithelial stem cell protein, Nestin)免疫熒光染色，NSCs純度達(dá)到90%可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 NSCs腦室注射

再灌注后24 h，NSCs組、HBO+NSCs組與Cyy+NSCs組大鼠,2%戊巴比妥麻醉后，在立體定向儀的固定下，通過(guò)微量注射器將上述制備的NSCs懸液5 μL(密度為1×106/μL)注入右側(cè)側(cè)腦室，注射位點(diǎn)坐標(biāo)：AP=-0.8 mm，MR=-1.5 mm,DV=-3.5 mm。

1.5 高壓氧治療

側(cè)腦室注射后2 h，HBO+NSCs組立即給予高壓氧治療,先用純氧洗倉(cāng)10 min，使艙內(nèi)氧濃度>95%，再0.012 5 MPa/min的速率加壓至0.2 MPa，在高壓下停留60 min，其間用純氧通風(fēng)10 min，停畢勻速減至常壓，連續(xù)7 d。Cyy+NSCs組常壓吸95%的氧氣，連續(xù)7 d，NSCs組僅吸空氣。

1.6 海馬標(biāo)本

各組大鼠于側(cè)腦室注射后第8天，腹腔注射戊巴比妥50 mg/kg后處死各組大鼠，取海馬存于液氮。

海馬caspase-3采用western blot法進(jìn)行測(cè)定，取各組海馬，胰酶消化后加入裂解緩沖液中充分裂解，4℃ 13 000 r/min離心，取上清，獲得蛋白樣本。將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度，取等量上樣緩沖液于試管中，蛋白量為100 μg，并于95～100℃ 5 min后冰上冷卻上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓60 V約20 min，分離膠80 V約80 min。取出凝膠，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min。準(zhǔn)備濾紙及NC膜，分別置入轉(zhuǎn)移緩沖液及去離子水中。平放底部電極(陽(yáng)極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排出各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200 mA通電，電轉(zhuǎn)移1 h。平放底部電極(陽(yáng)極)，在上面分別放置濾紙、NC膜、凝膠和濾紙，排出各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上。按恒流200 mA通電，電轉(zhuǎn)移1 h。按約0.1 mL/cm2的量加入封閉液和適量一抗(1∶500稀釋，Jackson公司)。搖床搖蕩孵育(4℃，過(guò)夜)。PBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔,Jackson公司)用封閉液稀釋(1∶5 000)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。按0.1 mL/cm2顯影液計(jì)算用量，將顯影液加于NC膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機(jī)中顯影、洗像。調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。采用image J分析軟件分析，以目標(biāo)條帶與β-action灰度比值反應(yīng)caspase-3的表達(dá)水平。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)

各組大鼠分別取3只戊巴比妥麻醉，0.9%氯化鈉灌注后取右側(cè)海馬，采用RT-PCR法測(cè)定腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA的表達(dá)。用總RNA抽提試劑盒(Invitrogen life technologies,美國(guó))分別提取海馬BDNF與VEGF，使用分光光度計(jì)對(duì)RNA的質(zhì)和量鑒定。用MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，引物用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，BDNF上游引物 5’- TTCCCCAGCGGTCTTCCCGC-3’,下游引物5’- CAGGCGGTTGTTCAGGTACA-3’；VEGF上游引物5’- GAGTTAAACGAACGTACTTGCAGA-3’，下游引物5’- TCTAGTTCCCGAAACCCTGA-3’；β-Actin上游引物5’-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT -3’，下游引物5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA -3’。反應(yīng)條件：95℃，5 min；40個(gè)PCR循環(huán)。電泳圖證實(shí)PCR擴(kuò)增的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCT的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法。

1.8 冰凍切片

側(cè)腦室注射后第8天，各組大鼠分別取6只，2%戊巴比妥麻醉后，處死取新鮮腦組織，OTC(聚乙二醇和聚乙烯醇水溶物)包埋后，行腦組織冰凍切片，每隔100 μm切取5張，片厚25 μm。組織切片經(jīng)PBS水化后，行DAPI(一種能與DNA結(jié)合的強(qiáng)力染料，紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)光)染色10 min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況，并拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

各組大鼠western blot檢測(cè)海馬caspase-3灰度比值結(jié)果中，HBO+NSCs組caspase-3的表達(dá)量明顯低于NSCs組和Cyy+NSCs組(P<0.05)；同時(shí)Cyy+NSCs組與NSCs組比較caspase-3的表達(dá)量也成下降趨勢(shì)(P<0.05)；見圖1。Real time-PCR檢測(cè)海馬BDNF與VEGF含量結(jié)果中，HBO+NSCs組海馬BDNF與VEGF的mRNA表達(dá)明顯高于NSCs組和Cyy+NSCs組(P<0.05)；同時(shí)Cyy+NSCs組兩者mRNA表達(dá)量也高于NSCs組(P<0.05)；見表1。熒光顯微鏡下觀察腦組織冰凍切片，發(fā)現(xiàn)GFP-標(biāo)記NSCs移植后7天，移植細(xì)胞遷移至海馬與缺血損傷區(qū)，但細(xì)胞存活量相對(duì)移植量明顯減少，大多數(shù)細(xì)胞仍然局限于針道附近，僅少數(shù)細(xì)胞遷移至缺血損傷區(qū)，移植后7天綠色熒光的表達(dá)仍然很強(qiáng),見圖2～4。HBO+NSCs組缺血損傷區(qū)移植細(xì)胞數(shù)量明顯高于Cyy+NSCs組與NSCs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Cyy+NSCs組缺血損傷區(qū)移植細(xì)胞的存活量也高于NSCs組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，鏡下未見瘤體的形成與膠質(zhì)瘢痕的發(fā)生。

圖1 三組大鼠海馬caspase-3表達(dá)的比較

分組HBO+NSCsNSCsCyy+NSCsBDNFVEGF0.87±0.22a1.02±0.04a0.05±0.020.07±0.010.13±0.02b0.14±0.02b

注：與Cyy+NSCs組和NSCs組比較，aP<0.05；與NSCs組比較，bP<0.05。

圖2 三組大鼠海馬BDNF與VEGF mRNA的表達(dá)量

1.HBO+NSCs組缺血損傷區(qū)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞(綠色熒光)，×400； 2.Cyy+NSCs組缺血損傷區(qū)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞，×400；3.NSCs組缺血損傷區(qū)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞，×400。

表2 移植后7天各組缺血損傷區(qū)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/400倍視野，

注：與Cyy+NSCs組和NSCs組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

3 討 論

缺血性腦部疾患的發(fā)生率一直居高不下，在美國(guó)每年有超過(guò)700 000病人因中風(fēng)導(dǎo)致偏癱，是第三大致死性疾病之一。在我國(guó)腦血管病致殘率、致死率也相當(dāng)高,存活者大多留有不同程度的神經(jīng)功能缺損，如何更好的使病人的神經(jīng)功能得到改善一直是各方學(xué)者研究的重點(diǎn)，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為缺血缺氧性腦病的治療提供了新的途徑。

1992年Reynolds等從成年小鼠紋狀體中分離出在體外不斷分裂增殖、并具有多向分化潛能的細(xì)胞，NSCs的概念被首次提出[1]。NSCs是具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中它可以分化為3種主要的細(xì)胞類型，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞[2]。NSCs可以對(duì)缺血損傷產(chǎn)生應(yīng)答，并遷移至缺血損傷區(qū)，替代損傷腦組織或分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管與神經(jīng)生成[3]。已有報(bào)道顯示局灶性腦缺血模型移植的神經(jīng)干細(xì)胞可以生存、分化，釋放神經(jīng)遞質(zhì)并與宿主腦組織建立傳入與傳出聯(lián)系，修復(fù)缺血引起的功能缺損[4-5]。但許多研究又同時(shí)證實(shí)NSCs移植后，只有極少數(shù)的細(xì)胞存活，分化為神經(jīng)元的比例又少之又少。Modo M在其研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)造成的缺血模型中不到0.01%損傷神經(jīng)元被移植的NSCs所替代[6]。因此如何應(yīng)用措施更好的提高移植NSCs的成活率，促進(jìn)其遷移至缺血損傷區(qū)并分化為神經(jīng)元，是當(dāng)前急待解決的難題。

HBO用于治療腦缺血再灌注已有報(bào)道，許多研究證實(shí)HBO對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用機(jī)制十分廣泛，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括提高氧分壓，增加血液和組織氧含量，提高氧的彌散率和有效彌散距離，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，改善腦水腫，降低顱內(nèi)壓，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立及病變血管的恢復(fù)，改善腦代謝，恢復(fù)腦功能等作用[7-9]。以往有研究認(rèn)為缺血缺氧性腦損傷后HBO可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并分化為神經(jīng)元[10-11],但對(duì)外源性NSCs在缺血缺氧性腦病的影響國(guó)內(nèi)很少研究。GFP是一種生物發(fā)光蛋白，在藍(lán)光激發(fā)下可穩(wěn)定發(fā)出綠色熒光，研究顯示GFP基因在NSCs中的整合和表達(dá)對(duì)NSCs的基本生物學(xué)特征如形態(tài)、增殖能力和分化潛能沒有明顯影響，并且在移植后的大鼠腦內(nèi)綠色熒光的強(qiáng)表達(dá)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間[12]，因此GFP對(duì)NSCs移植后觀察體內(nèi)分化遷移等方面有獨(dú)到之處。本實(shí)驗(yàn)主要觀察HBO對(duì)GFP重組腺病毒載體感染的NSCs在局灶性腦缺血大鼠腦組織中的遷移情況。

移植后NSCs成活率大部分取決于移植時(shí)間點(diǎn)宿主所處的微環(huán)境[13]。已有報(bào)道提到腦損傷后會(huì)產(chǎn)生局部炎性應(yīng)答，嚴(yán)重影響移植細(xì)胞的生存與分化。腦缺血后宿主的免疫系統(tǒng)被激活，單核細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞遷移到缺血周邊區(qū)，釋放炎性因子[14]。HBO可以有效增加氧的彌散距離，增加組織儲(chǔ)氧量，同時(shí)增加缺氧腦組織的SOD(超氧化物歧化酶)，提高抗氧化能力，清除過(guò)多的氧自由基[15]。這有效改善了缺血損傷區(qū)腦組織的局部微環(huán)境，減少炎性因子的產(chǎn)生，有利于移植細(xì)胞的生存與遷移。本實(shí)驗(yàn)中HBO+NSCs組與NSCs組和Cyy+NSCs組比較，生存并遷移到缺血損傷區(qū)的細(xì)胞明顯增多，這表明HBO可以促進(jìn)移植后的NSCs的遷移。

為了更好的理解HBO促NSCs遷移的機(jī)制，我們分析了海馬caspase-3含量與BDNF和VEGF mRNA的表達(dá)量。caspase-3不僅促進(jìn)腦發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的凋亡，而且還可促進(jìn)各種因素引起的神經(jīng)元的凋亡，是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起著最后樞紐的作用。NSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，其中就包括腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，這些生長(zhǎng)因子在神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)生成和血管生成中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)將NSCs移植入MCAO模型的腦室內(nèi)，14天后BDNF和VEGF含量與對(duì)照組比較顯著增高。本實(shí)驗(yàn)western blot的檢測(cè)結(jié)果中，HBO+NSCs組與NSCs組和Cyy+NSCs組相比海馬caspase-3表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)real time-PCR檢測(cè)海馬BDNF與VEGF mRNA表達(dá)量的結(jié)果中，HBO+NSCs組中海馬BDNF與VEGF的mRNA表達(dá)明顯高于NSCs組和Cyy+NSCs組，這表明HBO促進(jìn)NSCs遷移的原因可能與促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌、抑制新生細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

同時(shí)移植的時(shí)間點(diǎn)與HBO治療的時(shí)間點(diǎn)都是影響移植細(xì)胞存活率的重要因素。楊東波等的研究顯示缺血24 h后移植的細(xì)胞存活率、增殖程度和定向遷移都更加明顯，而這一時(shí)間窗剛好與這些細(xì)胞因子分泌高峰相吻合，因此考慮腦缺血24 h后分泌的營(yíng)養(yǎng)因子和趨化因子較多，可能對(duì)隨后移植細(xì)胞的存活、增殖和遷移有重要的作用。有報(bào)道提示缺血缺氧性腦損傷后24 h HBO治療可顯著促進(jìn)Nestin蛋白的表達(dá)，提示HBO治療可以促進(jìn)內(nèi)源性NSC的增殖，這種作用至少可延長(zhǎng)至腦缺血后24 h。而缺血缺氧性腦損傷后48～72 h正是凋亡與壞死的高峰期，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并釋放炎性介質(zhì),可引起新生 NSC的凋亡或死亡,不利于腦組織的修復(fù)[16]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇再灌注后24 h做為移植時(shí)間點(diǎn)并且移植后盡快行HBO治療，盡可能提高移植細(xì)胞的存活率。

綜上所述，HBO可以更好的促進(jìn)GFP-標(biāo)記的NSCs在MCAO模型大鼠腦組織內(nèi)的遷移，其促遷移機(jī)制可能與HBO可以促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、抑制新生細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。