竇錫彬 藍(lán)凰齊， 黃小珊 唐漢慶 李克明 王露瑤 林起慶

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色市 533000，電子郵箱：doctordxb@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001)

木姜子為樟科植物山雞椒的干燥根和根莖，具有較強(qiáng)的抗炎抑菌、提高免疫功能的作用[1]。忍冬藤為忍冬科植物忍冬的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效，以及較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、提高免疫功能的作用[2-3]，同時(shí)其對(duì)平滑肌有舒張作用[4]因而具有解痙作用。壯族民間用米酒浸泡的木姜子和忍冬藤有溫通經(jīng)絡(luò)、止咳平喘、補(bǔ)肺益腎、扶正固本的作用，常用于哮喘的治療。但關(guān)于其治療哮喘的機(jī)制，尚未有研究報(bào)告。研究表明，氣道重塑是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制，涉及氣道的結(jié)構(gòu)細(xì)胞如氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell，ASMC)的變化[5]。而ASMC既是氣道炎癥的靶細(xì)胞，也是氣道重塑的效應(yīng)細(xì)胞，在氣道重塑過(guò)程中占有重要地位，ASMC的增殖、凋亡是引發(fā)氣道結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)改變及最終氣道重塑的潛在變化因素。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物對(duì)ASMC增殖、凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 木姜子購(gòu)自廣西仁濟(jì)堂中藥飲片公司(批號(hào)：151101)，忍冬藤購(gòu)自廣西張益堂中藥飲片有限公司(批號(hào)：1602092)。將木姜子和忍冬藤按照質(zhì)量1 ∶1的比例，放到適量70%食用乙醇里浸泡。1周后，放入回流裝置中，加熱回流1 h，過(guò)濾，濾渣再加入適量的70%乙醇，再次加熱回流1 h，過(guò)濾后合并兩次濾液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇并濃縮，濃縮液放入真空干燥箱70℃干燥，得到乙醇提取物粉末。取乙醇提取物粉末溶于水，分別配制成5.65 μg/mL、11.3 μg/mL、22.6 μg/mL濃度的試驗(yàn)藥物。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑 ASMC由武漢博士德生物醫(yī)藥公司提供。杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基/漢氏F-12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium/Ham′s nutrient mixture F12,DMEM/F12)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、胎牛血清購(gòu)自凱基生物科技公司(批號(hào)：11320-033、33210-057、10091-148)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 購(gòu)自Biosharp公司(批號(hào)：0793)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( transforming growth factor β1，TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、IL-13、IL-17酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(批號(hào)：EMC107b.48、EMC103.48、PL2001420、PL2001425、PL2001432)，以及B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)、β-肌動(dòng)蛋白鼠源一抗、兔抗鼠二抗由欣博盛生物科技有限公司提供(批號(hào)：HCA310A、HCA310P)；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由上海翊圣生物科技有限公司提供(批號(hào)：40308ES20)。

1.3 主要儀器 MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；RE-5210A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Labsystems公司)；DU530型紫外分光光度儀(美國(guó)Beckman公司)；PowerPac HC型電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將ASMC加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，靜置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞逐漸匯合達(dá)80%以上，進(jìn)行首次傳代，加入胰蛋白酶，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞邊緣透亮、胞質(zhì)回縮現(xiàn)象時(shí)，吸棄胰蛋白酶，終止消化。取細(xì)胞懸液，加入DMEM/F12培養(yǎng)基按1 ∶2或1 ∶3密度接種傳代培養(yǎng)，每3 d換液傳代1次。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ASMC，胰酶消化后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整到5×104個(gè)細(xì)胞/mL，接種于96孔板(100 μL/孔)，同時(shí)設(shè)空白孔，37℃培養(yǎng)過(guò)夜(在96孔板周圍孔內(nèi)加入100 μL無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步)。隨后將細(xì)胞分為5組，加入相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)：(1)空白對(duì)照組(空白組)，加入1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培養(yǎng)基10 μL；(2)PDGF誘導(dǎo)模型組(模型組)，加入20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培養(yǎng)基10 μL；(3)低濃度組，加入5.65 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL +1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培養(yǎng)基10 μL；(4)中濃度組，加入11.3 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培養(yǎng)基10 μL；(5)高濃度組，加入22.6 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培養(yǎng)基10 μL。

1.4.2 細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)：各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、36 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(A值)，以模型組為參照，計(jì)算增殖抑制率。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。增殖抑制率=(模型組A值-各組A值)/模型組A值×100%。

1.4.3 細(xì)胞凋亡的觀察：各組細(xì)胞放入37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛溶液室溫固定1 h，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，5 min/次，滴加TUNEL反應(yīng)液，按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明步驟進(jìn)行操作，最后在顯微鏡下觀察、拍片。凋亡細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光、核固縮。

1.4.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)：各組細(xì)胞放入37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液清洗2 次，加細(xì)胞裂解液，冰浴裂解30 min，4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液即為蛋白質(zhì)溶液，二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量后，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h后，分別加入Bcl-2、Caspase-3、β-肌動(dòng)蛋白鼠源一抗(1 ∶500),4℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗3次，加入兔抗鼠二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育 2 h，1×TBST 洗 3 次，用電化學(xué)發(fā)光試劑顯色并曝光，凝膠系統(tǒng)拍片。將結(jié)果圖像輸入電腦，利用圖像分析軟件檢測(cè)條帶的灰度值(條帶面積×條帶密度)。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，以各目的蛋白條帶灰度值/β-肌動(dòng)蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)量。

1.4.5 TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平檢測(cè)：取各組細(xì)胞放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組ASMC增殖抑制率比較 各組ASMC增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=345.214，P組間<0.001)，各濃度組的抑制率均高于模型組(均P<0.05)，且低濃度組、中濃度組、高濃度組的抑制率依次升高(均P<0.05)；抑制率有隨時(shí)間增加的趨勢(shì)(F組間=624.541，P組間<0.001)；時(shí)間與分組有交互作用(F交互=62.418，P交互<0.001)。見表1。

表1 各組ASMC增殖抑制率比較(x±s)

注：與模型組比較，*P<0.05；與低濃度組比較，#P<0.05；與中濃度組比較，aP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 空白組和模型組在觀察的視野內(nèi)沒(méi)有見到凋亡細(xì)胞，低濃度組可以觀察到有部分細(xì)胞凋亡和核固縮現(xiàn)象，中濃度組和高濃度組可以觀察到凋亡細(xì)胞增多，核固縮、核碎裂凋亡特征增多。見圖1。

空白組 模型組 低濃度組 中濃度組 高濃度組

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況

2.3 各組凋亡蛋白Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平的比較 與空白組比較，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低而Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，各濃度組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。見表2和圖2。

表2 各組Caspase-3和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖2 各組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況

注：A、B、C、D、E分別為空白組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。

2.4 各組細(xì)胞因子水平的比較 與空白組比較，模型組TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，各濃度組TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均有不同程度降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平比較(x±s，pg/mL)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3討 論

哮喘是嚴(yán)重威脅人類健康的常見變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病與遺傳、環(huán)境等因素密切相關(guān)[6]。哮喘主要病理特征是氣道炎癥以及氣道重塑[7]。全球哮喘防治倡議將吸入性糖皮質(zhì)激素作為哮喘治療的常用藥物[8]，其控制氣道炎癥的效果值得肯定，但對(duì)氣道重塑、降低氣道高反應(yīng)性的效果仍需要長(zhǎng)期觀察。因此，對(duì)于氣道重塑的機(jī)制尚需要持續(xù)深入的研究。氣道重塑是氣道壁結(jié)構(gòu)的病理性改變，是引起哮喘反復(fù)發(fā)作、病程遷延的重要原因，其中ASMC的病理改變是氣道壁增厚和結(jié)構(gòu)異常的重要因素[9]，在氣道重塑發(fā)生機(jī)制中具有重要作用。ASMC的病理改變主要表現(xiàn)為過(guò)度增殖、凋亡減少、合成分泌功能活躍等。因此，靶向干預(yù)ASMC病理改變從而抑制氣道重塑成為潛在的治療哮喘的策略。

研究表明，ASMC過(guò)度增殖是引起氣管狹窄和氣道重塑的主要因素[10]。PDGF是一種重要的促有絲分裂因子，可刺激ASMC增殖，PDGF誘導(dǎo)的ASMC增殖模型已被廣泛用于哮喘氣道重塑機(jī)制的研究。因此，本研究應(yīng)用PDGF建立ASMC增殖模型，觀察木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物對(duì)氣道重塑的干預(yù)效果及其可能機(jī)制。結(jié)果顯示，各濃度組的細(xì)胞增殖抑制率均高于模型組，低濃度組、中濃度組、高濃度組的抑制率依次升高，且抑制率均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高(均P<0.05)，這提示不同濃度的木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物對(duì)ASMC增殖均有抑制作用，且呈一定的濃度及時(shí)間依賴性。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2通路是引起ASMC增殖的重要通路，而IL-17通過(guò)ERK1/2通路與ASMC上的IL-17受體結(jié)合，促進(jìn)ASMC的增殖。研究表明抑制IL-17、IL-4、IL-13可緩解氣道炎癥，減輕PDGF誘導(dǎo)的ASMC增殖[11]。ASMC具有很強(qiáng)的合成分泌功能，通過(guò)分泌TGF-β1、VEGF并升高IL-17水平而促進(jìn)ASMC的增殖，而降低TGF-β1和VEGF水平可抑制IL-17水平，從而減輕氣道炎癥和哮喘發(fā)作[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，各濃度組TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均有不同程度降低(均P<0.05)。這提示木姜子和忍冬藤配伍醇提取物可抑制ASMC分泌TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17等細(xì)胞因子，從而抑制細(xì)胞增殖。

ASMC增殖與凋亡緊密相關(guān)。ASMC的過(guò)度增殖和凋亡減少均可引起氣道壁增厚，導(dǎo)致氣道重塑?？沟蛲龅鞍譈cl-2和凋亡蛋白Caspase-3是調(diào)控ASMC增殖的關(guān)鍵因子[14-15]。本研究中，低濃度組可以觀察到有部分細(xì)胞凋亡和核固縮現(xiàn)象，中濃度組和高濃度組可以觀察到凋亡細(xì)胞增多，核固縮、核碎裂等凋亡特征明顯，這表明木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物可以誘導(dǎo)ASMC凋亡。此外，與空白組比較，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低而Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，各濃度組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。因此，推測(cè)木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物可能通過(guò)促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而誘導(dǎo)ASMC 凋亡。

綜上所述，木姜子和忍冬藤配伍醇提取物可抑制ASMC增殖，并可誘導(dǎo)ASMC凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)、抑制抗凋亡蛋白表達(dá)以及降低相關(guān)細(xì)胞因子水平有關(guān)。