陳 照 李培征 劉惠芳 李秀芳 劉文波③ 秦春秀③
(1??谑行阌^(qū)農(nóng)林局 海南???70100;2海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南???70228)
芽孢桿菌(Baci l lussp.)是人們熟知的一類重要的生防微生物,在自然界分布廣泛,具有生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、較強(qiáng)的耐熱性和抗逆性、在植物表面易于存活與繁殖等特性[1]。芽孢桿菌代謝產(chǎn)物較為豐富,如脂肽類、多糖、磷脂類、聚酮類、多烯類物質(zhì)等[2],部分菌株還可以分解土壤中的不溶性磷酸鹽;對人畜無害,不污染環(huán)境,作為生防菌,具有施用方便,能為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供幫助[3];一些種類的芽孢桿菌不僅有防病作用,還能促進(jìn)植物增產(chǎn),也可以改善植物根際周圍環(huán)境,刺激和調(diào)控植物生長,抑制植物的病害發(fā)生[4],包括根部病害、枝干病害、一些植物的立枯病菌、黃萎病菌、炭疽病菌等[5]。
解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)與枯草芽孢桿菌(B.subt i l is)是兩類重要的生防細(xì)菌,親緣性很高[6],許多表型特征非常相似,僅通過形態(tài)、培養(yǎng)特征及其生理生化很難區(qū)分,只有通過進(jìn)一步基因序列比較才能將兩者區(qū)分開來[7]。解淀粉芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌;有大于菌體的次末端芽孢;芽孢卵圓型,孢囊膨大;最適生長溫度為28~30℃,最適生長pH為6.5~7.0。它具有還原硝酸鹽;水解淀粉;可利用D-葡萄糖,L-阿拉伯糖,甘露醇,D-木糖作為碳源;接觸酶陽性;氧化酶陰性等生理生化性質(zhì)[8]。
B.amyloliquefaciensHAB-9菌株是從海南省儋州市兩院檳榔土中分離篩選得到,室內(nèi)研究表明,其對檳榔炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等17株植物病原真菌均具有拮抗活性。本文對它進(jìn)行16S rDNA鑒定,并對其生化特征測定及抑菌譜進(jìn)行研究,為實(shí)現(xiàn)該生防細(xì)菌的抑菌機(jī)理提供參考依據(jù)。
1.1.1 供試細(xì)菌、真菌
供試細(xì)菌:HAB-9,從檳榔樹根際土壤中分離保存。
供試真菌:所有菌株均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,并經(jīng)單孢分離純化后備用,見表1。
表1 供試植物病原真菌
1.1.2 培養(yǎng)基
LB固體培養(yǎng)基:酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,瓊脂16 g,蒸餾水定容至1 000mL,pH7,121℃蒸氣滅菌20min。
PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉16 g,蒸餾水定容至1 000mL,121℃蒸氣滅菌20min。
M.R、V-P測定培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,葡萄糖5 g,氯化鈉5 g,蒸餾水定容至1 000mL,pH 7~7.2,每管分裝4~5 mL,然后在115℃蒸氣滅菌30min。
解淀粉培養(yǎng)基:在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉,蒸餾水定容至1 000mL,分裝三角瓶,121℃蒸氣滅菌20min,倒平板備用。
1.1.3 主要儀器
滅菌鍋(HVE-50),電子天平(OHA),顯微鏡(OLYMPUS),恒溫?fù)u床 (Innova4230),移液槍(eppendor f),制冰機(jī) (SANYO),恒溫水浴鍋(Polscience), HH-B11恒溫培養(yǎng)箱,PCR儀(eppendor f),分光光度計(jì)(penk),凝膠成像系統(tǒng)(北京六一),電泳儀(北京君意),微波爐(格蘭仕)等。
1.2.1 生防細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定
從劃線培養(yǎng)的平板上挑取HAB-9單菌落接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min振蕩培養(yǎng) 過 夜 。 27F: 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物由深圳華大基因股份有限公司合成。反應(yīng)體系:25μL體系中含有10×PCRbuf fer 2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,27F 1.0 μL,1492R 1.0 μL,菌液1.0μL,Trans Taq酶 0.2μL,ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min,94℃ 1 min,50℃ 30 s,72℃ 2min,30個循環(huán);72℃ 10min[9];PCR產(chǎn)物,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳膠回收后,連接到pMDTM18-TVector載體,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α。篩選陽性克隆送上海生工基因股份有限公司進(jìn)行測序。
1.2.2 HAB-9菌株的生化特征測定
進(jìn)行M.R測定、V-P測定、淀粉水解、氧化酶測定、接觸酶測定等[10],并對其進(jìn)行革蘭氏染色[11]。
1.2.3 HAB-9菌株對植物病原真菌的拮抗作用
采用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行生防菌對多種病原真菌的拮抗作用測定。在PDA培養(yǎng)基中心接種直徑4.0mm的病原真菌的菌餅,在距中心25.00mm的成正方形的4個點(diǎn)分別接種待測菌株,各處理4個重復(fù),置于28℃黑暗培養(yǎng),待對照組病原真菌長滿整皿后,觀察處理組有無抑菌圈及抑菌圈的大小,分別測定處理組及對照組的菌落直徑,計(jì)算抑菌率。抑制率=
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
所有試驗(yàn)均重復(fù)4次,數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS19.0和SAS9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.1.1 PCR產(chǎn)物回收
PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得約為1 500 bp大小的片段PCR電泳產(chǎn)物及回收(圖1)。
圖1 HAB-9菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
2.1.2 轉(zhuǎn)化子的菌落PCR檢測
隨機(jī)挑取5個白色菌落培養(yǎng)菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所挑選的轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增得到1 500 bp左右的條帶,為陽性克?。▓D2)。
2.1.3 序列分析
挑選陽性克隆,送往深圳華大基因公司測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。經(jīng)NCBI的Blast搜索16SrDNA進(jìn)行比對,并通過DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示HAB-9為解淀粉芽孢桿菌,與其遺傳距離最近的登錄號為AB813716.1。
圖2 HAB-9菌株ITS結(jié)果PCR
2.2.1 革蘭氏染色
由圖4可知,HAB-9菌株革蘭氏染色為深紫色,呈陽性。
2.2.2 M.R測定及V-P測定
由圖5可知,M.R測定,HAB-9菌株呈陰性;V-P測定,HAB-9菌株呈陽性。
2.2.3 氧化酶及接觸酶測定
HAB-9菌株氧化酶測定均呈陰性,接觸酶測定呈陽性。
2.2.4 淀粉水解
由圖6可知,解淀粉測定,HAB-9中間均形成明顯的透明圈,有解淀粉功能。
采用平板對峙法培養(yǎng)后,經(jīng)后期統(tǒng)計(jì)處理,結(jié)果如下:HAB-9菌株對17種植物病原真菌的抑菌作用見圖7,通過計(jì)算HAB-9菌株對各真菌的平均抑制率。進(jìn)行比較(表2),表明HAB-9菌株對17種病原真菌的抑菌率存在差異,主要對炭疽病菌有很好的抑菌效果。
圖3 HAB-9菌株16srDNA比對及進(jìn)化樹
對解淀粉芽孢桿菌HAB-9菌株進(jìn)行了16S rDNA鑒定、生化特征測定及對17種病原真菌的拮抗作用的研究。通過序列分析,HAB-9菌株與解淀粉芽孢 桿 菌 (B.amyloliquefaciens)(GenBank NO.GQ169782.1)的相似度為99%,初步推斷為解淀粉芽孢桿菌;經(jīng)革蘭氏染色、M.R測定、V-P測定、淀粉水解、氧化酶測定、接觸酶測定,都符合解淀粉芽孢桿菌的特性[10],可以認(rèn)定為解淀粉芽孢桿菌。
圖4 革蘭氏染色
圖5 M.R測定和V-P測定
圖6 解淀粉測定
芽孢桿菌對植物病原真菌的拮抗作用很多人已經(jīng)做過,常用的方法有抑菌圈法、對峙培養(yǎng)法、搖瓶菌絲生長抑制法等[8]。不同的方法存在著優(yōu)缺點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)中采取了平板對峙培養(yǎng)法測定了HAB-9對17株植物病原真菌的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HAB-9對17種不同植物病原真菌均有不同程度的拮抗作用,發(fā)現(xiàn)HAB-9對檳榔炭疽?。–.gloeosporioides)有較好的拮抗作用,其抑菌率為70.59%;效果最差的為來自海南保亭橡膠樹棒孢霉落葉病菌C.cassiicola),抑菌率為50.22%。
表2 HAB-9菌株對17種病原真菌抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果(%)
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,解淀粉芽孢桿菌HAB-9在實(shí)驗(yàn)中對炭疽病菌及其他植物病原菌有抑制作用,抑制率都超過了50.00%,對不同種炭疽病菌抑制程度不一樣,特別是對檳榔炭疽效果最好。解淀粉芽孢桿菌可以開發(fā)為生防菌,研究成生物農(nóng)藥,但是要將一種生防菌開發(fā)成一種商品就要考慮到生產(chǎn)成本問題,還有開發(fā)成商品之后在田間的使用效果等。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載,雖然芽孢桿菌的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步,但仍存在著一些問題。解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬,將其開發(fā)成生物農(nóng)藥一樣要面臨著這些問題,諸如:(1)生產(chǎn)成本:生防菌與化學(xué)農(nóng)藥相比分泌量比較低,生產(chǎn)周期比較長,這些因素都相應(yīng)地增加了生產(chǎn)成本。(2)應(yīng)用問題:將生物殺菌劑投入田間使用,生防菌的性能可能會受到田間微生物、溫度、pH值等因素影響而發(fā)生變化作用,從而影響抑菌性能;生防菌與土壤本身存在的微生物的排斥;另外田間存在的農(nóng)藥不適宜生防菌的繁殖[12]。
然而,當(dāng)今世界隨著分子研究技術(shù)和科學(xué)技術(shù)的提高,解淀粉芽孢桿菌的基因功能更多的被了解,諸如上面所提到的一些問題勢必也能一一解決,解淀粉芽孢桿菌開發(fā)成生物農(nóng)藥會被廣泛地應(yīng)用。將更多生防菌開發(fā)成生物農(nóng)藥也是歷史發(fā)展的必然趨勢。用不同的生防菌聯(lián)用,以增強(qiáng)其生防效果[13],從而充分發(fā)揮生防菌的優(yōu)勢,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供保障,造福人類。
圖7 HAB-9菌株對17種病原菌抑菌作用