□ 司鴻銀 宜賓市糧油質(zhì)量監(jiān)測(cè)站

當(dāng)前糧食檢驗(yàn)中常用的檢測(cè)方法有以下幾種：①薄層色譜法；②膠體金試紙條法；③酶聯(lián)免疫法；④液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用法。不同方法的實(shí)驗(yàn)操作流程和所需實(shí)驗(yàn)器材各不相同，且薄層色譜法的操作手法過于復(fù)雜，一般很少采用，而膠體金法和酶聯(lián)免疫法適用于急速篩查實(shí)驗(yàn)[1]?；诖?，為了獲取準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜方法。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與測(cè)量方法

1.1 儀器與材料

在黃曲霉毒素免疫親和柱的型號(hào)選擇上，選擇國內(nèi)制造經(jīng)驗(yàn)豐富的華安麥科公司。采用美國waters公司生產(chǎn)的超高效液相色譜儀以及英國Whatman公司生產(chǎn)制造的纖維濾紙。除此之外，還采用了由華安麥科公司生產(chǎn)的6位泵流操作架以及梅特勒生產(chǎn)的型號(hào)為ME802的電子分析天平。材料選擇如下：美國Millipore公司專用實(shí)驗(yàn)用超純水，華安麥科公司制備的純度為99%的黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品，美國Fisher公司生產(chǎn)的可在純色譜下進(jìn)行檢驗(yàn)的甲醇。

1.2 分析條件

為了得到精確的檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)分析條件作出如下限制：①色譜柱設(shè)置為C18色譜柱50mm×3mm，1.7 μm，30 ℃；②甲醇和水的配比設(shè)置在45∶55；③流動(dòng)相流速設(shè)置0.3mL/min；④進(jìn)樣本體積設(shè)置為2 μL；⑤色譜柱波長(zhǎng)設(shè)為360nm，Em：440 nm。

1.3 樣品制備方法

首先，將沒有感染黃曲霉菌（AF）的稻谷、小麥、玉米這三種樣品用高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，直到其顆粒小于0.5mm時(shí)進(jìn)行過篩稱重。各取得質(zhì)量等于25.0g的樣品，將其放入容量等于250mL的三角瓶中，加入黃曲霉素混合溶液，使得稻谷、小麥、玉米中的AFB的含量等于51g和20g，保障霉菌毒素的濃度配比等于B1∶B2∶G1∶G2為4∶1∶4∶1，將其避光保存，溫度設(shè) 置為室溫。然后，對(duì)過夜儲(chǔ)存后的小麥等谷物樣品注入水比濃度為80∶2的氯 化鈉和甲醇溶液，將混合有該溶液的樣品放置在高速均質(zhì)器中3～5 min后提取2 mL，然后用定量濾紙和玻璃纖維濾紙進(jìn)行過濾，直到溶液變清，等待下一步凈化。最后，將黃曲霉素免疫親和柱和直徑為10 mL的玻璃注射器連接，用玻璃注射器迅速滴取2 mL之前經(jīng)過過濾的混合液，然后將空氣壓力泵和玻璃注射器相連接，確保混合液可以以每秒1滴的速度進(jìn)入免疫親和柱內(nèi)，此時(shí)要確保柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中[2]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

在背景溶液的選擇上，采取流動(dòng)相，需用熒光檢測(cè)器對(duì)黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)液以190～600 nm進(jìn)行掃描，掃描后得出以下結(jié)果：①AFB140．0g/L；②AFB210．0g/L；③AFG140．0g/L；④AFG210．0g/L。由此結(jié)果可知，標(biāo)號(hào)為B1和G1的黃曲霉毒素經(jīng)過超高效液相色譜測(cè)試后，所反映出來的熒光信號(hào)較為明顯，所以這兩類黃曲霉素菌需要經(jīng)過精密實(shí)驗(yàn)也可以進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度較高，和普通液相檢測(cè)體系存在差異。導(dǎo)致這類差異產(chǎn)生主要原因在于超高效液相色譜測(cè)試系統(tǒng)中對(duì)樣品顆粒大小有著嚴(yán)苛的要求，樣品顆粒越小，其柱效以及色譜峰寬也就越明顯，這樣一方面可以保障實(shí)驗(yàn)樣品的分離度，另一方面也可以提高樣品的靈敏度。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

黃曲霉毒素作為一種極性化合物，其流動(dòng)相多采用水基溶液，一般多采用甲醇與水，乙腈與水這兩種溶液作為備選溶液參與實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過對(duì)色譜分離效果的檢驗(yàn)。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可知，流動(dòng)相優(yōu)化后的保留時(shí)間可以長(zhǎng)達(dá)6 min，改時(shí)間正好和黃曲霉素的出峰時(shí)間相對(duì)應(yīng)。此時(shí)可以計(jì)算出每消耗一個(gè)樣品所需的甲醇量，計(jì)算公式如下：0.2 mL/min（流速）×3 min（保留時(shí)間）×0．4（有機(jī)溶劑配比）=0．336 mL。目前常用液相色譜方法的流動(dòng)相通常為乙腈、甲醇和水，配比分別為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶27∶65，20∶30∶60或20∶30∶50，流速為0．8～1 mL/min，最后出峰的時(shí)間為3 min或更長(zhǎng)，測(cè)1個(gè)樣品需6．9～11．6 mL有機(jī)相（甲醇和乙腈），與之相比，本方法有機(jī)溶劑用量大大減少，更為環(huán)保。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

經(jīng)過以上色譜條件可檢測(cè)出AFB1、AFG1、AFB2和 AFG2的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)置超高效液相色譜的峰面積為縱坐標(biāo)，用y表示，其質(zhì)量為橫坐標(biāo)用x表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同理，根據(jù)該曲線可以得出3倍信噪比的峰響應(yīng)值，根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值，得出線性范圍的下限，結(jié)果見表1。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程及檢出限

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本文用超高液相色譜該方法，分析來自不同地區(qū)的30種糧食樣品（大米、小麥、玉米）的黃曲霉毒素，并且僅一種玉米樣品被污染。AFB1含量為0.4 ng/g，AFB2含量為0.922 ng/g。高通量和低溶劑檢測(cè)樣品，適用于快速定量測(cè)定食品中的黃曲霉毒素。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限確定為0.15、0.05、0.40、0 .06 pg，黃曲霉毒素在0.4～60.0 pg，0.2～15.0 pg，1.5～60.0 pg和0.2～15.0 pg的范圍是線性相關(guān)的，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9；0.999 9；0.999 8和0.999 2；小麥、玉米和大米加標(biāo)樣品的回收率為77.4%～104.2%，精 密 度為 1.8%～8.9%。該方法還可用于谷物中四種黃曲霉毒素的測(cè)定，無需衍生化，適用于食品中黃曲霉毒素的快速定量測(cè)定。

4 結(jié)語

經(jīng)過上述精密的實(shí)驗(yàn)和分析，最終得出采用超高效液相色譜可以在無需衍生的條件下測(cè)量糧食中的黃曲霉素含量，這一方法無疑是食品檢驗(yàn)界的一大進(jìn)步，一方面突破了原有的技術(shù)壁壘，另一方面也為食品安全提供了保障。