馬子華， 張景允， 楊 柳， 田 甜， 湯 雷， 鄭 璐， 蔡 爽， 韓 冰， 謝汝佳， 楊 婷， 楊 勤

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550000)

慢性砷(arsenic，As)暴露可引發(fā)肝臟、皮膚、心血管、胃腸道以及神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病[1-2]，肝是砷毒性作用的主要靶器官[3]。印度加爾各達(dá)飲水型砷中毒76.6%患者發(fā)生肝臟腫大[4];貴州省燃煤型砷中毒患者中約28.6%死于肝硬化[5];流行病學(xué)研究結(jié)果也表明肝硬化和肝癌是砷中毒患者主要的死亡原因[6];張露露等[7]觀察砷可以誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肝纖維化。肝纖維化是肝硬化的早期階段，并且有研究表明，肝硬化在肝纖維化階段有逆轉(zhuǎn)的可能[8]。但目前仍缺乏干預(yù)砷致肝損傷的臨床治療藥物，因此深入研究砷致肝纖維化發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)治療對砷中毒肝硬化防治有重要意義。

氧化苦參堿(oxymatrine, OM)是一種豆科植物提取物，具有抗病毒和抗腫瘤等功效。已有研究表明OM對心肌纖維化有一定的干預(yù)治療效果[9]。最近臨床研究表明觀察到氧化苦參堿對慢性病毒性肝炎有一定的療效[10];還有學(xué)者用OM作用于肝癌細(xì)胞后，檢測到其可以通過影響細(xì)胞的能量代謝而抑制細(xì)胞增殖[11];我們前期研究也檢測到OM對砷致肝細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，但其中機(jī)制尚不清楚。

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生及發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。各種損傷因素可通過直接或者間接作用引起HSC激活和增殖，合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)增多，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)沉積而發(fā)生肝纖維化[13]。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞重要的降解/回收系統(tǒng)，通過降解異常多余的蛋白質(zhì)以及受損細(xì)胞器，實現(xiàn)細(xì)胞器的更新以及營養(yǎng)物質(zhì)的回收利用，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，細(xì)胞自噬參與了多種疾病的病理過程。有學(xué)者觀察到在多種肝臟疾病的病理過程中有細(xì)胞自噬的參與,例如病毒性肝炎、酒精性肝炎和急性肝損傷等[14-15]。但有關(guān)砷致肝損傷和肝纖維化發(fā)生中細(xì)胞自噬的變化國內(nèi)外尚不清楚，OM干預(yù)砷致肝纖維化過程中對HSC自噬的研究也未見相關(guān)報道。為此，本實驗擬用人肝星狀細(xì)胞株LX-2為研究對象，觀察染砷損傷肝細(xì)胞培養(yǎng)上清對人肝星狀細(xì)胞株LX-2細(xì)胞活性及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討細(xì)胞自噬在砷致HSC活化中的作用，并觀察OM改善肝纖維化的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝星狀細(xì)胞株LX-2(中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；人胎肝細(xì)胞株LO2(中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)。亞砷酸鈉(分析純，Sigma)；氧化苦參堿(分析純，南京廣潤生物制品有限公司)；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、自噬相關(guān)基因12(autophagy-related gene 12，Atg12)、自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和β-肌動蛋白(β-actin)Ⅰ抗(Abcam)；MTT和DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)。全自動生化分析儀(Olympus)；全波長酶標(biāo)儀(Thermo)；垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)； 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

亞砷酸鈉染毒溶液的配制：精密稱取適量亞砷酸鈉溶于無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)中，過0.22 μm微孔濾膜制成亞砷酸鈉母液；染毒時稀釋使用。

氧化苦參堿溶液的配制：精密稱取適量氧化苦參堿溶于無菌PBS中，過0.22 μm微孔濾膜制成氧化苦參堿母液；使用時進(jìn)行稀釋。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胎肝細(xì)胞株LO2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

人肝星狀細(xì)胞株LX-2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2亞砷酸鈉上調(diào)LX-2細(xì)胞活性

2.2.1全自動生化分析儀檢測染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine ami-notransferase,ALT)水平 100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細(xì)胞24 h，細(xì)胞融合率達(dá)80%收取染砷LO2培養(yǎng)上清，低溫離心取上清，一部分使用全自動生化分析儀檢測AST和ALT水平，另一部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2MTT法檢測LX-2細(xì)胞活力 取對數(shù)期的LX-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個細(xì)胞均勻接種于96孔板中。將LX-2細(xì)胞分為對照組、LO2培養(yǎng)上清組及5%、10%、20%和30%染砷組，同時設(shè)置空白組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。待細(xì)胞融合率達(dá)65%左右時，進(jìn)行處理。將LO2正常培養(yǎng)上清與正常培養(yǎng)液按照3∶7比例混合后培養(yǎng)正常上清組LX-2細(xì)胞24 h，5%、10%、20%和30%染砷上清組分別按照相應(yīng)比例與正常培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)各組LX-2細(xì)胞24 h。棄培養(yǎng)液，加入MTT(5 g/L)每孔20μL后培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO于37 ℃顯色10 min。酶標(biāo)儀492 nm波長檢測吸光度(A)值。細(xì)胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.2.3ELISA檢測染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1 細(xì)胞培養(yǎng)及提取上清同上。加樣37 ℃孵育2 h，棄液體，生物素標(biāo)記抗體工作液37 ℃孵育1 h。棄液體并洗板甩干。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和工作液37 ℃孵育1 h。棄液體并洗板甩干。底物溶液37 ℃避光顯色20 min后加入終止液，5 min內(nèi)450 nm波長測量吸光度(A)值。

2.2.4Western blot檢測LX-2細(xì)胞活化情況 將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、LO2培養(yǎng)上清組、5%、10%和20%染砷組，培養(yǎng)方法同上。提取蛋白，10% SDS-PEGA蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Ⅰ抗[β-actin(1 ∶500)和α-SMA(1 ∶5 000)]，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入Ⅱ抗(1 ∶4 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL顯示特異性的條帶。

2.2.5分析間接染砷對LX-2細(xì)胞活性的影響 綜合2.2.2和2.2.4實驗結(jié)果，篩選出各間接染砷組中促進(jìn)LX-2細(xì)胞活化最為顯著的濃度，將此濃度作為后續(xù)實驗間接染砷組的藥物濃度。

2.3氧化苦參堿干預(yù)上調(diào)LX-2細(xì)胞活性

2.3.1MTT檢測不同濃度OM處理后LX-2細(xì)胞活力的變化 取對數(shù)期的LX-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個均勻接種于96孔板中。將細(xì)胞分為對照組、間接染砷組及0.1、0.25、0.5、1和1.5 g/L OM干預(yù)組，同時設(shè)置空白組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。待細(xì)胞融合率達(dá)65%左右時，進(jìn)行處理。采用20%染砷上清組培養(yǎng)方法培養(yǎng)間接染砷組及0.1、0.25、0.5、1和1.5 g/L OM干預(yù)組24 h。棄培養(yǎng)液，對照組和間接染砷組正常培養(yǎng)，各濃度OM干預(yù)組加入相應(yīng)濃度OM培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，加入MTT(5 g/L)后培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO于37 ℃顯色10 min。酶標(biāo)儀492 nm波長檢測吸光度(A)值。細(xì)胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.3.2Western blot檢測活化標(biāo)志蛋白及自噬相關(guān)蛋白 將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、間接染砷組、低劑量(0.25 g/L)OM干預(yù)組和高劑量(1 g/L)OM干預(yù)組。細(xì)胞融合率達(dá)65%時處理細(xì)胞，處理方法同2.3.1。收集細(xì)胞，提取蛋白。10%、15%SDS-PEGA蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Ⅰ抗[β-actin(1∶500)、α-SMA(1∶5 000)、Atg12(1∶3 000)、Atg5(1∶5 000)和LC3(1∶3 000)]，置4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL顯示特異性條帶。

2.3.3光學(xué)顯微鏡觀察油紅O染色 細(xì)胞分組及培養(yǎng)同2.3.2。棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定45 min后PBS漂洗，油紅O染色1 h，60%異丙醇漂洗10 s，PBS漂洗。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 亞砷酸鈉染毒LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST和ALT水平

100 μmol/L亞砷酸鈉作用于LO2細(xì)胞24 h，細(xì)胞融合率達(dá)80%時檢測培養(yǎng)上清中AST和ALT水平，結(jié)果顯示染砷組LO2培養(yǎng)上清中ALT和AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 亞砷酸鈉作用于LO2細(xì)胞24 h后培養(yǎng)上清中AST和ALT活性的變化

Table 1.The levels of AST and ALT in medium of LO2 cultured with arsenic for 24 h (Mean±SD.n=3)

NaAsO2 (μmol/L)AST (U/L)ALT (U/L)010.41±0.665.24±0.3410060.50±0.77*25.74±0.88*

*P<0.05vs0 μmol/L group.

2 亞砷酸鈉間接增強LX-2細(xì)胞活力及活化標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)

將未染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清按照3 ∶7比例與正常培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)LX-2細(xì)胞，染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清按5%、10%、20%和30%濃度加入LX-2細(xì)胞培養(yǎng)體系中，我們觀察到，與對照組相比較，LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清組及5%和10%染砷組細(xì)胞活力和活化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平均無顯著差異；20%染砷組與對照組相比較，細(xì)胞活力顯著增強(P<0.05)，活化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；30%染砷組與對照組相比較，細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 不同濃度染砷LO2培養(yǎng)上清刺激后LX-2細(xì)胞活力的變化

Table 2.The effect of arsenic on the viability of LX-2 cells (%.Mean±SD.n=3)

GroupLX-2 cell viabilityControl100.0Normal LO2100.0±2.55% As113.0±40.410% As113.0±40.420% As121.0±30.6*30% As59.7±20.9*

*P<0.05vscontrol group.

根據(jù)實驗結(jié)果分析，20%染砷組藥物刺激LX-2細(xì)胞活化的作用顯著，因此將此濃度作為后續(xù)實驗間接染砷的濃度。

3 染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1水平

100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細(xì)胞24 h，細(xì)胞融合率達(dá)80%培養(yǎng)上清中TGF-β1水平較對照組無顯著差異且呈陰性，見表3。

4 氧化苦參堿干預(yù)對間接染砷LX-2細(xì)胞活力的影響

不同濃度OM干預(yù)間接染砷LX-2細(xì)胞24 h，在濃度為0.1～1.5 g/L 范圍內(nèi)，LX-2細(xì)胞活力呈濃度依賴性下降(P<0.05)，見表4。

Figure 1.The protein expression of α-SMA in LX-2 cells cultred with different concentrations of arsenic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 不同濃度染砷LO2培養(yǎng)上清刺激LX-2細(xì)胞對α-SMA表達(dá)影響

表3 染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1水平

Table 3.The level of TGF-β1 in medium of LO2 cells cultured with arsenic (Mean±SD.n=3)

GroupA valueTGF-β1Normal LO20.116±0.202-As LO20.121±0.235-

-: negative.

表4 不同濃度OM對LX-2細(xì)胞活力的影響

Table 4.The effect of OM on the viability of LX-2 cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupLX-2 cell viabilityControl100.0As121.0±20.7*0.1 g/L OM92.0±43.6*0.25 g/L OM79.0±15.3*0.5 g/L OM70.0±15.3*1 g/L OM53.0±15.3*1.5 g/L OM43.0±20.0*

*P<0.05vscontrol group.

其中0.25和1 g/L OM干預(yù)組細(xì)胞相對活力分別約為80%和50%，后續(xù)實驗將0.25和1 g/L設(shè)為低、高劑量OM干預(yù)組藥物濃度。

5 氧化苦參堿干預(yù)對砷損傷肝細(xì)胞后間接刺激LX-2細(xì)胞活化過程中活化標(biāo)志蛋白和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組相比較，間接染砷組α-SMA、Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；低、高劑量OM干預(yù)后LX-2細(xì)胞α-SMA、Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ較間接染砷組顯著下調(diào)(P<0.05)，且高劑量OM干預(yù)組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平較低劑量OM干預(yù)組顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of α-SMA, Atg12, Atg5 and LC3-Ⅱ in activated LX-2 cells cultred with different concentrations of OM. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAs group;△P<0.05vslow-dose OM group.

圖2 OM干預(yù)對間接染砷LX-2細(xì)胞的α-SMA、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

6 氧化苦參堿干預(yù)對砷損傷肝細(xì)胞后間接刺激LX-2細(xì)胞過程中脂滴變化的影響

與對照組相比，間接染砷組脂滴顯著減少，而低、高劑量OM干預(yù)組脂滴數(shù)量較間接染砷組顯著增加，見圖3。

Figure 3.Lipid droplets in LX-2 cells were observed by oil red O staining. Scale bar=100 μm. A: control group; B: As group; C: low-dose OM group; D: high-dose OM group.

圖3 各組油紅O染色脂滴

討 論

砷致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，特別是砷致HSC活化的機(jī)制是砷的直接還是間接作用國內(nèi)外尚無定論。本項工作采用100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細(xì)胞24 h，觀察砷致肝細(xì)胞損傷后對LX-2細(xì)胞活化及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。在本實驗中，染砷24 h LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST和ALT含量較正常培養(yǎng)LO2細(xì)胞顯著增高，AST和ALT是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，提示100 μmol/L亞砷酸鈉染毒24 h后存在LO2細(xì)胞損傷。使用染砷LO2細(xì)胞培養(yǎng)上清按照1 ∶4比例與正常培養(yǎng)液混合后共孵育LX-2細(xì)胞24 h后，檢測到其細(xì)胞增殖率及活化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示砷可通過損傷肝細(xì)胞間接促進(jìn)HSC活化。因此，減輕砷致肝細(xì)胞損傷應(yīng)該是改善砷致肝纖維化的有效途徑之一。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞通過溶酶體降解自身錯誤、異常蛋白或細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的代謝過程。自噬體膜的延伸以及閉合主要依賴2個泛素系統(tǒng)，即Atg12和LC3，其中Atg12與Atg5結(jié)合后形成Atg12-Atg5復(fù)合物，此復(fù)合物是自噬泡的雙層骨架結(jié)構(gòu)。目前，細(xì)胞自噬相關(guān)的研究主要集中在LC3這一系統(tǒng)中，但對于Atg12這一泛素化系統(tǒng)研究甚少。研究表明，細(xì)胞自噬發(fā)生時，LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著上調(diào)[16]，故現(xiàn)階段多將LC3-Ⅱ表達(dá)水平的變化作為判斷細(xì)胞自噬發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)。Virginia等[17]檢測到在HSC活化過程中LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著升高，提示細(xì)胞自噬參與了HSC活化，但在此活化過程中Atg12系統(tǒng)的變化并未觀察。本研究在染砷間接活化LX-2細(xì)胞后，不僅觀察了LC3-Ⅱ的表達(dá)變化，還檢測了Atg12和Atg5表達(dá)水平的變化。我們檢測到間接染砷組LX-2細(xì)胞除了α-SMA表達(dá)水平顯著增加外，自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示細(xì)胞自噬Atg12和LC3 2個泛素化系統(tǒng)均參與了砷間接致HSC活化的過程。使用低、高劑量OM干預(yù)間接染砷活化的LX-2細(xì)胞24 h后，檢測到低、高劑量OM干預(yù)組細(xì)胞活力、活化標(biāo)志蛋白α-SMA以及自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達(dá)水平較間接染砷組均顯著下調(diào)，且高劑量OM干預(yù)組LX-2細(xì)胞的自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平下降較低劑量OM干預(yù)組更為顯著，提示低、高劑量OM干預(yù)均可抑制間接染砷致HSC活化,且可能與干預(yù)細(xì)胞自噬的過程有關(guān)。

Wallace等[18]提出在HSC活化的過程中，肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷分泌的細(xì)胞因子、肝細(xì)胞的凋亡小體、內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TGF-β等可促進(jìn)HSC激活。為明確間接染砷活化HSC的原因，我們進(jìn)一步用ELISA對染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量進(jìn)行檢測，但并未觀察到染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平較對照組有顯著變化，提示在染砷損傷肝細(xì)胞間接致HSC活化及影響細(xì)胞自噬的機(jī)制中可能與TGF-β1并無直接關(guān)系。

近年來，有研究認(rèn)為細(xì)胞自噬可降解儲存在HSC細(xì)胞內(nèi)的脂滴，從而為HSC活化提供能量[17，19]。本研究以油紅O染色觀察染砷間接致HSC活化及OM干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化。我們觀察到染砷間接活化LX-2細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量較對照組細(xì)胞顯著減少，而經(jīng)低、高劑量OM干預(yù)24 h后LX-2細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量較間接染砷組顯著增多，提示染砷間接活化HSC細(xì)胞中的細(xì)胞自噬水平顯著增加，有可能通過降解儲存在HSC細(xì)胞中的脂滴為活化提供能量，促進(jìn)HSC活化，而OM干預(yù)可能通過抑制這一過程達(dá)到減少HSC活化、減輕肝纖維化的效果。