羅剛，王杰，陳婷婷，劉林海，賴(lài)松家

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，成都 611130）

隨著生活水平的不斷提高，人們的消費(fèi)價(jià)值觀(guān)也發(fā)生了很大的變化，在追求營(yíng)養(yǎng)和健康的同時(shí)，食用動(dòng)物的肉質(zhì)和口感也成了人們新的關(guān)注點(diǎn)。兔肉是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的肉食品，其高蛋白、低脂肪的特性使其具有“保健肉”的美稱(chēng)。截至目前，與兔肉品質(zhì)有關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道；而在其他動(dòng)物上的研究表明：pH值是反映豬肉生化變化的重要指標(biāo)，對(duì)豬肉的顏色、嫩度、保水性和肌纖維水分分布[1]有顯著影響，pH值越高，蒸煮損失越小[2]；對(duì)羊肉研究表明，烹調(diào)損失越小，出品率越高，肌肉系水力也會(huì)越好［3］；同時(shí)，系水力越高，肉質(zhì)越好在豬肉中也有報(bào)道[4]。滴水損失是衡量系水力高低的指標(biāo)之一，肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat,IMF）含量與豬肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味高度相關(guān)[5]。瘦蛋白基因（leptin）參與調(diào)節(jié)攝食、基礎(chǔ)代謝和胴體脂肪含量，在維持體質(zhì)量方面起著重要作用。豬血清中瘦蛋白濃度大小與脂肪組織的沉積有關(guān)[6]；血清瘦蛋白濃度與牛胴體的大理石花紋、背膘厚[7-8]，豬的心腎脂肪含量、肌內(nèi)脂肪含量[9]，綿羊的脂肪沉淀和肉品質(zhì)呈極顯著相關(guān)性[7-10]。張志宏等的研究表明，瘦蛋白水平跟豬脂肪leptinmRNA表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪含量與leptinmRNA表達(dá)量極顯著相關(guān)（P＜0.01）[9]?？傊?，近幾年的研究結(jié)果表明，leptinmRNA表達(dá)量與肉質(zhì)關(guān)系密切，可作為評(píng)定肉質(zhì)的特殊指標(biāo)，但未見(jiàn)leptin基因在家兔肉質(zhì)方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了家兔的不同組織leptin基因的表達(dá)量，分析了其與肌內(nèi)脂肪、熟肉率、pH值、滴水損失等肉質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性，以期為家兔的肉質(zhì)育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)兔場(chǎng)健康無(wú)病的齊卡兔[齊卡大型新西蘭白兔（N系）]作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別選取35、70、84和91日齡4個(gè)階段的公、母兔各6只，共計(jì)48只。在無(wú)菌條件下分別采集左后腿肌組織、左腎周脂肪組織和皮下脂肪組織，立即投入液氮中保存，以備提取總RNA。采集4個(gè)日齡階段腿肌組織各5份，其中：1份保存在－20℃環(huán)境下以測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量，2份用來(lái)測(cè)定pH值，其他2份保存在4℃環(huán)境下以測(cè)定熟肉率和滴水損失。所有實(shí)驗(yàn)操作都嚴(yán)格按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范與福利管理委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范》（川農(nóng)大校發(fā)〔2014〕18號(hào)）進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pH值的測(cè)定

根據(jù)BLASCO等[5]的方法，分別在公、母兔宰后45 min和24 h采用便攜式可插入pH計(jì)測(cè)定其pH值。

1.2.2 熟肉率的測(cè)定

稱(chēng)取10 g左右（記為mm1）的肌肉在沸水中蒸煮30 min，然后掛到陰涼處，30 min后稱(chēng)量并記為mm2。

熟肉率=mm2／mm1×100%.

1.2.3 滴水損失的測(cè)定

測(cè)量前將肉樣稱(chēng)量（記為md1），然后用金屬鉤將肉樣懸吊，外套一個(gè)自封袋，袋口系緊；袋內(nèi)留有足夠空間以接納肉樣滲出的水滴。在4℃冰箱中懸掛24 h后除去塑料袋，用濾紙吸去肉樣表面水分并稱(chēng)量（記為md2），計(jì)算肉樣質(zhì)量減少的百分率，即滴水損失。

滴水損失=(md1－md2)/md1×100%.

1.2.4 肌內(nèi)脂肪的測(cè)定

采用索氏抽提法，參照GB／T 50096－2003《食品中脂肪的測(cè)定》測(cè)定肌肉脂肪含量。將肉樣從冰箱取出，放于4℃環(huán)境下解凍12 h后，剁成肉末，然后放到105℃烘箱中脫水至恒量，冷卻，粉碎。精確稱(chēng)取1.0 g經(jīng)研細(xì)干燥的樣品（記為mf），無(wú)損地移入濾紙筒內(nèi)，把濾紙和樣品放入105℃烘箱中脫水至恒量，稱(chēng)量二者的總質(zhì)量（記為mf1），然后將濾紙筒放入索氏提取器的提取筒內(nèi)，由冷凝管的上端加入無(wú)水乙醚，至接受器內(nèi)的無(wú)水乙醚量為瓶體積的2/3時(shí)，于水浴鍋內(nèi)加熱，回流提取6 h，最后，取下接受器，把濾紙筒放到105℃烘箱中烘干至恒量，冷卻后稱(chēng)量（記為mf2）。

1.2.5 總RNA的提取及其純度檢測(cè)

用重慶拓世眾和生物技術(shù)有限公司的Magen試劑盒提取總RNA，通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，用D260nm/D280nm和D260nm/D230nm的比值鑒定樣品純度。

1.2.6 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent kit）把總RNA合成cDNA第一鏈，然后用以上cDNA為模板，用熒光定量試劑盒SYBR?Prime ScriptTMⅡ[生工生物工程（上海）股份有限公司]進(jìn)行熒光定量分析，總反應(yīng)體系為 10 μL，其中：cDNA 模板 1 μL，SYBR?Prime Ex TapTMⅡ 5 μL，上、下游引物各 0.4 μL，無(wú)RNase dH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，61.4℃退火30 s；熔解曲線(xiàn)溫度從65℃上升到95℃，升溫速率為0.5℃/s，39個(gè)循環(huán)。對(duì)所有的樣本重復(fù)測(cè)定3次并在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)立對(duì)照組，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中家兔基因leptin和βactin的編碼區(qū)序列（coding sequences,CDs），用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction,qRT-PCR）引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用2－△△CT法測(cè)定leptin基因的相對(duì)表達(dá)量，利用SAS 9.2軟件中GLM過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用CORR過(guò)程計(jì)算相關(guān)系數(shù)和檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 leptin基因在各組織中表達(dá)量的變化規(guī)律

由圖1可知，當(dāng)齊卡兔為35日齡時(shí)，leptin基因在公、母兔的腎周脂肪、皮下脂肪和腿肌中的表達(dá)量都沒(méi)有顯著差異。在腎周脂肪中，70、84和91日齡母兔leptin基因的表達(dá)量都極顯著高于公兔的（P＜0.01）（圖1A）。在皮下脂肪中，91日齡公兔leptin基因表達(dá)量極顯著高于母兔的（P＜0.01），70和84日齡公兔leptin基因表達(dá)量顯著高于母兔的（P＜0.05）（圖1B）。在腿肌中，70和84日齡母兔leptin基因表達(dá)量顯著高于公兔的（P＜0.05）（圖1C）。綜上表明，在不同日齡的3個(gè)組織中，腎周脂肪和腿肌中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量在母兔中高于公兔，在皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量在公兔中高于母兔。

2.2 不同日齡齊卡兔腿肌的肉質(zhì)變化規(guī)律

由表2可知，隨著齊卡兔日齡的增大，熟肉率和肌內(nèi)脂肪含量逐漸增大，而滴水損失逐漸減小。其中：70日齡的齊卡兔肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于35日齡的（P＜0.01），而滴水損失極顯著低于35日齡的（P＜0.01）；84日齡的齊卡兔肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于70日齡的（P＜0.01），但滴水損失極顯著低于70日齡的（P＜0.01）；91日齡齊卡兔的滴水損失和84日齡齊卡兔的差異不顯著，但91日齡的齊卡兔肌內(nèi)脂肪含量顯著高于84日齡的（P＜0.05）；70日齡和35日齡公兔的熟肉率差異不顯著，但70日齡母兔的熟肉率顯著高于35日齡的（P＜0.05），84日齡的所有家兔的熟肉率極顯著高于70日齡的（P＜0.01），91日齡的極顯著高于84日齡的（P＜0.01）。

由表3可知，屠宰后45 min，齊卡兔的pH值隨著日齡的增大而增大；屠宰后24 h，pH值先增大后減小。84日齡是屠宰后45 min和24 h時(shí)pH值差值最小的時(shí)間段。

總之，肌內(nèi)脂肪、滴水損失和pH值在91日齡和84日齡的差異都比較小，且91日齡屠宰后45 min和24 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH值差值太大會(huì)影響家兔肉質(zhì)，因此，建議家兔屠宰的合理時(shí)間為84日齡。

2.3 齊卡兔leptin基因表達(dá)量與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

由表4可知：84日齡母兔皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量和腿肌中肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)系數(shù)為0.95，呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與熟肉率的相關(guān)系數(shù)為0.83，呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與屠宰后24 h的pH值的相關(guān)系數(shù)為0.67，呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。公兔熟肉率與皮下脂肪、腎周脂肪中l(wèi)eptin基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)分別為－0.90和－0.89，呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；公兔腿肌在屠宰后24 h的pH值與腿肌中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為－0.85。

A.腎周脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量；B.皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量；C.腿肌中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量。*表示在P＜0.05水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**表示在P＜0.01水平差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A.Expression level of leptin gene in perirenal fat;B.Expression level of leptin gene in subcutaneous fat;C.Expression level of leptin gene in leg muscle.Single asterisk(*)indicates statistically significant differences at the 0.05 probability level;double asterisks(**)indicate statistically highly significant differences at the 0.01 probability level.

表2 不同日齡齊卡兔的熟肉率、肌內(nèi)脂肪含量和滴水損失Table 2 Cooked meat rate,intramuscular fat content and drip loss of Zika rabbits at different days of age %

表3 不同日齡齊卡兔屠宰后肌肉的pH值Table 3 pH values of muscle after slaughter of Zika rabbits at different days of age

3 討論

瘦蛋白作為一種脂肪細(xì)胞分泌因子，在調(diào)控脂肪沉積與代謝方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，血清瘦蛋白含量與體內(nèi)脂肪含量呈正比：當(dāng)脂肪含量增加時(shí)，脂肪組織瘦蛋白分泌會(huì)增多，其在組織中的表達(dá)量也會(huì)增加［11］。在本研究中，隨著齊卡兔日齡的增加，leptin基因的表達(dá)量在各組織中均升高，說(shuō)明家兔在生長(zhǎng)過(guò)程中，肌肉和脂肪組織中的脂肪含量都在提高，與KOLSTAD在豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的研究結(jié)果一致，即在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育階段，其體內(nèi)總的脂肪含量隨著其年齡的增加逐漸增加[12]，且leptin基因表達(dá)量在腎周脂肪和腿肌中母兔高于公兔，在皮下脂肪中公兔高于母兔。

表4 84日齡齊卡兔leptin基因表達(dá)水平與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of expression levels of leptin gene with meat quality traits in the 84 day-old Zika rabbit

瘦蛋白可以通過(guò)胰腺、肝、骨骼肌調(diào)節(jié)糖和脂肪酸代謝，同時(shí)還作用于下丘腦的多個(gè)神經(jīng)核團(tuán)，影響人和動(dòng)物的攝食量、能量平衡、脂肪沉積[13]。瘦蛋白既可以促進(jìn)三酰甘油的分解，又可以抑制脂肪酸合成酶的表達(dá)，還可以通過(guò)增加能量消耗來(lái)介導(dǎo)乙酰輔酶A羧化酶基因的表達(dá)，從而抑制脂肪的生成[14]。肌內(nèi)脂肪是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)。研究表明：脂類(lèi)物質(zhì)的氧化是肉香味形成的重要途徑，通過(guò)加熱，脂質(zhì)發(fā)生熱降解和氧化降解，形成不飽和羰基化合物（醛和酮），使肉呈特殊香味[15]。在本研究中，齊卡兔leptin基因的表達(dá)量在皮下脂肪中前期增長(zhǎng)較慢，但在腎周脂肪中前期增長(zhǎng)較快，這與KOUBA等在豬的研究上得到的皮下脂肪發(fā)育比較緩慢、腎周脂肪生長(zhǎng)比較迅速的結(jié)果[16]相一致。母兔的肌內(nèi)脂肪含量和皮下脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（r=0.95，P＜0.01)，說(shuō)明leptin基因?qū)?nèi)脂肪有很大的影響。屠宰后pH值迅速下降，呈弱酸性狀態(tài)，這是肌糖原無(wú)氧酵解和乳酸積累的結(jié)果。在本研究中，母兔皮下脂肪leptin基因的表達(dá)量與屠宰后24 h腿肌的pH值呈顯著正相關(guān)（r=0.67，P＜0.05）。賈小翠等的實(shí)驗(yàn)表明，肉雞宰后pH值的下降會(huì)導(dǎo)致肌肉系水能力降低[17]；鄭云林等研究表明，系水力越低，豬肉質(zhì)越差[4]。在本研究中，屠宰后24 h的pH值越高肉質(zhì)越好的結(jié)果與上述研究相一致。蒸煮損失與系水力緊密相關(guān)，對(duì)出肉率有很大影響[18]；系水力越高，熟肉率越高，從而可以更好地改善肉的嫩度、風(fēng)味、滋味、外觀(guān)和多汁性[19]。

綜上所述，齊卡兔的性別和日齡對(duì)leptin基因的表達(dá)影響顯著。母兔的腎周脂肪和腿肌中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量高于公兔，而公兔皮下脂肪中l(wèi)eptin表達(dá)量高于母兔。并且，本研究表明：84日齡家兔pH值在屠宰后下降速度最慢，所以84日齡家兔的肉質(zhì)最好，是齊卡兔較為適宜的屠宰日齡；此外，母兔熟肉率和皮下脂肪中l(wèi)eptin基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r=0.83，P＜0.05），且母兔皮下脂肪leptin基因的表達(dá)量與屠宰后24 h腿肌的pH值呈顯著正相關(guān)（r=0.67，P＜0.05）；公兔熟肉率與皮下脂肪和腎周脂肪中l(wèi)eptin基因的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.90，P＜0.01；r=－0.89，P＜0.01）。說(shuō)明leptin基因可能參與家兔肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，可以作為研究家兔肉質(zhì)的一個(gè)候選基因，從而為采用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)和開(kāi)展肉兔的遺傳改良提供參考。