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        一測多評法用于忍冬藤多成分含量測定的適用性研究

        2018-01-05 11:12:04田偉甄亞欽王鑫國田宇柔李軍山牛麗穎
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2018年11期
        關(guān)鍵詞:忍冬藤綠原酸質(zhì)量評價

        田偉 甄亞欽 王鑫國 田宇柔 李軍山 牛麗穎

        摘要:目的 建立一測多評法同時測定忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分含量的方法,并驗證該法在忍冬藤質(zhì)量控制中應(yīng)用的可行性與適用性。方法 以綠原酸為內(nèi)參物,采用Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.4%磷酸,梯度洗脫,流速為1 mL/min,綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C檢測波長為327 nm,馬錢苷檢測波長為236 nm,柱溫35 ℃。結(jié)果 建立了忍冬藤中綠原酸與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對校正因子;一測多評法的計算值與外標法實測值無明顯差異。結(jié)論 一測多評的質(zhì)量控制模式可用于忍冬藤中6種不同成分的多指標同步質(zhì)量評價。

        關(guān)鍵詞:一測多評;相對校正因子;綠原酸;忍冬藤;質(zhì)量評價

        DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.017

        中圖分類號:R284.1 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2018)11-0077-06

        Abstract: Objective To establish a QAMS method for content determination of six compositions (chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and loganin) from Lonicerae Japonicae Caulis; To verify the feasibility and applicability of this method in quality control of Lonicerae Japonicae Caulis. Methods Chlorogenic acid was set as internal reference substance. The HPLC analysis was performed on a Waters Symmetry C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid solution in gradient elution manner at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃, and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid, caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and 236 nm for loganin. Results The relative correction factors of caffeic acid, cryptochlorogenin acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C and loganin were established; there was no obvious difference between calculated value of QAMS and measured value of external standard method. Conclusion The quality control mode of QAMS can be used for multi-index synchronization quality evaluation of the six compositions from Lonicerae Japonicae Caulis.

        Keywords: QAMS; relative correction factors; chlorogenic acid; Lonicerae Japonicae Caulis; quality evaluation

        忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝,具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)功效,用于溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍、風(fēng)濕熱痹、關(guān)節(jié)紅腫熱痛[1]。忍冬是我國傳統(tǒng)藥用植物,具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等多種藥理作用[2]?!侗静菥V目》云:“忍冬,莖葉同花,功用皆同?!苯疸y花是忍冬的干燥花蕾或帶初開的花,在中藥制劑、茶飲、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,因需求量大,出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。忍冬藤資源豐富、價格便宜,具有良好的開發(fā)前景。

        忍冬藤含有有機酸、環(huán)烯醚萜苷、黃酮等多類成分[3-4],2015年版《中華人民共和國藥典》僅將馬錢苷和綠原酸作為忍冬藤的含量測定指標成分,不能完全反映該藥材的真實品質(zhì)。一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single marker,QAMS)是利用中藥中有效成分函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,通過測定1個有效成分(性質(zhì)穩(wěn)定且易得到的對照品)實現(xiàn)多個成分(性質(zhì)不穩(wěn)定且難得到的對照品)的同時測定,該方法快速、簡便,是一種符合中藥多成分特點的多指標質(zhì)量評價模式,已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制中[5]。為了對忍冬藤進行多指標控制,本研究以綠原酸為內(nèi)參物,對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷QAMS同步測定的可行性與適用性進行探討與評價。

        1 儀器與試藥

        島津高效液相色譜儀,包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測器、SIL-10AF自動進樣器、CTO-15C柱溫箱、島津LC色譜工作站;美國賽默飛公司Ultimate 3000高效液相色譜儀,包括低壓三元梯度泵、自動進樣器、DAD檢測器、變色龍色譜工作站;沃特世e2695高效液相色譜儀,包括低壓四元梯度泵、自動進樣器、2489紫外檢測器、Empower 3色譜工作站;色譜柱為Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Wondasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);電子天平(TB-215D,德國賽多利斯);KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)。

        綠原酸對照品(批號PY20170216,純度99.96%)、隱綠原酸對照品(批號PY20170224,純度99.79%)、異綠原酸C對照品(批號PY20170303,純度91.88%)、馬錢苷對照品(批號PY20170108,純度99.31%),南京普怡生物科技有限公司;咖啡酸對照品(批號110885-200102,純度100.00%)、異綠原酸A對照品(批號111782-201405,純度92.00%),中國食品藥品檢定研究院,乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

        20批忍冬藤樣品中15批由神威藥業(yè)集團有限公司提供,另5批分別購自石家莊樂仁堂、新興藥房、德濟堂、梔子藥房、百醫(yī)堂,經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝,編號為1~20。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 分析方法的建立和驗證

        2.1.1 色譜條件

        色譜柱為Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸(B),梯度洗脫(0~30 min,7%A;30~32 min,7%~10%A;32~44 min,10%A;44~50 min,10%~21%A;50~60 min,21%~34%A;60~65 min,34%A);流速1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長:綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C為327 nm,馬錢苷為236 nm;進樣量10 ?L。色譜圖見圖1。

        2.1.2 對照品溶液的制備

        分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷對照品適量,加50%甲醇制成濃度分別為0.097 9、0.020 6、0.007 5、0.054 4、0.021 3、0.169 8 mg/mL的混合對照品溶液。

        2.1.3 供試品溶液的制備

        取忍冬藤粉末(過3號篩)約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得。

        2.1.4 方法學(xué)考察

        2.1.4.1 線性關(guān)系考察

        分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液2、4、6、10、15、20 ?L注入液相色譜儀,測定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷峰面積,以峰面積為縱坐標,對照品進樣量(μg)為橫坐標,繪制標準曲線,結(jié)果見表1。綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

        2.1.4.2 精密度試驗

        精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液10 ?L,連續(xù)進樣6次,計算綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為0.23%、0.28%、0.42%、0.23%、0.10%、0.18%,表明儀器精密度良好。

        2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗

        精密吸取同一供試品溶液,分別于配制后0、2、4、6、10、16 h進樣10 ?L,測得綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為1.85%、1.68%、1.57%、1.91%、1.66%、1.08%,表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.1.4.4 重復(fù)性試驗

        取同一批號忍冬藤樣品6份,每份約1 g,精密稱定,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,分別測定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積,計算含量的RSD分別為1.56%、1.08%、1.27%、1.46%、1.17%、0.83%,表明本方法重復(fù)性良好。

        2.1.4.5 加樣回收率試驗

        取已知含量的樣品粉末9份,每份約0.5 g,精密稱定,置25 mL容量瓶中,分別按各成分含量的80%、100%、120%精密加入綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的對照品貯備液,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率及RSD,結(jié)果見表2~表7。表明本方法的準確度良好。

        2.2 相對校正因子的確定

        2.2.1 相對校正因子的計算

        取“2.1.2”項下混合對照品溶液,分別進樣2、6、10、16、20 ?L,計算各相對校正因子。fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak),式中,Ak為內(nèi)標物峰面積,Wk為內(nèi)標物質(zhì)量,Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的質(zhì)量。以綠原酸為內(nèi)標物,分別計算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對校正因子,結(jié)果見表8。

        2.2.2 相對校正因子重現(xiàn)性考察

        按相對校正因子測定條件和方法,分別采用3種不同的色譜儀和3種色譜柱測定,并計算綠原酸對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的fk/m,計算平均值,結(jié)果見表9。

        2.2.3 待測色譜峰定位

        采用不同色譜儀及色譜柱,待測組分的保留時間會有所波動,在色譜峰定位中一般采用相對保留時間或保留時間差法[6-8]。取“2.1.2”項下混合對照品溶液,分別采用3種不同色譜儀和3種色譜柱測定,并計算綠原酸對咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對保留時間(rk/m),結(jié)果見表10,RSD均小于5%,表明利用相對保留時間進行色譜峰的定位是可行的。

        2.2.4 一測多評法與外標法測定結(jié)果比較

        首先采用外標法(extermal standard method,ESM)對忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷進行多成分同步定量測定,再用建立的QAMS方法計算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的質(zhì)量。Wm=Wk×Am/(fk/m×Ak),式中,Ak為內(nèi)標物峰面積,Wk為內(nèi)標物進樣量(質(zhì)量),Am為組分m峰面積,Wm為組分m的質(zhì)量。

        每批樣品分別用2種方法平行測定2次,將2種方法的結(jié)果進行比較,以驗證QAMS用于忍冬藤中不同成分含量測定的可靠性,結(jié)果見表11。2種方法測得的忍冬藤中各成分含量無明顯差異,RSD均小于5%,提示建立的方法具有較好的可信度。

        3 討論

        本試驗采用雙波長模式同時測定忍冬藤中6種化學(xué)成分,其中,綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的檢測波長為327 nm,馬錢苷的檢測波長為236 nm。馬錢苷在327 nm波長處無吸收,綠原酸等有機酸雖然在236 nm波長處有吸收,但分離易受忍冬藤中其他環(huán)烯醚萜苷類成分的影響,因此,采用雙波長模式同時測定,可以克服單一波長測定時信息量不足的缺點,使每個待測成分色譜峰均可以最大峰面積覆蓋圖譜。目前,QAMS方法多采用單一波長測定中藥中同一類成分的含量[9-10]。本研究結(jié)果表明,QAMS方法同樣適用于雙波長模式和多類成分的同時測定。

        綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷在忍冬藤中含量較大,生物活性較高,因此將此6種成分作為忍冬藤質(zhì)量評價的指標。其中,綠原酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且廉價易得,作為內(nèi)標物,建立其與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對校正因子,在不同液相色譜系統(tǒng)與色譜柱中RSD均小于5%,符合測定要求。故選擇綠原酸為內(nèi)標物,以降低檢測成本。

        本試驗采用3套液相色譜系統(tǒng)進行色譜峰定位的重現(xiàn)性考察。雖然在不同色譜儀和不同色譜柱中相對保留時間的RSD均小于5%,但在同一色譜儀中色譜峰定位更為準確。在島津HPLC儀中,3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為0.66%,在賽默飛HPLC儀中,3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為1.36%;在沃特世HPLC儀中,3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對保留時間的RSD為0.66%。而賽默飛HPLC儀與沃特世HPLC儀計算的RSD為1.94%,3臺HPLC儀計算的RSD則達到3.25%。這與3套液相色譜系統(tǒng)流動相的混合方式不同有關(guān),島津液相色譜系統(tǒng)是二元高壓梯度,賽默飛和沃特世液相色譜系統(tǒng)是低壓梯度,流動相混合的位置與精度有一定差異,梯度變化時的時間延遲也不相同,從而導(dǎo)致色譜峰定位上的差別。因此,在建立QAMS方法時應(yīng)注意此問題。

        本試驗以忍冬藤為研究對象,通過方法學(xué)確證、相對校正因子的確認與重現(xiàn)性考察、色譜峰的定位和QAMS準確性評價,對QAMS技術(shù)在忍冬藤中的適應(yīng)性和應(yīng)用可行性進行研究,結(jié)果表明,采用QAMS測得的各成分含量與ESM測定結(jié)果沒有明顯差異,具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及可信度。此方法的建立為全面考察忍冬藤質(zhì)量提供了參考方法,提示在缺少對照品的情況下,通過相對校正因子及色譜峰的定位計算含量,可以實現(xiàn)忍冬藤中6種成分的質(zhì)量控制。該方法作為忍冬藤質(zhì)量的一種有效評價方式,可為忍冬藤的質(zhì)量評價提供參考和依據(jù)。

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