陳 照 李培征 劉惠芳 李秀芳 劉文波③ 秦春秀③

(1?？谑行阌^(qū)農(nóng)林局 海南?？?70100;2海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?70228)

芽孢桿菌（Baci l lussp.）是人們熟知的一類重要的生防微生物，在自然界分布廣泛，具有生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、較強(qiáng)的耐熱性和抗逆性、在植物表面易于存活與繁殖等特性［1]。芽孢桿菌代謝產(chǎn)物較為豐富，如脂肽類、多糖、磷脂類、聚酮類、多烯類物質(zhì)等［2]，部分菌株還可以分解土壤中的不溶性磷酸鹽；對人畜無害，不污染環(huán)境，作為生防菌，具有施用方便，能為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供幫助［3]；一些種類的芽孢桿菌不僅有防病作用，還能促進(jìn)植物增產(chǎn)，也可以改善植物根際周圍環(huán)境，刺激和調(diào)控植物生長，抑制植物的病害發(fā)生［4]，包括根部病害、枝干病害、一些植物的立枯病菌、黃萎病菌、炭疽病菌等［5]。

解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）與枯草芽孢桿菌（B.subt i l is）是兩類重要的生防細(xì)菌，親緣性很高［6]，許多表型特征非常相似，僅通過形態(tài)、培養(yǎng)特征及其生理生化很難區(qū)分，只有通過進(jìn)一步基因序列比較才能將兩者區(qū)分開來［7]。解淀粉芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌；有大于菌體的次末端芽孢；芽孢卵圓型，孢囊膨大；最適生長溫度為28～30℃，最適生長pH為6.5～7.0。它具有還原硝酸鹽；水解淀粉；可利用D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，D-木糖作為碳源；接觸酶陽性；氧化酶陰性等生理生化性質(zhì)［8]。

B.amyloliquefaciensHAB-9菌株是從海南省儋州市兩院檳榔土中分離篩選得到，室內(nèi)研究表明，其對檳榔炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等17株植物病原真菌均具有拮抗活性。本文對它進(jìn)行16S rDNA鑒定，并對其生化特征測定及抑菌譜進(jìn)行研究，為實(shí)現(xiàn)該生防細(xì)菌的抑菌機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細(xì)菌、真菌

供試細(xì)菌：HAB-9，從檳榔樹根際土壤中分離保存。

供試真菌：所有菌株均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，并經(jīng)單孢分離純化后備用，見表1。

表1 供試植物病原真菌

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂16 g，蒸餾水定容至1 000mL，pH7，121℃蒸氣滅菌20min。

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16 g，蒸餾水定容至1 000mL，121℃蒸氣滅菌20min。

M.R、V-P測定培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1 000mL，pH 7～7.2，每管分裝4～5 mL，然后在115℃蒸氣滅菌30min。

解淀粉培養(yǎng)基：在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉，蒸餾水定容至1 000mL，分裝三角瓶，121℃蒸氣滅菌20min，倒平板備用。

1.1.3 主要儀器

滅菌鍋（HVE-50），電子天平（OHA），顯微鏡（OLYMPUS），恒溫?fù)u床 （Innova4230），移液槍（eppendor f），制冰機(jī) （SANYO），恒溫水浴鍋（Polscience）， HH-B11恒溫培養(yǎng)箱，PCR儀（eppendor f），分光光度計(jì)（penk），凝膠成像系統(tǒng)（北京六一），電泳儀（北京君意），微波爐（格蘭仕）等。

1.2 方法

1.2.1 生防細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

從劃線培養(yǎng)的平板上挑取HAB-9單菌落接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng) 過 夜 。 27F： 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由深圳華大基因股份有限公司合成。反應(yīng)體系：25μL體系中含有10×PCRbuf fer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，27F 1.0 μL，1492R 1.0 μL，菌液1.0μL，Trans Taq酶 0.2μL，ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃ 10min［9]；PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳膠回收后，連接到pMDTM18-TVector載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α。篩選陽性克隆送上海生工基因股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 HAB-9菌株的生化特征測定

進(jìn)行M.R測定、V-P測定、淀粉水解、氧化酶測定、接觸酶測定等［10]，并對其進(jìn)行革蘭氏染色［11]。

1.2.3 HAB-9菌株對植物病原真菌的拮抗作用

采用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行生防菌對多種病原真菌的拮抗作用測定。在PDA培養(yǎng)基中心接種直徑4.0mm的病原真菌的菌餅，在距中心25.00mm的成正方形的4個點(diǎn)分別接種待測菌株，各處理4個重復(fù)，置于28℃黑暗培養(yǎng)，待對照組病原真菌長滿整皿后，觀察處理組有無抑菌圈及抑菌圈的大小，分別測定處理組及對照組的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑制率=

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)4次，數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS19.0和SAS9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HAB-9菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.1.1 PCR產(chǎn)物回收

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約為1 500 bp大小的片段PCR電泳產(chǎn)物及回收（圖1）。

圖1 HAB-9菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.1.2 轉(zhuǎn)化子的菌落PCR檢測

隨機(jī)挑取5個白色菌落培養(yǎng)菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所挑選的轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增得到1 500 bp左右的條帶，為陽性克?。▓D2）。

2.1.3 序列分析

挑選陽性克隆，送往深圳華大基因公司測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。經(jīng)NCBI的Blast搜索16SrDNA進(jìn)行比對，并通過DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示HAB-9為解淀粉芽孢桿菌，與其遺傳距離最近的登錄號為AB813716.1。

圖2 HAB-9菌株ITS結(jié)果PCR

2.2 HAB-9菌株的生理生化測定

2.2.1 革蘭氏染色

由圖4可知，HAB-9菌株革蘭氏染色為深紫色，呈陽性。

2.2.2 M.R測定及V-P測定

由圖5可知，M.R測定，HAB-9菌株呈陰性；V-P測定，HAB-9菌株呈陽性。

2.2.3 氧化酶及接觸酶測定

HAB-9菌株氧化酶測定均呈陰性，接觸酶測定呈陽性。

2.2.4 淀粉水解

由圖6可知，解淀粉測定，HAB-9中間均形成明顯的透明圈，有解淀粉功能。

2.3 HAB-9菌株的抑菌作用測定

采用平板對峙法培養(yǎng)后，經(jīng)后期統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果如下：HAB-9菌株對17種植物病原真菌的抑菌作用見圖7，通過計(jì)算HAB-9菌株對各真菌的平均抑制率。進(jìn)行比較（表2），表明HAB-9菌株對17種病原真菌的抑菌率存在差異，主要對炭疽病菌有很好的抑菌效果。

圖3 HAB-9菌株16srDNA比對及進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

對解淀粉芽孢桿菌HAB-9菌株進(jìn)行了16S rDNA鑒定、生化特征測定及對17種病原真菌的拮抗作用的研究。通過序列分析，HAB-9菌株與解淀粉芽孢 桿 菌 （B.amyloliquefaciens）（GenBank NO.GQ169782.1）的相似度為99%，初步推斷為解淀粉芽孢桿菌；經(jīng)革蘭氏染色、M.R測定、V-P測定、淀粉水解、氧化酶測定、接觸酶測定，都符合解淀粉芽孢桿菌的特性［10]，可以認(rèn)定為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 革蘭氏染色

圖5 M.R測定和V-P測定

圖6 解淀粉測定

芽孢桿菌對植物病原真菌的拮抗作用很多人已經(jīng)做過，常用的方法有抑菌圈法、對峙培養(yǎng)法、搖瓶菌絲生長抑制法等［8]。不同的方法存在著優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中采取了平板對峙培養(yǎng)法測定了HAB-9對17株植物病原真菌的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HAB-9對17種不同植物病原真菌均有不同程度的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)HAB-9對檳榔炭疽?。–.gloeosporioides）有較好的拮抗作用，其抑菌率為70.59%；效果最差的為來自海南保亭橡膠樹棒孢霉落葉病菌C.cassiicola），抑菌率為50.22%。

表2 HAB-9菌株對17種病原真菌抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果（%）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，解淀粉芽孢桿菌HAB-9在實(shí)驗(yàn)中對炭疽病菌及其他植物病原菌有抑制作用，抑制率都超過了50.00%，對不同種炭疽病菌抑制程度不一樣，特別是對檳榔炭疽效果最好。解淀粉芽孢桿菌可以開發(fā)為生防菌，研究成生物農(nóng)藥，但是要將一種生防菌開發(fā)成一種商品就要考慮到生產(chǎn)成本問題，還有開發(fā)成商品之后在田間的使用效果等。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載，雖然芽孢桿菌的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但仍存在著一些問題。解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，將其開發(fā)成生物農(nóng)藥一樣要面臨著這些問題，諸如：（1）生產(chǎn)成本：生防菌與化學(xué)農(nóng)藥相比分泌量比較低，生產(chǎn)周期比較長，這些因素都相應(yīng)地增加了生產(chǎn)成本。（2）應(yīng)用問題：將生物殺菌劑投入田間使用，生防菌的性能可能會受到田間微生物、溫度、pH值等因素影響而發(fā)生變化作用，從而影響抑菌性能；生防菌與土壤本身存在的微生物的排斥；另外田間存在的農(nóng)藥不適宜生防菌的繁殖［12]。

然而，當(dāng)今世界隨著分子研究技術(shù)和科學(xué)技術(shù)的提高，解淀粉芽孢桿菌的基因功能更多的被了解，諸如上面所提到的一些問題勢必也能一一解決，解淀粉芽孢桿菌開發(fā)成生物農(nóng)藥會被廣泛地應(yīng)用。將更多生防菌開發(fā)成生物農(nóng)藥也是歷史發(fā)展的必然趨勢。用不同的生防菌聯(lián)用，以增強(qiáng)其生防效果［13]，從而充分發(fā)揮生防菌的優(yōu)勢，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供保障，造福人類。

圖7 HAB-9菌株對17種病原菌抑菌作用