于永慧， 董瑞紅, 2， 劉劍剛△， 張大武， 王承龍△

(1中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心， 北京 100091； 2北京市門頭溝區(qū)中醫(yī)醫(yī)院， 北京 102300)

以動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病已成為危害人類健康的主要原因之一。Satterthwaite等[1]對(duì)因冠狀動(dòng)脈狹窄而導(dǎo)致缺血性心臟病和擴(kuò)張型心肌病患者的冠狀動(dòng)脈組織進(jìn)行了基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)包括白細(xì)胞介素(interleukin-1β,IL-1β)和IL-8在內(nèi)的361個(gè)炎癥基因存在差異表達(dá)，說明炎癥反應(yīng)在AS病理過程中扮演必不可少的角色。本課題組前期在ApoE-/-小鼠典型的AS病變部位發(fā)現(xiàn)了與脂質(zhì)堆積、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等生物過程相關(guān)且隨時(shí)間推移而衍化的病理學(xué)證據(jù)[2]，即ApoE-/-小鼠在5～6周齡時(shí)單核細(xì)胞開始黏附于損傷的主動(dòng)脈內(nèi)皮，8～10周齡時(shí)脂質(zhì)條紋逐漸形成，18～20周齡可見主動(dòng)脈根部有富含泡沫細(xì)胞的AS纖維斑塊出現(xiàn)。

抗炎癥反應(yīng)是目前防治AS的主要手段。但是以往的研究多集中在某個(gè)固定時(shí)段AS與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，而AS的病理過程是處于不斷變化中的，針對(duì)AS不同階段的炎癥病理特征制定個(gè)性化的防治策略將是更為妥當(dāng)?shù)募膊?yīng)對(duì)方式。故而本研究采用Agilent基因芯片技術(shù)對(duì)ApoE-/-小鼠AS不同時(shí)期炎癥差異基因進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，同時(shí)探討其在不同病理階段的表達(dá)方式，以期為臨床治療以AS為病理基礎(chǔ)的疾病提供階段性靶向治療的藥理依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性清潔級(jí)ApoE-/-小鼠60只，相同遺傳背景C57BL/6J野生型小鼠20只，體重(18～20)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(京)2009-0004和SCXK(京)2009-0007。小鼠購置后在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。室內(nèi)溫度(23～25)℃、濕度(50～70)%、光照和通風(fēng)條件均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)高脂飼料(含脂肪21%和膽固醇0.15%)，C57BL/6J野生型小鼠以普通飼料喂養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

G2505C型掃描儀、G2545A型雜交爐、G2939A型生物分析儀和2100型9600振蕩器(Agilent)；NanoDrop 2000型超微量分光光度儀(Thermo Electron)；9700型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)儀(Life Technologies ABI)；5418型離心機(jī)和5301型濃縮儀(Eppendorf)；XMTD-8222型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

3 實(shí)驗(yàn)試劑

單色低起始量快速擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒(批號(hào)5190-2305)、基因表達(dá)雜交試劑盒(批號(hào)5188-5242)、基因表達(dá)清洗包(批號(hào)5188-5327)、RNA提取試劑盒(批號(hào)5188-5282)、基因芯片Package 20 backings，8 HD arrays per slide(G2534-60015)和基因芯片Package 20 backings，4 arrays per slide(G2534-60012)和QIAGEN RNeasy? Mini Kit(批號(hào)74106)購自安捷倫科技(中國)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑(PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real Time，批號(hào) RR036A)由日本TaKaRa公司生產(chǎn)；熒光定量試劑(LightCycler? 480 SYBR Green I Master，批號(hào) 04887352001)購自Roche。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1動(dòng)物分組 將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為初期AS組(10周齡)、早期AS組(15周齡)和后期AS組(25周齡)3組，每組20只。相同遺傳背景相應(yīng)周齡的C57BL/6J野生型小鼠20只作為空白對(duì)照(control)組。小鼠達(dá)到相應(yīng)周齡后麻醉，打開腹腔及胸腔，沿脊柱確定主動(dòng)脈位置，分離主動(dòng)脈弓，液氮保存，每組選取5只用于基因篩選，剩余15只用于基因表達(dá)驗(yàn)證。

4.2芯片雜交 提取組織塊中的總RNA，以合成的cDNA雙鏈為模板合成cRNA，采用QIAGEN RNeasy? Mini Kit過柱純化。cRNA質(zhì)控采用分光光度計(jì)在260 nm和280 nm測(cè)定吸光度(A)值，以A260/A280接近2.0為較純的cRNA。純化后將每組樣本的cRNA等量混合，采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒對(duì)cRNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，QIAGEN RNeasy? Mini Kit純化。在滾動(dòng)雜交爐中65 ℃，10 r/min雜交17 h。完成雜交的芯片進(jìn)行洗片后，采用分辨率為5 μm的Agilent掃描儀以100%和10% PMT各掃描1次。最后利用Feature Extraction 軟件(Version 10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)，GeneSpring軟件(Version 12.5，Agilent Technologies)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。

4.3RT-qPCR 驗(yàn)證 對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因經(jīng)功能注釋找出與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因，采用RT-qPCR對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。利用TRIzol提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度及A260/A280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。目標(biāo)基因的引物及探針序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，采用Roche LCPDS2 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(上海捷瑞生物工程有限公司合成)。差異基因的引物序列見表1。利用LightCycler? 480 SYBR Green I Master 試劑盒在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)。熒光定量PCR循環(huán)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每 ℃采集5次熒光信號(hào)。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 不同周齡ApoE-/-小鼠差異基因驗(yàn)證的引物序列

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

芯片數(shù)據(jù)中差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05且fold change值≥2.0。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RNA樣品的質(zhì)量鑒定

20個(gè)樣本RNA質(zhì)檢結(jié)果合格。提取的總RNA經(jīng)NanoDrop 2000型超微量分光光度儀測(cè)定顯示，A260/A280在2.13±0.07之間，提示cRNA純度良好。對(duì)樣品進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳顯示，18S和28S條帶清晰可見。RNA完整性(RNA integrity number，RIN)檢測(cè)顯示，所有RNA樣品條帶清晰，RIN≥7且28S/18S≥0.7,表明RNA完整性良好，未被RNA酶降解，符合基因表達(dá)譜研究的實(shí)驗(yàn)要求，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2 差異基因的篩選

采用Agilent小鼠全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)不同周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓組織RNA表達(dá)，結(jié)果顯示，芯片掃描圖標(biāo)記清晰、熒光分布致密均勻，雜交狀況良好。將4組樣本的芯片掃描圖進(jìn)行組間對(duì)照，計(jì)算t檢驗(yàn)差異顯著性P值和標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)的差異倍數(shù)fold change值。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05且fold change≥2.0，進(jìn)而得到不同周齡ApoE-/-小鼠的差異基因個(gè)數(shù)，見表2。對(duì)上述組間比較進(jìn)行整合分析，計(jì)算組間共同或者特異表達(dá)的差異基因個(gè)數(shù)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ApoE-/-小鼠顯著變化的差異基因?yàn)?10周齡895個(gè)，15周齡540個(gè)，25周齡591個(gè)。

表2 不同周齡ApoE-/-小鼠之間差異基因表達(dá)個(gè)數(shù)

Table 2.The numbers of differential expression genes in different weeks ofApoE-/-mice

No.ComparisonUp-regulatedDown-regulatedTotal110W vs 15W8934111 304210W vs 25W2 3791 8844 263310W vs control4 7383 5968 334415W vs 25W1 9751 9033 878515W vs control4 1453 0907 235625W vs control3 2221 6524 874

W: weeks.

采用火山圖展示組間差異基因表達(dá)強(qiáng)度的分布情況，可見與對(duì)照組相比，不同周齡ApoE-/-組差異基因數(shù)量顯著增多；10W與25W、15W與25W、10W與15W相比，前者顯著差異基因表達(dá)量較少。

3 差異基因的生物信息學(xué)分析

3.1差異基因的GO分析 通過NCBI和UnitProt公共數(shù)據(jù)庫查閱AS相關(guān)炎癥基因信息，GO分析顯示，10W與25W的差異基因數(shù)最多，為131個(gè)，10W與15W的差異基因?yàn)?2個(gè)，15W與25W的差異基因?yàn)?7個(gè)。各組差異基因GO分子功能主要涉及炎癥因子活性、脂質(zhì)代謝、基質(zhì)金屬蛋白酶、巨噬細(xì)胞清道夫受體等,見表3。

表3 不同周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓組織差異表達(dá)基因的GO分子功能

W: weeks.

3.2炎癥差異基因的篩選 對(duì)涉及GO分子功能的差異基因進(jìn)行整理，剔除重復(fù)后共計(jì)篩選基因140個(gè)。去除目前無文獻(xiàn)報(bào)道與AS炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因后，依據(jù)其差異倍數(shù)排序，最終選定5個(gè)候選目標(biāo)差異基因，見表4。

表4 不同周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓組織炎癥差異基因

4 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

通過RT-qPCR方法檢測(cè)不同周齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓內(nèi)IL-12a、IFN-γ、MMP12、GDF-15和IL-1β的mRNA表達(dá)量變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，10W和25W小鼠的IL-12a表達(dá)水平顯著上(P<0.05)，且10W IL-12a表達(dá)顯著高于25W(P<0.01)，而15W小鼠的IL-12a表達(dá)顯著下降(P<0.05)；15W和25W小鼠IFN-γ表達(dá)較對(duì)照組有所上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各個(gè)周齡小鼠的MMP-12表達(dá)量較對(duì)照組均有上升，10W和25W有顯著差異(P<0.05)，其中25W MMP-12上調(diào)更為顯著(P<0.01)；15W和25W周齡小鼠GDF-15表達(dá)較對(duì)照組有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且25W GDF-15表達(dá)顯著高于15W(P<0.01)；各個(gè)周齡小鼠的IL-1β表達(dá)量較對(duì)照組均有下降，且10W和15W有顯著差異(P<0.05)，15W IL-1β下調(diào)更為顯著(P<0.01)，見圖1。

另外以對(duì)照組為參考值，根據(jù)Mean Express計(jì)算ApoE-/-小鼠在10W、15W和25W時(shí)5個(gè)差異基因的變化情況，并作出趨勢(shì)圖。根據(jù)基因表達(dá)趨勢(shì)的不同，可分為持續(xù)上升型(IFN-γ和GDF-15)和折線型(IL-12a、MMP-12和IL-1β)。10W、15W和25W 的IFN-γ和GDF-15表達(dá)量依次遞增，因而其基因表達(dá)趨勢(shì)呈持續(xù)上升型。而15W的IL-12a、IL-1β和MMP-12表達(dá)量較10W和25W低，處于基因表達(dá)趨勢(shì)線的谷底，使IL-12a、IL-1β和MMP-12呈現(xiàn)折線型的基因表達(dá)趨勢(shì)，IL-12a在10W和MMP-12在25W分別達(dá)到谷峰，見圖2。

討 論

在炎癥因子隨時(shí)間變化趨勢(shì)的研究中，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、IL-6、MCP-1、TNF-α和IL-1β等顯示出隨AS病變進(jìn)展逐漸升高的趨勢(shì)。李嶸娟等[3]利用超聲生物顯微鏡檢測(cè)ApoE-/-小鼠在8、16、24和32周齡的主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)中膜厚度(intima-media thickness，IMT)和CRP水平，發(fā)現(xiàn)IMT和CRP水平隨著周齡而增加，與AS病變嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。孫婷婷等[4]發(fā)現(xiàn)12、14、16和18周齡

Figure 1.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of differential inflammatory genes in different weeks ofApoE-/-mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 不同周齡ApoE-/-小鼠炎癥差異基因mRNA表達(dá)的RT-qPCR定量

Figure 2.The differential expression tendency of the inflammatory genes in different weeks ofApoE-/-mice.

圖2 不同周齡ApoE-/-小鼠炎癥差異基因的表達(dá)趨勢(shì)圖

ApoE-/-小鼠IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，且周齡之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。荊文等[5]檢測(cè)1、2、3月齡ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中11個(gè)特定炎癥相關(guān)基因的時(shí)序表達(dá)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠與同齡WT小鼠相比，1、2、3月齡時(shí)IL-1β的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，同時(shí)1月齡時(shí)VCAM-1、IкB-α、TGF-β和SOD1，2月齡時(shí)PDGF-α和CD36，3月齡時(shí)TNF-α和MMP-2的mRNA表達(dá)水平與同齡WT小鼠相比均顯著上調(diào)。陳冰[6]等觀察ApoE-/-小鼠外周血單核細(xì)胞Mo及其亞型Ly6chi在4、8、12和16周齡的比例變化，發(fā)現(xiàn)表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白1受體CCR2，并分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子的炎癥型Ly6chi表型僅在8周齡時(shí)升高，具有免疫保護(hù)功能的Mo表型在4周即高于同周齡C57BL/6J小鼠，8周齡開始有所下降并持續(xù)至16周。提示天然免疫系統(tǒng)可能在AS病變8周齡時(shí)開啟炎癥反應(yīng)的高峰。徐芳[7]等觀察不同周齡ApoE-/-小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞的表型變化，發(fā)現(xiàn)10周齡和15周齡ApoE-/-小鼠的血管外膜成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)vimentin陽性，部分α-SMA陽性，且15周齡α-SMA的表達(dá)高于10周齡，提示15周齡時(shí)ApoE-/-小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致血管外膜膠原沉積、管壁增厚等病變，促進(jìn)AS病灶的形成和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)在10W、15W和25W存在顯著性變化的、既往研究中未曾報(bào)道的差異炎癥因子，并最終選擇表達(dá)量最高的5個(gè)炎癥因子(IL-12a、IFN-γ、MMP12、GDF-15和IL-1β)進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證，并根據(jù)其基因表達(dá)趨勢(shì)的不同，分為持續(xù)上升型(IFN-γ和GDF-15)和折線型(MMP-12、IL-12a和IL-1β)。持續(xù)上升型表達(dá)的炎癥因子IFN-γ和GDF-15參與的炎癥反應(yīng)促進(jìn)AS中后期病程的進(jìn)展，體現(xiàn)了AS炎癥反應(yīng)逐漸加重的特點(diǎn)。其中，IFN-γ屬于II型干擾素，主要通過誘導(dǎo)促炎癥因子如TNF-α、IL-6、氧自由基和MMPs的產(chǎn)生、促進(jìn)CD4+T細(xì)胞抗原呈遞等過程參與AS炎癥反應(yīng)，并且通過上調(diào)ACAT-1表達(dá)增強(qiáng)膽固醇酯的合成、激活STAT-1/ABC途徑減少膽固醇的流出參與AS脂代謝調(diào)節(jié)。GDF-15是穩(wěn)定性AS疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，GDF-15≥1200 ng/L的穩(wěn)定性冠心病患者繼發(fā)心血管事件和十年死亡率顯著上升[8]。Bonaterra等[9]發(fā)現(xiàn)GDF-15可以通過誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)水平來促進(jìn)AS的進(jìn)程。本研究顯示，IFN-γ和GDF-15基因表達(dá)隨著AS病程的進(jìn)展而呈持續(xù)上升趨勢(shì)，尤其是在15W和25W等AS中后期表達(dá)顯著增高。這說明以IFN-γ和GDF-15為代表的持續(xù)上升型炎癥因子促進(jìn)和加劇了AS炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝紊亂。

折線型表達(dá)的炎癥因子參與AS其他病理特征，如IL-12a主要在早期AS過程中發(fā)揮炎癥誘導(dǎo)作用，而MMP-12和IL-1β主要參與形成后期具有不穩(wěn)定特點(diǎn)的AS斑塊，體現(xiàn)了參與AS炎癥因子的復(fù)雜性和多樣性。其中，IL-12a在AS的早期階段促進(jìn)AS炎癥反應(yīng)中的Th1細(xì)胞免疫，并誘導(dǎo)分泌IFN-γ和TNF-α等多種炎癥因子的表達(dá)。Davenport等[10]觀察到在AS后期45周齡時(shí)敲除ApoE-/-小鼠IL-12a并不影響AS的進(jìn)展。MMP-12則能夠降解ECM成分，并激活其他MMPs(如MMP-2、MMP-3等)。Morgan等[11]發(fā)現(xiàn)MMP-12在破裂的AS斑塊中含量顯著増高，Johnson等[12]將ApoE-/-小鼠的MMP-12基因剔除或加用MMP-12抑制劑RXP470.1[13]后發(fā)現(xiàn)，頭臂干AS斑塊減少并呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)。IL-1β主要刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥因子及酶類，與TNF-ɑ和CD40-L共同降解纖維帽加強(qiáng)AS斑塊不穩(wěn)定性，并且活化血小板、抑制纖溶，促進(jìn)破裂部位血栓的形成，影響溶栓效果。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-12a在ApoE-/-小鼠10W的表達(dá)量顯著升高，提示IL-12a在AS早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)和誘導(dǎo)作用。MMP-12和IL-1β在ApoE-/-小鼠15W表達(dá)下降，10W和25W表達(dá)升高，從側(cè)面印證了AS病變斑塊從早期不穩(wěn)定到中期相對(duì)穩(wěn)定，而到后期又變?yōu)椴环€(wěn)定的動(dòng)態(tài)衍變過程。因此，抑制MMP-12和IL-1β等導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定的炎癥基因，可能會(huì)使不穩(wěn)定的AS病變趨于穩(wěn)定。

ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化過程是一個(gè)隨時(shí)間不斷變化的動(dòng)態(tài)病理結(jié)果，本研究在差異表達(dá)的基因中發(fā)現(xiàn)25WApoE-/-小鼠較10W和15W差異基因表達(dá)相對(duì)增多，體現(xiàn)了AS隨時(shí)間進(jìn)展而病理改變愈發(fā)復(fù)雜的傾向。包括IL-12a、IFN-γ、MMP-12、GDF-15和IL-1β在內(nèi)的眾多炎癥因子參與其中，呈現(xiàn)或持續(xù)上升、或波動(dòng)性的變化趨勢(shì)，反映了AS過程中炎癥因子相互作用、相互影響、相互制約的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從而導(dǎo)致AS斑塊的發(fā)生發(fā)展甚至出現(xiàn)不良心血管事件。