豆峻嶺 趙勝杰 路緒強 何楠 張磊 匡漢暉 劉文革
目的與意義:果實形狀作為一個非常重要的農(nóng)藝性狀,在許多作物中已經(jīng)有了非常深入的研究,同時也獲得了許多控制果實形狀的候選基因。隨著2012年西瓜全基因組測序的完成,西瓜分子生物學(xué)的研究得到了快速發(fā)展,目前關(guān)于西瓜遺傳圖譜的報道有很多,根據(jù)遺傳圖譜也得到了許多性狀的QTLs,尤其是西瓜果實的長度、寬度、果形指數(shù)等。然而目前還沒有關(guān)于西瓜果實形狀候選基因定位的報道。因此筆者通過配制雜交組合,解析西瓜果實形狀的遺傳模式,同時利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,希望能夠獲得控制西瓜果實形狀的候選基因。
材料與方法:以長果西瓜自交系‘短125(P1)和圓果西瓜自交系‘鄭州籽瓜(P2)為親本雜交配制F1,F(xiàn)1自交配制F2分離群體,F(xiàn)1分別和P1、P2回交配制回交群體BC1P1、BC1P2。采用BSA(混合群體分離分析)測序法從F2分離群體中分別選取長瓜30株、圓瓜30株,分別采取葉片提取DNA,然后分別將長瓜和圓瓜DNA等量混合,送公司進行全基因組重測序。結(jié)合GWAS(全基因組關(guān)聯(lián)分析)分析得到控制西瓜果實形狀的候選區(qū)間。之后通過分析候選區(qū)間內(nèi)的SNPs,開發(fā)出298個CAPS標記,根據(jù)這些標記對430株F2分離群體進行酶切檢測,篩選重組單株,從而縮小候選區(qū)間。最終通過實時熒光定量PCR技術(shù)對候選基因在不同發(fā)育時期不同組織器官中進行實時熒光定量PCR分析。
結(jié)果與分析:(1)通過對西瓜果實形狀六世代群體的遺傳分析,西瓜果實長圓為單基因不完全顯性遺傳,其中果實長為顯性純合(OO),果實圓為隱性純合(oo),而果實橢圓為雜合(Oo)。同時對兩親本發(fā)育過程果形指數(shù)進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),授粉當天果形指數(shù)最大,長瓜達到3.15,圓瓜達到1.43。而隨著果實的發(fā)育,長瓜最終維持在1.83左右,而圓瓜維持在1.02左右。(2)通過BSA和GWAS相結(jié)合的方法,西瓜果實形狀被定位在3號染色體23.52~28.83 Mb的區(qū)間內(nèi)。進一步通過CAPS標記進行精細定位,最終候選基因被定位到3號染色體26.817~26.863 Mb的區(qū)間內(nèi)(原圖4)。比對參考基因組中該區(qū)間內(nèi)的功能基因,最終發(fā)現(xiàn)在該區(qū)間只有4個功能基因,分別擴增這4個基因,最終發(fā)現(xiàn)Cla011257在長瓜中有1個159 bp缺失,而該缺失造成了53個氨基酸缺失。繼續(xù)比對2個參考基因組中該基因的差異,也發(fā)現(xiàn)在‘Charleston Gray(長瓜)參考基因組中有1個159 bp缺失,而在‘97103(圓瓜)參考基因組中則沒有該缺失。因此推測Cla011257為控制西瓜果實長圓的候選基因。根據(jù)該缺失片段,開發(fā)出一個indel標記,將該標記在100份西瓜種質(zhì)資源中檢測發(fā)現(xiàn)該標記和西瓜果實形狀緊密連鎖(原圖5)。通過蛋白功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因編碼IQD蛋白。(3)將花期的根、莖、葉、花以及不同發(fā)育時期的子房、果皮、果肉進行候選基因的實時熒光定量分析,最終發(fā)現(xiàn)在授粉當天該基因有最高表達量,這也解釋了授粉當天果形指數(shù)有最大值的原因,子房的形狀也決定了成熟后果實的形狀。
結(jié)? ? 論:本研究首先明確了西瓜果實形狀的遺傳為單基因不完全顯性遺傳,即純合顯性(OO)為長果,雜合(Oo)為橢圓果,純合隱性(oo)為圓果。通過BSA測序和GWAS重測序相結(jié)合的方法將控制西瓜果實形狀的基因定位于3號染色體26.817~26.863 Mb的區(qū)域內(nèi),通過深入研究,最終確定Cla011257基因在長果西瓜中有1個159 bp缺失,造成了53個氨基酸缺失;而在圓瓜中無該缺失。進一步分析發(fā)現(xiàn)該基因為IQD蛋白家族成員。