陳興峰， 王應(yīng)瓊， 陳亞紅， 王茂澤， 陳 山， 許鐵峰， 石慧芳△

(1海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 海南 ?？?570311； 2海南醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所附屬醫(yī)院腫瘤外科， 海南 ?？?570102)

肺癌是世界范圍內(nèi)危害最為嚴重的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。據(jù)2013年的統(tǒng)計結(jié)果顯示，在我國約73.28萬人被確診為肺癌，該病死亡的人數(shù)多達58.07萬人，其中男性的發(fā)病率約為女性的1.5倍[2]。肺癌可分為非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)2種不同的亞型，其中NSCLC占所有肺癌病例的80～85%[3]。NSCLC在發(fā)病早期多不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，被許多患者及家屬忽視從而延誤病情，約65%的病人在確診時已發(fā)展為晚期肺癌或癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。目前，手術(shù)和化療是治療NSCLC常用的方法，隨著臨床治療技術(shù)的不斷改善，患者的總生存時間在一定程度上也有所提高，但預(yù)后效果仍不十分理想，患者5年的生存率低于16%[5-6]。因此，研究NSCLC的發(fā)生機制并提出一種潛在的生物學(xué)靶點將為NSCLC的早期診斷和臨床治療提供新思路。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類超過200個核苷酸長度的不具有蛋白編碼能力的RNA。在早期，lncRNA常被認為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，隨著研究的深入，lncRNA在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白修飾中的功能被廣泛證實。CASC2(cancer susceptibility 2)是位于染色體10q26上的一種lncRNA，最早于2004年在子宮內(nèi)膜癌中被鑒定[7]，可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，進而調(diào)控個體發(fā)育、細胞分化、增殖和遷移等過程[8]。CASC2是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)CASC2的異常低表達，如膠質(zhì)瘤[9]、胃癌[10]、結(jié)腸直腸癌[11]等，但CASC2在NSCLC發(fā)生展中的作用機制還有待深入研究。本研究探討CASC2過表達對NSCLC細胞遷移和侵襲能力的影響，并分析CASC2、微小RNA-18a (micro-RNA-18a,miR-18a)和BTG3(B-cell translocation gene 3)三者的靶向關(guān)系及相互調(diào)控作用。通過分析CASC2在NSCLC細胞中的表達、功能和調(diào)控機制，揭示NSCLC的發(fā)生機制，為該病的臨床診斷提供可靠的生物學(xué)靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚胎腎細胞系293T、人支氣管上皮細胞系16-HBE及人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)和傳代 293T、16-HBE、A549和H1299細胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清(Gibco)和1%青鏈霉素(Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)中，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細胞融合度達85%以上時，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入0.25%的胰蛋白酶(Sigma)消化后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，再加入完全培養(yǎng)基重懸細胞。

2.2細胞轉(zhuǎn)染 CASC2重組過表達質(zhì)粒(pcDNA-CASC2)、CASC2干擾質(zhì)粒(si-CASC2)、miR-18a 模擬物(miR-18a)及陰性對照(miR-NC)、miR-18a抑制劑(anti-miR-18a)及陰性對照(anti-miR-NC)均購自GenePharma。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)后，利用Lipofectmine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)將上述質(zhì)?；蚬押塑账徂D(zhuǎn)染到細胞中，培養(yǎng)48 h后，檢測各指標(biāo)的變化。

2.3RT-qPCR檢測RNA表達 采用TRIzol法提取細胞總RNA，NanoDrop 2000測RNA濃度，分別利用Reverse Transcription System Kit(TaKaRa)和miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia)對lncRNA和miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄；使用2×SYBR Green Master Mix(Invitrogen)在螢光定量PCR儀上測定各lncRNA和mRNA的相對表達水平，分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參照。CASC2的上游引物序列為5′-GCACATTGG ACGGTGTTTCC-3′，下游引物序列為5′-CCCAGTCCTTCACAGGTCAC-3′；BTG3的上游引物序列為5′-GCAGTTGAGAGGTTTGCTGA-3′，下游引物序列為5′-TAACTTTCCTGGAGATCTCATT-3′；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-18a及內(nèi)參照U6的引物由Applied Biosystems合成。

2.4Transwell小室法檢測細胞的侵襲和遷移能力 侵襲實驗開始前，需要在小室內(nèi)膜鋪上EMC膠以模仿細胞外基質(zhì)，而遷移實驗不要加入EMC膠。將質(zhì)?；蚬押塑账徂D(zhuǎn)染至A549細胞中，48 h后用0.25%的胰酶消化細胞，PBS洗滌后加入不含血清的培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×108/L。向Transwell上室內(nèi)加入100 μL的細胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含10%血清的完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，用甲醇固定10 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，選取10個視野并計算每個視野中的平均細胞數(shù)。

2.5雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?使用特異性引物擴增CASC2和BTG3 3′-UTR片段中含miR-18a結(jié)合位點的序列，之后克隆到psiCHECKTM-2報告質(zhì)粒中分別構(gòu)建CASC2-WT和BTG3-WT報告質(zhì)粒。使用點突變試劑盒(TaKaRa)對CASC2-WT和BTG3-WT報告質(zhì)粒上的miR-18a結(jié)合位點進行突變，構(gòu)建CASC2-MUT和BTG3-MUT報告載體。將CASC2和BTG3野生型或突變型報告質(zhì)粒與miR-18a或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，48 h后利用雙螢光素酶報告分析試劑盒檢測各組細胞的螢光素酶活性。

2.6Western blot檢測蛋白表達 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞并加入RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測蛋白含量。取相同含量的蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，之后進行10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，37 ℃、 5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入抗BTG3抗體孵育2 h，再加入相應(yīng) II 抗孵育1.5 h，最后進行ECL化學(xué)發(fā)光顯色，β-actin作為內(nèi)參照，蛋白相對表達量采用ImageJ軟件進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CASC2在NSCLC細胞中的表達和功能分析

采用RT-qPCR檢測NSCLC細胞中CASC2的表達，結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮16-HBE細胞相比，NSCLC細胞系A(chǔ)549和H1299中的CASC2表達水平均顯著降低，其中，A549細胞中CASC2的表達水平最低(P<0.05)，見圖1A，因此，后續(xù)實驗選擇A549細胞為研究對象。為進一步研究CASC2對肺癌細胞遷移和侵襲的影響，我們在A549細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2，并采用RT-qPCR檢測CASC2表達，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，pcDNA-CASC2轉(zhuǎn)染組細胞中CASC2的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1B，由此證實通過轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2可成功構(gòu)建CASC2過表達模型。轉(zhuǎn)染48 h后采用Transwell小室法分析CASC2過表達對細胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，CASC2過表達后NSCLC細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖1C、D。上述結(jié)果表明，CASC2過表達可抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。

Figure 1.The expression of CASC2 in NSCLC cells and its effects on the cell migration and invasion abilities. A: the expression of CASC2 in the NSCLC cell lines; B: the transfection efficiency of CASC2-overexpressing plasmid in A549 cells; C: the effect of CASC2 overexpression on A549 cell migration ability; D: the effect of CASC2 over-expression on A549 cell invasion ability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HEB cells;#P<0.05vspcDNA3.1 group.

圖1 CASC2在NSCLC細胞中的表達及對NSCLC細胞遷移和侵襲的影響

2 CASC2與miR-18a的靶向驗證

本研究利用StarBase軟件預(yù)測與CASC2互補結(jié)合的miRNA，結(jié)果顯示，miR-18a序列中存在與CASC2互補結(jié)合的核苷酸位點，見圖2A。之后采用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步探究CASC2與miR-18a的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-18a過表達顯著抑制了CASC2-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對CASC2-MUT螢光素酶活性無影響(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，敲減miR-18a表達顯著促進了CASC2-WT的螢光素酶活性，但對CASC2-MUT螢光素酶活性無影響,見圖2B、C。由此得知，CASC2能夠通過互補結(jié)合位點與miR-18a發(fā)生相互作用。

Figure 2.The interaction between CASC2 and miR-18a. A: the predicted result of StarBase software; B: the effect of miR-18a over-expression on CASC2 luciferase activity in 293T cells; C: the effect ofmiR-18aknockdown on CASC2 luciferase activity in 293T cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsanti-miR-NC group.

圖2 CASC2與miR-18a的靶向關(guān)系的驗證

3 CASC2靶向miR-18a調(diào)控肺癌細胞的遷移和侵襲能力

在本研究中，我們首先采用RT-qPCR對miR-18a在肺癌細胞中的表達水平進行分析，結(jié)果顯示，與16-HBE細胞相比，A549細胞和H1299細胞中miR-18a的表達水平均顯著升高，其中A549細胞中的miR-18a水平升高最顯著(P<0.05)，見圖3A。之后，采用RT-qPCR法測定CASC2對miR-18a表達的影響，結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，CASC2上調(diào)明顯抑制miR-18a表達(P<0.05)，與si-NC組相比，敲減CASC2表達明顯促進miR-18a表達(P<0.05)，說明CASC2能夠負調(diào)控miR-18a表達，見圖3B。為進一步研究CASC2是否通過抑制miR-18a表達參與肺癌細胞功能的調(diào)控，我們分別在A549細胞中過表達CASC2或共表達CASC2和miR-18a，并采用Transwell小室法測定各組細胞的遷移和侵襲情況，結(jié)果顯示，CASC2過表達抑制了A549細胞的遷移和侵襲能力，而外源回補miR-18a可逆轉(zhuǎn)CASC2對細胞遷移和侵襲的抑制作用(P<0.05),見圖3C、D。由此可知，CASC2通過調(diào)控miR-18a表達抑制A549細胞的遷移和侵襲能力。

4 BTG3與miR-18a的靶向關(guān)系驗證

本研究利用TargetScan軟件對miR-18a的靶基因進行預(yù)測，結(jié)果顯示，BTG3是miR-18a的一個潛在靶基因，見圖4A。之后采用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步探究miR-18a與BTG3的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-18a過表達顯著抑制了BTG3-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對BTG3-MUT螢光素酶活性無影響；與anti-miR-NC組相比，miR-18a敲低顯著促進了BTG3-WT的螢光素酶活性(P<0.05)，但對BTG3-MUT螢光素酶活性無影響，見圖4B、C。由此得知，miR-18a能夠與BTG3發(fā)生靶向結(jié)合。

Figure 3.The regulatory effects of CASC2 on miR-18a expression and functions. A: the expression of miR-18a in the NSCLC cell lines; B: the effect of CASC2 overexpression or knockdown on miR-18a expression in A549 cells; C: the effect of exogenous restoration of miR-18a on CASC2-inhibited A549 cell migration; D: the effect of exogenous restortaion of miR-18a on CASC2-inhibited A549 cell invasion. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HEB cells;#P<0.05vspcDNA3.1 group;△P<0.05vssi-NC group;&P<0.05vspcDNA-CASC2+miR-NC group.

圖3 CASC2對miR-18a表達和功能上的調(diào)控

Figure 4.The interaction between miR-18a and BTG3. A: the predicted result of TargetScan software; B: the effect of miR-18a overexpression on BTG3 luciferase activity in 293T cells; C: the effect ofmiR-18aknockdown on BTG3 luciferase activity in 293T cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsanti-miR-NC group.

圖4 miR-18a與BTG3的靶向關(guān)系驗證

5 CASC2通過miR-18a調(diào)控BTG3的表達

采用Western blot法對BTG3在肺癌細胞中的蛋白表達水平進行分析，結(jié)果顯示，與16-HBE細胞相比，A549細胞和H1299細胞中BTG3的表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5A。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，miR-18a上調(diào)可抑制BTG3-WT螢光素酶活性，而外源回補CASC2逆轉(zhuǎn)了miR-18a對BTG3-WT螢光素酶活性的抑制作用(P<0.05),見圖5B。Western blot分析結(jié)果顯示，CASC2上調(diào)促進了BTG3蛋白表達，而外源回補miR-18a逆轉(zhuǎn)了CASC2對BTG3蛋白表達的促進作用(P<0.05),見圖5C；敲減CASC2表達抑制了BTG3蛋白表達，而外源性抑制miR-18a逆轉(zhuǎn)了敲減CASC2對BTG3蛋白表達的抑制作用(圖5D)。由此說明，CASC2通過與BTG3競爭性結(jié)合miR-18a調(diào)控BTG3蛋白表達，進而影響NSCLC進程。

Figure 5. The interactions among CASC2, miR-18a and BTG3. A: the protein expression of BTG3 in the NSCLC cell lines; B: the effect of CASC2 restoration on miR-18a-inhibited BTG3-WT luciferase activity in 293T cells; C: the effect of miR-18a restoration on CASC2-induced BTG3 protein expression in A549 cells; D: the effect of miR-18a inhibitor (anti-miR-18a) on si-CASC2-repressed BTG3 protein expression in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs16-HBE cells;#P<0.05vsBTG3-WT group;&P<0.05vsBTG3-WT+miR-18a+pcDNA 3.1 group;△P<0.05vspcDNA3.1 group;▲P<0.05vspcDNA-CASC2+miR-NC group;☆P<0.05vssi-NC group;★P<0.05vssi-CASC2+anti-miR-NC group.

圖5 CASC2、miR-18a和BTG3之間的相互調(diào)控分析

討 論

NSCLC是一種嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，近年來，新型細胞毒藥物和靶向生物制劑的開發(fā)在一定程度上改善了NSCLC患者的生存質(zhì)量，但晚期肺癌患者的預(yù)后仍不理想，因此闡明NSCLC的形成和發(fā)展機制，以探索新的臨床治療靶向治療方法，提高患者的生存率仍是目前研究的重點。隨著人類基因組計劃的不斷開展，研究人員發(fā)現(xiàn)在人類基因組中絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雖然不具備編碼蛋白的能力，但仍可參與調(diào)控包括個體發(fā)育、細胞分化、細胞增殖等在內(nèi)的多種生命過程，lncRNA即為其中的一種非編碼RNA[12]。

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA對包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病具有潛在的診斷和治療價值。例如，Zhang等[13]通過研究證實透明細胞腎細胞癌組織中上調(diào)的lncRNA MALAT1與患者的晚期臨床癥狀和不良預(yù)后密切相關(guān)；Zheng等[14]證實在結(jié)腸直腸癌患者組織中，lncRNA MALAT1表達水平顯著升高，升高的MALAT1可導(dǎo)致患者的不良預(yù)后和嚴重的臨床病理特征，且與癌細胞的噬神經(jīng)侵襲密切相關(guān)；lncRNA H19在非小細胞肺癌中的表達明顯升高，且H19表達水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小、血管生成和不良預(yù)后等均密切相關(guān)[15]；lncRNA HMlincRNA717的水平與腫瘤組織學(xué)分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者總生存期具有一定的相關(guān)性[16];外源敲減PVT1表達可抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。以上研究表明，有必要對NSCLC中的lncRNAs進行篩選鑒定，以發(fā)現(xiàn)更多的與腫瘤相關(guān)的lncRNAs，為NSCLC的診斷和治療提供潛在的生物靶點。

CASC2是一種常見的抑癌因子，在多種腫瘤發(fā)生中的作用已被廣泛證實。本研究中，我們通過實驗證實CASC2在NSCLC細胞中出現(xiàn)異常的低表達，且深入的功能研究揭示，外源過表達CASC2可明顯降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。最新的研究表明，在NSCLC患者腫瘤組織中CASC2表達水平顯著下調(diào)，異常表達的CASC2與患者的不良預(yù)后及晚期病理分期密切相關(guān)，且外源過表達CASC2可抑制NSCLC細胞的增殖活性[18]。該研究與我們的結(jié)果一致。近年來，越來越多的證據(jù)表明，lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，在這個網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA主要發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的功能與mRNA競爭性結(jié)合miRNAs，最終參與調(diào)控腫瘤的形成。NSCLC組織和細胞中上調(diào)的lncRNA NEAT1可通過抑制miR-181a-5p促進下游靶基因HMGB1表達的升高，最終誘導(dǎo)NSCLC細胞生長[19]；SNHG1通過與SOX9競爭性結(jié)合miR-101-3p釋放更多的SOX9，進而激活Wnt/β-catenin信號通路，在NSCLC中發(fā)揮促腫瘤形成作用[20]；TP53TG1可通過調(diào)控miR-18a/PTEN通路增強NSCLC細胞對順鉑藥物化療的敏感性[21]。為進一步研究CASC2在調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的作用機制，我們利用生物信息學(xué)分析、雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灪蛁RT-PCR證實CACS2可通過與miR-18a互補結(jié)合抑制miR-18a表達。miR-18a作為一種重要的腫瘤調(diào)控因子在NSCLC中發(fā)揮重要的促腫瘤形成作用[22]。功能回補實驗進一步證實，CACS2可通過下調(diào)miR-18a表達抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。

BTG3基因定位于人染色體21q21.1上，其編碼的蛋白可調(diào)控多種細胞的周期進程和分化，是一種抑制細胞增殖的蛋白，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌重要的作用，如卵巢癌[23]、食管癌[24]和肺癌[25]等。本研究中，我們通過TargetScan生物預(yù)測軟件初步證實BTG3是miR-18a的一個潛在靶基因，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示miR-18a可抑制BTG3-WT螢光素酶活性，但外源回補CASC2可促進BTG3-WT螢光素酶活性。Western blot實驗結(jié)果進一步證實CASC2促進了BTG3蛋白表達，但外源回補miR-18a可抑制BTG3蛋白表達。以上結(jié)果說明，CASC2可通過負調(diào)控miR-18a促進BTG3表達。

綜上所述，在NSCLC中，lncRNA CASC2表達水平明顯降低；CASC2可通過與BTG3競爭性結(jié)合miR-18a發(fā)揮對BTG3蛋白表達的促進作用，進而抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲能力。本研究首次證實CASC2/miR-18a/BTG3網(wǎng)絡(luò)在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用，提示CASC2可能作為臨床治療NSCLC的潛在生物靶點。