余國政 柯立池 張麗君 周靜 胡如進(jìn) 夏林 楊璐

[1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)普外科；2.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)腫瘤科，湖北 黃石 435000；3.咸寧市中心醫(yī)院(湖北科技學(xué)院附屬醫(yī)院)手術(shù)室，湖北 咸寧 437000]

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見惡性腫瘤之一，全球每年的肝癌新發(fā)病例數(shù)為74.8萬，死亡例數(shù)為69.6萬[1-2]，在所有癌癥導(dǎo)致的死亡中肝癌居第3位[3-4]，且發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)不斷上升[5-6]。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是引發(fā)肝纖維化和肝細(xì)胞癌的首要原因[7]。中國是世界肝癌第一大國，肝癌的發(fā)生與HBV 感染關(guān)系密切。KAI1基因是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其表達(dá)缺失與人類許多上皮細(xì)胞惡化、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]，而在肝癌組織中的表達(dá)水平與HBV的關(guān)系尚未見報(bào)道，HBV是否通過影響KAI1的表達(dá)來調(diào)控肝癌發(fā)生與進(jìn)展尚缺乏研究資料。本實(shí)驗(yàn)通過檢測肝癌組織中KAI1的表達(dá)差異，及體外實(shí)驗(yàn)檢測HBV與KAI1的相關(guān)性來初步探討HBV 感染與KAI1表達(dá)在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 收集黃石市中心醫(yī)院普外科及腫瘤科2015年1月1日至2017年12月31日肝癌患者術(shù)后新鮮組織標(biāo)本癌及對應(yīng)癌旁組織27對。所有標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)確診為肝癌，臨床資料完整，且27例肝癌患者均為HBV陽性感染者。

1.2細(xì)胞、質(zhì)粒與主要試劑 HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，重組質(zhì)粒pCMV-HBV 1.3倍體、啟動子pGL3-KAI1及相應(yīng)對照pCMV-pblue、pGL3-flag-2b為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。其中啟動子pGL3-KAI1長度為轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)上游1870bp，經(jīng)證實(shí)為KAI1全長啟動子。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司，相關(guān)試劑盒購自Qiagen公司，Lipo2000、定熒光素酶活性所需的試劑及抗體和酶均購自Sigam公司，引物由擎科合成。

1.3方法

1.3.1癌及癌旁組織中KAI1的mRNA和蛋白水平檢測 將27對組織分別勻槳，分成兩部分，一部分用RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford法檢測其濃度，取100 μg總蛋白進(jìn)行電泳，10% SDS-PAGE中電泳完畢后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗人多克隆抗體，1∶ 2 000)，4 ℃過夜；洗膜，再加入二抗(羊抗兔IgG-HRP，1∶5000)孵育1 h，洗膜后進(jìn)行ECL顯色。利用相關(guān)圖像分析軟件掃描分析條帶的灰度值。另一部分用Trizol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行real-time PCR。引物：Kai1上游引物5c-AGGATGCCTGGGACTACGTG-3c，下游引物5c-GCTCAGCGTTGTCTGTCCAGT-3c；GAPDH上游引物5c-TCGTGCGTGACATTAGGAG-3c，下游引物5c-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3c。擴(kuò)增條件：94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，40 個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.2熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 培養(yǎng)細(xì)胞，將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，均勻鋪到24孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，根據(jù)Lipo2000說明書要求共同瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-HBV 1.3倍體+啟動子pGL3-KAI1及對照pCMV-pblue+pGL3-flag-2b，各設(shè)三個復(fù)孔。送入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收樣，裂解。測定luciferase活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3測定KAI1啟動子甲基化實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，均勻鋪到6孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞達(dá)到70%左右，根據(jù)Lipo2000說明書要求瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-HBV 1.3及對照pCMV-pblue，送入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收樣，提取基因組。送博淼生物科技(北京)有限公司檢測KAI1啟動甲基化情況。另將KAI1啟動子報(bào)告質(zhì)粒與HBV 1.3倍體共轉(zhuǎn)，6 h后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μM 、2 μM、4 μM的甲基化抑制劑5-aza_CdR。37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)48 h，分別用熒光素酶活性檢測、real-time PCR 和Western blot檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4體外實(shí)驗(yàn)檢測HBV與KAI1的關(guān)系 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，均勻鋪到6孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時細(xì)胞達(dá)到70%左右，根據(jù)Lipo2000說明書要求瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-HBV 1.3倍體及對照pCMV-pblue，送入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收樣。分成兩部分，一部分用于檢測蛋白水平，另一部分用于檢測mRNA水平，方法及試劑同1.3.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05，Ρ<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

27對癌及癌旁組織除三對未檢測出KAI1表達(dá)外，其余24對中癌組織的mRNA水平和蛋白水平均明顯低于癌旁組織的表達(dá)(P<0.05)。見圖1。

圖1 KAI1在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中測得luciferase活性值，pCMV-HBV 1.3倍體明顯低于對照組(P<0.01)。見圖2。

圖2 HBV對KAI1啟動子的影響

將HepG2+HBV及對照HepG2+Pblue的基因組送檢測發(fā)現(xiàn)HepG2+HBV基因組的KAI1啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化，且加入甲基化抑制劑5-aza_CdR后，KAI1啟動子的mRNA和蛋白質(zhì)水平隨著甲基化抑制劑濃度的增加而升高。見圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)組HepG2+HBV和對照組HepG2+Pblue中KAI1啟動子的整體甲基化水平

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了HBV的實(shí)驗(yàn)組中的KAI1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)。提示HBV可以影響KAI1的表達(dá)水平，可能是通過HBV對KAI1啟動子甲基化實(shí)現(xiàn)的。見圖4。

圖4 體外實(shí)驗(yàn)KAI1的mRNA表達(dá)

3 討 論

KAI1 基因是1995 年Dong 等[10]發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，首先發(fā)現(xiàn)于前列腺癌細(xì)胞中，后經(jīng)研究證實(shí)，在多種腫瘤中均伴有KAI1的表達(dá)下降或缺失。目前認(rèn)為KAI1對絕大多數(shù)腫瘤的轉(zhuǎn)移起抑制作用，與腫瘤的侵襲力、預(yù)后明顯相關(guān)[11-13]。KAI1表達(dá)下調(diào)或缺失可能是導(dǎo)致肝癌的重要因素之一，但其具體機(jī)制尚待研究。

DNA 甲基化是真核生物遺傳物質(zhì)化學(xué)修飾的一種方式，甲基化是由DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化完成的，在正常細(xì)胞中某些基因的重復(fù)序列處于高甲基化水平，這樣可以防止被轉(zhuǎn)錄因子的重新活化從而維持基因組的穩(wěn)定[14-16]。如果體細(xì)胞的正常甲基化發(fā)生改變(基因組整體低甲基化)，將導(dǎo)致細(xì)胞生長失控；特異位點(diǎn)甲基化程度改變(抑癌基因啟動子區(qū)CpG 島的過甲基化)則可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本課題中KAI1 及HBV的影響明顯發(fā)生了甲基化，這種變化是腫瘤細(xì)胞的一種表觀遺傳特征，幾乎涉及所有類型的腫瘤[17-19]。惡性腫瘤中有很多關(guān)鍵基因啟動子區(qū)(如參與DNA 修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、耐藥性形成及腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成的基因)存在高甲基化狀態(tài)，這可能是腫瘤的特征之一。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，某些病毒可引起抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化干擾抑癌基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，引起細(xì)胞的癌變[20]。由于DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問題，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。

肝癌是常見的原發(fā)腫瘤，具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，死亡率高，預(yù)后差等特點(diǎn)[21].，且研究發(fā)現(xiàn)80%的肝癌與HBV感染有關(guān)[22-23]。所以了解和發(fā)現(xiàn)肝癌早期診斷的特異性生物學(xué)標(biāo)志物以及尋找肝癌治療的新靶點(diǎn)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過檢測KAI1在肝癌原發(fā)灶中的表達(dá)，分析其臨床特征，推測KAI1的異常表達(dá)可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展， 而HBV可能通過甲基化KAI1啟動子區(qū)抑制KAI1基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了肝癌發(fā)生發(fā)展。