張 林，楊德成，陳書明*，張建新，王倩倩，宋 晶，楊繼業(yè)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省畜牧遺傳育種中心，山西太原 030027）

近年來，隨著圈養(yǎng)牛羊規(guī)模不斷擴(kuò)大，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的飼草料出現(xiàn)缺口，新飼料資源的開發(fā)與功能生物飼料的研制成為重要課題。醋糟是釀醋業(yè)的下腳料，在我國(guó)每年排放量達(dá)200 萬t 以上[1]，其粗纖維含量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低，若不做處理直接飼用則效果不佳[2]；長(zhǎng)期堆放會(huì)散發(fā)難聞氣味，造成環(huán)境污染。紅酵母（Rhodotorula）是一類主要以芽殖為主的、形態(tài)構(gòu)造簡(jiǎn)單的真菌，具有較強(qiáng)抗逆性和耐重金屬特性[3]。紅酵母富含高營(yíng)養(yǎng)菌體蛋白、不飽和脂肪酸、維生素等物質(zhì)[4-5]，尤其是能產(chǎn)生以β- 胡蘿卜素為主的類胡蘿卜素[6]，故在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注與應(yīng)用。Yang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在南美白對(duì)蝦飼料中添加10 g/kg 海洋紅酵母可提高蝦的抗氧化機(jī)能。李貌[5]發(fā)現(xiàn)，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加12.5% 的膠紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物可顯著提高蛋雞的生產(chǎn)性能，改善蛋品質(zhì)。本研究在酵母菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用26S rDNA 的D1/D2區(qū)核酸序列分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離的可產(chǎn)類胡蘿卜素的酵母菌株進(jìn)行鑒定，并研究該菌發(fā)酵對(duì)醋糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響，為醋糟的無害化處理及類胡蘿卜素功能飼料的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 紅酵母：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存。醋糟由山西省太谷縣太平莊醋廠提供。紅酵母斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.05 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.054 g，瓊脂2.0 g，加蒸餾水約90 mL，加熱混勻，調(diào)節(jié)pH 至6.0，定容至100 mL，121℃濕熱滅菌20 min，傾斜放置，冷卻，形成斜面。紅酵母液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，酵母粉1 g，加蒸餾水約90 mL，加熱混勻，調(diào)節(jié)pH 至6.0，定容至100 mL，121℃濕熱滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌形態(tài)學(xué)及生理生化特性鑒定 參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[8]，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離的酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化特性鑒定。

1.2.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定 參照王倩倩[9]和Kurtzman等[10]的方法，以NL1（5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3'）與NL4（5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3'）為引物，PCR 擴(kuò)增待鑒定酵母菌26S rDNA 的D1/D2 區(qū)序列。PCR 反應(yīng)程序：頂蓋105℃，預(yù)變性95℃ 3 min，變性95℃ 30 s，退火54.5℃ 35 s，延伸72℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5 min。然后，用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blast 軟件，對(duì)上述試驗(yàn)所獲得DNA 序列與該數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，從而對(duì)擬鑒定菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲得紅酵母屬9 個(gè)種的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列，用NCBI 網(wǎng)站提供的Blast 分析工具包，對(duì)上述所有序列與本研究鑒定菌種的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行相似性檢索，進(jìn)行堿基序列變異統(tǒng)計(jì)，存入文本文檔，再修改為“.fasta”格式，進(jìn)行剪切之后將前面的文件轉(zhuǎn)化格式為“.meg”格式，再進(jìn)行激活，運(yùn)用軟件Mega 6.01[11]構(gòu)建無根樹，采用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）和最大似然法（Maximum Likelihood，ML）2 種方法構(gòu)樹，比較目標(biāo)菌種與庫內(nèi)已知菌種的系統(tǒng)關(guān)系。

1.2.3 紅酵母發(fā)酵醋糟試驗(yàn) 將4℃保存的紅酵母菌種劃線接種至斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72 h，然后將斜面培養(yǎng)基上活化的紅酵母接種于液體種子培養(yǎng)基，于30℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，加滅菌水調(diào)整紅酵母種子液濃度達(dá)8.5×106CFU/mL，作為后續(xù)醋糟發(fā)酵用紅酵母種子液。取50 mL 紅酵母種子液，121℃濕熱滅菌20 min，作為滅活的紅酵母種子液。取10 個(gè)大燒杯，每個(gè)燒杯均加入100 g 醋糟與132 mL 蒸餾水，混勻，121℃滅菌20 min，冷卻。任選其中5 個(gè)燒杯，在每個(gè)燒杯的醋糟培養(yǎng)基中均接種8 mL 紅酵母種子液，置于30℃培養(yǎng)箱發(fā)酵85 h，作為發(fā)酵醋糟組。在剩余5 個(gè)燒杯的醋糟培養(yǎng)基中分別加入8 mL 滅活的紅酵母種子液，混勻，也置于30℃培養(yǎng)箱保溫85 h，作為對(duì)照組（即未發(fā)酵醋糟組），然后測(cè)定2 組營(yíng)養(yǎng)成分的差異。

1.2.4 紅酵母發(fā)酵醋糟營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 未發(fā)酵醋糟與發(fā)酵醋糟均于65℃烘至恒重，回潮48 h，然后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定分析。干物質(zhì)（DM）和真蛋白質(zhì)（TP）含量測(cè)定參照張麗英[12]方法，粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量測(cè)定采用濾袋法[13]，粗脂肪（EE）含量測(cè)定采用殘余法[12]，粗蛋白質(zhì)（CP）含量測(cè)定采用《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》（GB/T 6432-94），總糖含量測(cè)定采用DNS 法[14]，類胡蘿卜素產(chǎn)量的測(cè)定參照王蓉等[15]方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用 SPSS 21.0 進(jìn)行配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 待鑒定菌株的形態(tài)學(xué)特征 該菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 時(shí)，出現(xiàn)粉紅色菌落，48 h 后顏色加深，72 h從培養(yǎng)箱中取出，放置4℃冰箱7 d 后觀察，菌苔顏色呈現(xiàn)橙紅色，在其表面可見由光滑到褶皺，質(zhì)地較粘稠，有光澤，邊緣整齊（圖1-A）。制作美藍(lán)染色涂片后于顯微鏡下觀察，采集該菌顯微形態(tài)圖（圖1-B），可見其細(xì)胞多為圓型或卵圓形，單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞連接成串珠，該菌以芽殖的方式進(jìn)行繁殖。上述結(jié)果表明，該菌株符合酵母菌的形態(tài)特征。

圖1 待鑒定菌株的形態(tài)觀察

2.2 待鑒定菌株的生理生化特性 由表1 可知，該菌能同化葡萄糖、蔗糖等多種碳源，但對(duì)于乙醇、檸檬酸無同化能力；在無維生素的情況下可正常生長(zhǎng)。氮源同化試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌能同化NaNO3、NaNO2。該菌在25～35℃可以生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，待鑒定菌株符合酵母菌的生理生化特性。

2.3 待鑒定菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增結(jié)果 由圖2 可見，待鑒定菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單一條帶，無非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為600 bp，符合試驗(yàn)預(yù)期，可用于測(cè)序分析。

2.3.2 26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析 經(jīng)測(cè)序分析可知，PCR擴(kuò)增出的待鑒定菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)序列為613 bp。用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blast 軟件比對(duì)可知，擴(kuò)增出的613 bp DNA 序列與NCBI 中紅酵母屬M(fèi)13（Rhodotorula sp. M13）菌株的相關(guān)序列（登錄號(hào)：FJ795010.1）相似度為100%。因此，基本確定待鑒定菌株屬于紅酵母屬（Rhodotorula sp.）。

表1 待鑒定菌株的生理生化特性

圖2 26S rDNA D1/D2 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

由圖3 可知，采用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和采用ML 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有完全相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，本研究鑒定菌種與黏性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）具有完全相同的26S rDNA D1/D2 區(qū)DNA 序列，與其他9 種已測(cè)序的紅酵母均存在一定差異，故待鑒定菌株基本確定為黏性紅酵母。

圖3 由26S rDNA D1/D2 區(qū)序列構(gòu)建的紅酵母屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 紅酵母發(fā)酵醋糟試驗(yàn)結(jié)果 由表2 可知，醋糟經(jīng)紅酵母固態(tài)發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)成分含量變化較大。其中，DM、CF、NDF 和ADF 含量變化差異不顯著；CP 和TP 含量較未發(fā)酵醋糟分別提高了27.68%與36.04%（P＜0.01），類胡蘿卜素含量提高了330 倍（P＜0.01），而EE 與總糖含量分別降低了56.45%與33.88%（P＜0.01）。

表2 紅酵母發(fā)酵對(duì)醋糟營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

3 討 論

3.1 紅酵母菌種鑒定 微生物菌種鑒定經(jīng)典方法主要依賴其形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特征反應(yīng)。而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，rDNA 基因序列分析也可被用于菌種分類與鑒定，該種鑒定方法比傳統(tǒng)鑒定方法更加快速、準(zhǔn)確，具體到真菌鑒定則是26S rDNA 序列分析應(yīng)用更為廣泛。26S rDNA Dl/D2 區(qū)位于酵母核糖體大亞基26S rRNA 基因的5' 端，長(zhǎng)度為600 bp 左右，這段區(qū)域具有較高的變異率。以26S rDNA 進(jìn)行酵母菌種鑒定已有應(yīng)用[10]。2000 年后，基于26S rDNA D1/D2 區(qū)的酵母菌鑒定數(shù)據(jù)庫初步形成。Gutel 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，26S rDNA 的D1/D2 區(qū)域有很高的變異率，可用于親緣關(guān)系較近的菌株之間的分類研究。Fell 等[17]對(duì)擔(dān)子酵母和類酵母真菌26S rDNA 進(jìn)行了研究。目前絕大多數(shù)酵母菌模式菌株的26S rDNA 序列已被測(cè)定并公布，因而26S rDNA Dl/D2 區(qū)序列分析可以作為酵母菌種分子水平鑒定的指標(biāo)。

紅酵母（Rhodotorula）是常見的水生酵母菌，經(jīng)常出現(xiàn)在海水或淡水等營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺乏的潮濕環(huán)境中[18]。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離酵母菌株進(jìn)行鑒定，目的是通過不同試驗(yàn)結(jié)果相互驗(yàn)證以提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究通過對(duì)待鑒定菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性分析，發(fā)現(xiàn)待鑒定菌株具有紅酵母屬（Rhodotorula sp.）的特征[8]，通過分子生物學(xué)鑒定則進(jìn)一步說明待鑒定菌株為黏性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。由于本研究所用的菌種數(shù)量有限，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的核心序列也僅536 bp，分析結(jié)果不一定全面反映該屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但能夠?yàn)殍b定目標(biāo)菌種提供有利的證據(jù)，并對(duì)常見的其他紅酵母菌種進(jìn)行排除?；谏鲜龇治?，待鑒定菌株基本確定為黏性紅酵母。

3.2 紅酵母發(fā)酵對(duì)醋糟飼用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響 有益微生物發(fā)酵是生物合成維生素、必需氨基酸和蛋白質(zhì)等有益物質(zhì)，進(jìn)而提高飼料原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種技術(shù)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅酵母在發(fā)酵醋糟過程中，消耗了醋糟中部分脂肪和糖類物質(zhì)，促使紅酵母細(xì)胞大量增殖，產(chǎn)生了大量酵母菌體蛋白，從而極顯著提高了發(fā)酵醋糟中CP、TP 含量。蛋白質(zhì)含量的高低是衡量飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，畜禽養(yǎng)殖過程中，飼料蛋白含量不足會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物健康、生長(zhǎng)以及生產(chǎn)[20]。

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界含有8 個(gè)異戊二烯單位的四萜類化合物，主要包括β- 胡蘿卜素、蝦青素、辣椒紅素和番茄紅素等，顏色系列可從黃色跨度到深紅色，是自然界動(dòng)植物呈現(xiàn)各種顏色的主要原因。動(dòng)物和人體內(nèi)一般不能合成類胡蘿卜素，只能依賴食物從外界攝入，但也有報(bào)道稱蚜蟲、蜘蛛螨可從真菌等微生物中竊取制造類胡蘿卜素的基因，從而達(dá)到合成類胡蘿卜素的目的[21-22]。類胡蘿卜素作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，其優(yōu)良品質(zhì)和功效早已被公認(rèn)。類胡蘿卜素具有很強(qiáng)的清除體內(nèi)自由基的能力，具有防癌抗癌、抗衰老、預(yù)防輻射及心血管疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，因而受到越來越多人的青睞[23]。本研究結(jié)果表明，紅酵母發(fā)酵醋糟產(chǎn)生的類胡蘿卜素高達(dá)6.60 mg/kg，因此，紅酵母發(fā)酵顯著提高了醋糟的飼用價(jià)值。

紅酵母發(fā)酵產(chǎn)生的類胡蘿卜素種類主要為β-胡蘿卜素、紅酵母烯和紅酵母紅素3 種[15]，其比例與具體菌株及發(fā)酵條件緊密相關(guān)，本研究所產(chǎn)類胡蘿卜素種類及比例有待后續(xù)研究。《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 65-2004）中瘦肉型生長(zhǎng)肥育豬對(duì)β-胡蘿卜素的需求量為5.5 mg/kg 飼料干物質(zhì)，《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 815-2004）中生長(zhǎng)肥育牛對(duì)β-胡蘿卜素的需求量為5.5 mg/kg，《羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）中妊娠母羊?qū)Ζ?胡蘿卜素的需求量最高，其需求量為4.7～9.9 mg/kg。而本研究用紅酵母發(fā)酵醋糟，產(chǎn)生的類胡蘿卜素量高達(dá)6.60 mg/kg。綜上所述，本研究為利用醋糟開發(fā)類胡蘿卜素功能飼料奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析，本研究前期分離的1 株產(chǎn)類胡蘿卜素的酵母菌被鑒定為黏性紅酵母。利用該紅酵母發(fā)酵可顯著提高醋糟CP 與TP 含量，尤其是能夠產(chǎn)生6.60 mg/kg類胡蘿卜素。