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        miR-143在肝臟組織中的表達及調控機制

        2019-09-21 08:58:48劉永慶王成宏童鐘
        貴州醫(yī)藥 2019年8期
        關鍵詞:孔板細胞株靶向

        劉永慶 王成宏 童鐘

        (合肥市第一人民醫(yī)院肝膽外科,安徽 合肥 230601)

        肝癌是世界范圍內高發(fā)生率(第五)高死亡率(第三)的癌癥之一[1-2]。肝炎病毒的感染是肝癌發(fā)生的主要因素(約占80%)3。其他因素,如酒精攝入,肥胖,肝硬化,吸煙甚至是糖尿病皆是肝癌發(fā)生的誘導因[4-8]。此外,基因突變及染色體異常也在肝癌發(fā)生發(fā)展中占據(jù)主導地位[9-12]。微小RNA作為一種小的非編碼核糖核酸可以通過堿基互補配對與靶基因結合,進而沉默靶RNA或者抑制RNA轉錄后表達[13]。其中miR-143參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討miR-143在肝癌組織中的表達情況,以及進一步敲低miR-143后,通過調節(jié)SHP2-ERK1/2信號通路來升高肝癌細胞中肝細胞的比例,從而加重肝癌細胞的惡性程度的調控機制。

        1 材料與方法

        1.1材料 20例肝癌組織樣本以及正常的20份肝組織來源于安徽省合肥市濱湖醫(yī)院,所有涉及人類參與者的操作程序都符合合肥市濱湖醫(yī)院倫理委員會要求,且皆獲得參與此研究涉及的個體的知情同意。人類肝癌細胞HepG2和正常人肝上皮細胞HL02購于美國ATCC細胞庫,人肝癌細胞系SMMC-7702細胞系購于上?;鄯f生物科技有限公司。miRNA-143的相關引物購于invitrogen公司。肝癌組織以及肝癌細胞的miRNA提取是通過大連Takara公司的miRvana miRNA 試劑盒。miR-143 inhibitor以及miR-143-mimic購買于上海漢恒公司。Transwell 小室購于康寧公司。流式抗體CD133-APC購于BD pharmingen公司,乙醛脫氫酶活性檢測試劑盒購于北京索萊寶有限公司。

        1.2方法

        1.2.1細胞培養(yǎng) HepG2,HL02以及SMMC-7702細胞皆采用相同的細胞培養(yǎng)方式進行無菌培養(yǎng),即細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM加10%的胎牛血清和1%的雙抗(青霉素與鏈霉素)。所有的細胞培養(yǎng)試劑皆購買于美國Gibco公司。此外,所有的細胞皆培養(yǎng)于無菌細胞培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)。

        1.2.2RNA提取及實時熒光定量PCR實驗 采用miRvana miRNA試劑盒提取細胞的總的miRNA。miR-143的檢測采用大連Takara公司的primescript RT reagent試劑盒。細胞或組織中的miRNA提取方法具體如下:1、裂解組織。采用1ml RNA reagent裂解細胞或組織,將勻漿置于室溫2-3分鐘,接著加入氯仿,震蕩15秒,之后冰浴10分鐘。冰浴后4攝氏度離心15分鐘,取上層水相為RNA。2、去除RNA。將RNA轉移至新的離心管中,加入2 mL RNA mini column中,室溫離心30-60秒(1000g)。3、miRNA的分離純化。加入十分之九的無水乙醇至離心管中,渦旋混勻,加入 RNA mini column中并加入吸附柱中,棄除流出液。最后加入500ulRWB wash buffer,離心30~60秒。最終洗脫miRNA,室溫靜置5分鐘,13000g離心一分鐘。將獲取的miRNA逆轉錄產(chǎn)物加入qRT-PCR反應所需試劑進行PCR反應。GAPDH用來作為內參。GAPDH前引物序列為:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,后引物序列為:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’;miR-143前引物序列為:5’.GCGGCGGTGAGATGAAGCACTG-3’,后引物序列為:5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。

        1.2.3細胞慢病毒感染實驗 miR-143的siRNA(si-miR-143)及其陰性對照(si-NC),miR143的過表達質粒皆購買于上海漢恒生物科技有限公司。這些載體質粒的感染實驗是采用脂質體2000試劑盒進行,具體操作如下1)鋪板:感染前一天將HepG2和SMMC-7721細胞各按3×104cell/孔的密度接種于24孔板中,并分組為Lv-hsa-miR-143 NC,Lv-hsa-miR-143 mimics,Lv-hsa-miR-143 inhibitor,每組設3個副孔,保證第二天感染時其細胞密度達到50%左右。(2)稀釋試劑:轉染前用DMEM培養(yǎng)基稀釋Polybrene(10 mg/mL),按1∶200稀釋,使其濃度為50 μg/mL,配制感染體系時終濃度為5 μg/mL,即為 Polybrene(M)。病毒滴度為1×107TU/mL。(3)感染前換液:感染前8 h換成新配DMEM完全培養(yǎng)基。(4)感染:每組將1 200 μL細胞懸液、150 μL virus稀釋液、150 μL Polybrene(M)混合在一起,配成1 500 μL培養(yǎng)體系,按分組加入相應的病毒混合液進行細胞感染。(5)感染后換液:感染后8~12 h更換DMEM完全培養(yǎng)基。(6)觀察熒光強度。(7)細胞篩選:1)稀釋嘌呤霉素:將25 mg的嘌呤霉素粉末離心至管底,然后加入1 mL高壓滅菌過的超純水,使其濃度為25 mg/mL,置于-20 ℃冰箱保存。2)鋪板:將待篩選細胞種植在24孔板里培養(yǎng),使細胞密度為70%左右。3)篩選藥物濃度:待細胞貼壁后,在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素,設置不同的濃度梯度進行篩選,24~48 h觀察細胞狀態(tài),最終得出HepG2細胞加入嘌呤霉素后最低致死濃度為2 μg/mL,而SMMC-7721細胞最低致死濃度為1.5 μg/mL。4)換液時加入嘌呤霉素。(8)建立穩(wěn)定細胞株:待所有細胞均有熒光表達時即可停止篩選,擴大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達目的基因的細胞株。

        1.2.4細胞行為學實驗 采用平板克隆實驗檢測細胞的增殖能力,即收集細胞,每個孔中種500個細胞(6孔板),加入2 mL完全培養(yǎng)基,放于孵箱中培養(yǎng)14天。用PBS清洗6孔板,晾干后加入0.1%結晶紫染色1小時左右,清洗并拍照。采用細胞遷移實驗檢測細胞的遷移能力。具體方法如下:就是在6孔板中種3×105個細胞,加入5 00 μL完全培養(yǎng)基。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時,清洗染色,并拍照。細胞侵襲實驗首先要將基質膠均勻鋪于24孔板中,加入3×104個細胞,并加入500 μL完全培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時左右,清洗培養(yǎng)皿并拍照。

        1.2.5熒光素酶報告實驗 實驗前一天取一塊96孔進行鋪板, 不同處理的細胞按1×104個/孔種細胞,加入75 μL DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。第二天將設計的miR-143與SHP2的不同質粒(突變與未突變)進行共轉染。1.按照polyplus說明書操作。每個位點分三組,每組劑量實驗設置三個復孔,計算每組共需的試劑總量,配制好后加入到每個實驗孔中。5 μL buffer +200 ng DNA +0.3 μL reagent +培養(yǎng)基=75 μL體系,最后每孔平均加入7 μL轉染體系。轉染后放入培養(yǎng)箱48 h后取出;最后通過多功能酶標儀測其熒光值。計算螢火蟲/海腎比值,計算相關性分析數(shù)據(jù)。

        1.2.6流式細胞實CD133陽性的腫瘤干細胞的定量本采用流式細胞術來測定。先收集不同處理的肝癌細胞,測定總細胞數(shù),取1×106個細胞(用含10%FCS,1%疊氮化鈉的冰冷PBS重懸)。向每根離心管中添加100ul細胞懸液。按照1:200的比例添加一抗(CD133,Thermo,兔來源),室溫孵育40分鐘。離心洗滌后再加熒光二抗進行孵育(室溫30分鐘),離心洗滌后上機檢測。

        1.2.7乙醛脫氫酶活性檢測實驗 采用乙醛脫氫酶活性檢測實驗用來檢測肝癌細胞的干性。本實驗將采用細胞數(shù)量(1×104個):提取液體積(mL)為 500~1 000:1 的比例(建議 500 萬細胞加 入 1 mL 提取液),接著通過冰浴超聲波法破碎細胞(功率 300 w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3 min);然后 10 000 g, 4 ℃,離心 20 min,取上清置于冰上待測。紫外分光光度計/酶標儀預熱 30 min 以上,調節(jié)波長至 340 nm,蒸餾水調零。 將試劑一 37 ℃(哺乳動物)預熱 15 min。最后按照蛋白濃度計算其酶活性值。

        1.2.8細胞總蛋白提取及western blot實驗 將孔板或細胞培養(yǎng)皿置于冰上,用1ml槍頭吸出培養(yǎng)基,用預冷的PBS溶液洗滌細胞2遍。于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中加入已溶解過蛋白酶抑制劑的細胞裂解液,充分混勻,放置 4度搖床或冰上快速搖晃15~20 min使裂解液浸入到所有細胞起到充分裂解細胞的作用。如果檢測的目的蛋白未磷酸化蛋白在裂解液中還應加入磷酸酶抑制劑(細胞裂解液:磷酸酶抑制劑=100:1)。用細胞刮刮取細胞,吸取細胞碎片和裂解液的混合液至1.5 mL EP管中,4 ℃離心 12 000 rpm 20 min,將蛋白上清吸出轉移至新的 1.5 mL EP 中并標記,也可將細胞消化后收集沉淀并用PBS清洗一遍后加入蛋白裂解液進行后續(xù)實驗。最后,將相同量的蛋白加入進行丙烯酰胺膠中進行電泳,然后繼續(xù)轉膜,將PVDF膜放入1%的脫脂牛奶中封閉1個小時。之后,加入一抗,放入4℃冰箱進行過夜孵育。第二天先洗膜,再加入二抗孵育1.5小時。洗滌后通過ECL試劑盒進行顯影。

        1.3統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件的t檢驗分析,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1miR-143在肝癌組織及細胞系中呈低表達趨勢 miR-143在肝癌組織中呈低表達趨勢(P<0.01)。見圖1A。miR-143在肝癌細胞中的表達水平顯著低于正常肝細胞,且miR-143在SMMC-7721細胞中的表達水平是顯著高于HepG2。見圖1B。

        注:A.qRT-PCR用來檢測miR-143在肝癌組織與正常組織中的表達水平;B.qRT-PCR用來檢測肝癌細胞株與正常肝細胞中miR-143的表達。

        圖1miR-143在肝癌組織及細胞中的表達

        2.2miR-143的敲低對肝癌細胞惡性增殖的影響 MiR-143的高表達能夠抑制肝癌細胞的增殖(圖2A-C),但是并不影響其轉移以及侵襲能力。miR-143的敲低能夠促進肝癌細胞的增殖能力而并不影響其轉移以及侵襲能力(圖2A-C)。

        注:A.克隆形成,transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl實驗分別用來檢測miR-143過表達對肝癌細胞克隆形成能力,遷移和侵襲的影響;B.克隆形成,transwell without matrigenl以及transwell with matrigenl實驗分別用來檢測miR-143低表達對肝癌細胞克隆形成能力,遷移和侵襲的影響;C.雙尾的學生T檢驗用來對miR-143高低表達對肝癌細胞惡性生物學行為的影響進行統(tǒng)計學分析。

        圖2miR-143的敲低對肝癌細胞增殖能力的影響

        2.3miR-143的敲低對肝癌細胞中的干細胞比例的影響 miR-143的敲低可以顯著提高SMMC-7721細胞株中CD133+干性樣細胞的比例。與之相反,miR-143的抬高,能夠顯著下調CD133+的干細胞比例。miR-143的敲低能夠促進肝癌細胞乙醇脫氫酶的活性,反之則會抑制乙醇脫氫酶的活性。見圖3。

        注:A.流式分析用來檢測miR-143高低表達的肝癌細胞株中CD133陽性的腫瘤干細胞比例;B.ALDH活性實驗用來檢測miR-143高低表達的肝癌細胞株中ALDH的活性。

        圖3miR-143的敲低對肝癌細胞中干細胞比例的影響

        2.4miR-143靶向SHP2調節(jié)ERK磷酸化 為了驗證miR-143與SHP2之間的關系,我們通過western blot檢測了miR-143高表達的肝癌細胞中SHP2的表達,結果表明,miR-143的敲低能夠升高SHP2的蛋白表達(圖4C),反之也成立。采用雙熒光素酶報告實驗證實了miR-143與SHP2的靶向關系。并且,我們還檢測了SHP2下游的ERK1/2信號通路,結果顯示,miR-143能夠調控SHP2/ERK1/2信號通路的活化。見圖4。

        注:A.targetscan數(shù)據(jù)庫用來分析miR-143的靶基因;B.雙熒光素酶報告基因實驗用來分析miR-143與SHP2相互作用;C.western blot用來檢測miR-143高低表達的肝癌細胞株中SHP2以及其下游的ERK磷酸化情況。

        圖4miR-143與SHP2的靶向關系

        3 討 論

        miRNA是一類小的非編碼RNA,它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的多種信號通路中都扮演著重要的角色[14]。也就是說,miRNA可以靶向于腫瘤相關基因,促進或者是抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有示miR-143在肝細胞癌中呈低表達趨勢,且在外周血中也是相同趨勢[15]。這就表明miR-143很可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。為了探究miR-143的表達及其機制。本研究選取20例肝細胞癌癥患者(此類患者皆未接受放射,化療以及靶向藥治療)進一步驗證miR-143表達,結果表明miR-143在肝癌患者中的確呈現(xiàn)低表達趨勢,不管是組織抑或是細胞水平。為了進一步探究miR-143在肝癌細胞中的作用。我們在miR-143高低表達的細胞株中相應地敲低或者抬高其表達來驗證miR-143在肝癌細胞惡性生物學行為中的作用。很有意思的是,miR-143的差異表達并不會影響其轉移及侵襲能力,反而會增強其增殖,克隆形成能力。由此我們假設,miR-143是否會影響其細胞干性。通過檢測CD133陽性細胞的比例,結果表明CD133陽性的細胞比例明顯上升,并且乙醛脫氫酶活性驗證了miR-143的敲低會升高肝癌細胞的干細胞比例。事實上,已經(jīng)有相當數(shù)量的報道提示miR-143與腫瘤的侵襲轉移密切相關[16-17]。而腫瘤的侵襲與轉移與腫瘤干細胞緊密相連。大多數(shù)腫瘤的治療往往歷經(jīng)較差預后,這與腫瘤細胞已經(jīng)轉移,手術清掃不干凈,靶向藥藥效有限等等密切相關。其中腫瘤干細胞理論引起領域內學者廣泛關注。理論上來說,腫瘤細胞(尤其是上皮樣細胞)可以通過上皮間質樣轉化,改變腫瘤細胞的極性,可塑性[18]。重編程的腫瘤細胞能夠適應更加惡劣的環(huán)境(例如化療,放療甚至是靶向藥治療),作為一類種子細胞,待時機成熟,進行定居,歸巢,進而惡性增殖[19]。為了進一步探究miR-143是如何影響腫瘤干細胞的比例。本研究通過生物信息學軟件預測其靶基因,其中,SHP2因其在肝癌中的高表達以及其與腫瘤干細胞關系密切引起我們的注意。熒光素酶報告基因實驗也驗證了miR-143與SHP2的確相互作用。接下來我們又驗證了SHP2下游的ERK信號通路的活化情況。結果同樣表明EKR的磷酸化與miR-143的低表達呈現(xiàn)負相關調控關系。以上結果均揭示了miR-143-SHP2-ERK信號通路調控了肝癌干細胞的比例。

        綜上所述,此研究揭示了miR-143低表達影響肝癌惡性程度的機制,為肝癌的基礎研究,尤其是肝癌干細胞的研究提供一個新的視野。更為重要的是,此研究也為肝癌的臨床研究添加一個新的治療靶點。

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