張美霞，游玉明，郭瑤

（重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶402160）

蘆薈是百合科蘆薈屬肉質(zhì)草本植物，在全世界范圍內(nèi)，大約有360 多種不同品種的蘆薈分布在北美、亞洲、歐洲和非洲的干旱地區(qū)，其中庫拉索蘆薈無論在商業(yè)用途還是在治療學研究中都是應(yīng)用最廣泛的一種[1]。蘆薈所含糖類中具有重要生物活性作用的是多糖。經(jīng)試驗測試，新鮮凝膠中含多糖約為0.27%～0.5%。與其他植物多糖相比，蘆薈多糖具有廣譜的調(diào)節(jié)免疫、抗輻射、抗艾滋病病毒、抗?jié)?、降血脂、降血糖、抗氧化等藥理活性。目前尚未有因使用蘆薈多糖而出現(xiàn)過敏反應(yīng)的報道，且其本身的毒副作用小，因而是近年來蘆薈研究的重點之一[2-5]。

目前，關(guān)于蘆薈多糖的提取方法國內(nèi)外已有較多報道，主要有熱水浸提法、微波輔助法、超聲波輔助法等[6-12]。但提取材料大多為蘆薈全葉干燥后經(jīng)粉碎制成的蘆薈干粉，只針對新鮮蘆薈葉凝膠中多糖的提取報道較少。超聲波輔助提取法其基本原理主要是利用超聲波的空化作用來增大物質(zhì)分子的運動頻率和速度，從而增加溶劑的穿透力，提高被提取成分的溶出速度[13]。該方法具有操作簡便快捷、提出率高、速度快、提取物的結(jié)構(gòu)未被破壞、效果好等特點，常用于提取植物內(nèi)的有效成分。酶具有水解纖維素、原果膠和糖蛋白的作用，酶的高效性能夠節(jié)約提取能源與時間，酶的專一性使得到的產(chǎn)物穩(wěn)定，純度、活性高[14]；復(fù)合酶提取由于反應(yīng)溫和、操作時間短、成本較低等優(yōu)勢而逐漸被應(yīng)用到多糖的提取研究中[15]。本試驗將超聲波和復(fù)合酶法進行有效結(jié)合，并利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其工藝技術(shù)參數(shù)，旨在探求超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取新鮮蘆薈凝膠多糖的最佳的工藝條件，為蘆薈凝膠多糖的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

庫拉索蘆薈：重慶市永川區(qū)花鳥市場。

1.2 主要試劑儀器

纖維素酶（5×105v/g）、果膠酶（4×105v/g）、中性蛋白酶（1×106v/g）：南寧龐博生物工程有限公司；葡萄糖、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、丙酮、檸檬酸、氫氧化鈉：濟南東凱化工有限公司，均為分析純試劑。

754 型紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；PHILIPS HR2826 榨汁機：廈門智威爾貿(mào)易有限公司；TCL-16B 離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；SB-5200-DIDN 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆薈凝膠多糖的提取工藝

蘆薈清洗→去皮取凝膠→打漿→5 000 r/min 離心30 min→冷藏過夜→超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取蘆薈凝膠多糖→滅酶→過濾→4 000 r/min 離心15 min→50 ℃濃縮→Sevag 法去蛋白→醇沉→3 000 r/min 離心10 min離心取沉淀→依次用95%乙醇、乙醚、丙酮洗滌沉淀→過濾→用水溶解→定容→測量[16-20]。

1.3.2 樣品中蘆薈凝膠多糖提取率的測定

參考苯酚-硫酸法測定超聲波輔助協(xié)同復(fù)合酶法所提取的蘆薈凝膠多糖的含量[21]。

1.3.2.1 標準曲線的繪制

葡萄糖標準液制備：精確稱取105 ℃條件下干燥至恒重的葡萄糖100 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解至容量瓶刻度。此標準溶液1.00 mL 含葡萄糖1.00 mg。

苯酚液制備：取苯酚100 g，加鋁片0.1 g，碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾收集182 ℃餾分，稱取此餾分10.0 g，加水150 g，置棕色瓶中備用。

標準曲線的繪制：吸取葡萄糖標準液0.25、0.5、1.00、2.00、2.50 mL，分別置于 50 mL 容量瓶中，加水定容。吸取上述溶液各2.00 mL，再加苯酚液1.00 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.00 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出后冷卻至20 ℃～25 ℃，于490 nm 處以水作參照測吸光度值，繪制標準曲線，并求得回歸方程如下：y=0.057 3x-0.000 5，R2=0.999 1。

1.3.2.2 樣品中蘆薈凝膠多糖含量的測定

樣品中蘆薈凝膠多糖含量的測定：取蘆薈凝膠多糖沉淀物于蒸餾水中配成溶液，過濾后搖勻，定容到200 mL，配成蘆薈凝膠多糖貯備液，吸取多糖儲備液5.00 mL，置于50 mL 容量瓶中，加水定容。吸取上述溶液2.00 mL，再加苯酚溶液1.00 mL，邊搖邊迅速滴加濃硫酸5.00 mL，放置5 min，置沸水浴加熱15 min，迅速冷卻至 20 ℃～25 ℃，于 490 nm 處測吸光度，同時做空白試驗。將所測得的樣品溶液的吸光度代入標準曲線方程，可得到蘆薈凝膠多糖的質(zhì)量濃度，并按方程（1）計算蘆薈凝膠多糖的提取率[22-24]。

1.3.3 最佳協(xié)同方式的確定

在超聲功率80 W、溫度50 ℃、pH5.0，復(fù)合酶用量（果膠酶0.5%、中性蛋白酶2%、纖維素酶1.5%）的條件下研究4 種不同的協(xié)同方式對蘆薈凝膠多糖得率的影響，滅酶條件為 90 ℃、30 s。

1）蘆薈預(yù)處理后，先超聲波處理20 min，加入復(fù)合酶，酶解60 min，滅酶，測多糖得率。

2）蘆薈預(yù)處理后加入復(fù)合酶直接進行超聲波處理20 min，滅酶，測多糖得率。

3）蘆薈預(yù)處理后加入復(fù)合酶酶解60 min，滅酶，之后再進行超聲波處理20 min，測多糖得率。

4）蘆薈預(yù)處理后加入復(fù)合酶酶解60 min，之后再進行超聲波處理20 min，滅酶，測多糖得率。

1.3.4 復(fù)合酶最佳配比的確定

1.3.4.1 單因素試驗

取20 g 經(jīng)預(yù)處理后的蘆薈凝膠原液，超聲功率80 W、溫度50 ℃、pH5.0，分別添加果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，在其他條件不變的基礎(chǔ)上，研究果膠酶添加量、中性蛋白酶添加量和纖維素酶添加量對蘆薈凝膠多糖提取率的影響。

1.3.4.2 正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶配比

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取果膠酶添加量（A）、纖維素酶添加量（B）、中性蛋白酶添加量（C）這3 個因素，分別選取影響顯著的3 個水平，采用L9（33）正交表設(shè)計正交試驗，以蘆薈凝膠多糖提取率為指標，優(yōu)化復(fù)合酶配比，因素水平表見表1。

表1 復(fù)合酶因素水平表Table 1 Factors and levels of multi-enzyme

1.3.5 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取條件的確定

1.3.5.1 單因素試驗

在其他條件相同的基礎(chǔ)上，研究超聲溫度（45、50、55、60、65 ℃）、提取液 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、液料比[2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g）]、超聲時間（20、30、40、50、60 min）對蘆薈凝膠多糖提取得率的影響。

1.3.5.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化

在單因素試驗的前提下，采用Box-Behnken 設(shè)計方案，應(yīng)用 Design-Expert 軟件，選取超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、提取液 pH 值（X3）這 3 個對蘆薈凝膠多糖的提取率影響顯著的因素為3 個獨立變量進行響應(yīng)曲面研究，并以+1、0、-1 分別代表各獨立變量的水平，建立蘆薈凝膠多糖提取率的二次多項式數(shù)學模型。因素水平見表2。

表2 Box-Behnken 因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳協(xié)同方式的確定

按1.3.3 中4 種協(xié)同方式分別試驗，計算提取率。結(jié)果見表3。

表3 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法的不同協(xié)同方式對蘆薈凝膠多糖得率的影響Table 3 The effects of different synergetic method of ultrasonic and ccomposite enzyme on the yield of aloe gel polysaccharides

表2 說明：（1）、（2）、（4）3 種處理方式所得蘆薈凝膠多糖的提取率高于方式（3），說明超聲波與復(fù)合酶法協(xié)同作用能夠顯著有效地提高蘆薈凝膠多糖提取率；（1）、（2）、（4）3 種處理方式之間并無顯著差異，即在復(fù)合酶協(xié)同超聲波處理之前或之后額外的增加酶解時間并不能顯著有效地提高蘆薈凝膠多糖提取率，反而方式（2）效率更高，所以后續(xù)試驗均采用協(xié)同方式（2）來進行。即蘆薈預(yù)處理后加入復(fù)合酶直接進行超聲波處理20 min，90 ℃、30 s 滅酶，測多糖提取率。

2.2 復(fù)合酶最佳配比的確定

2.2.1 復(fù)合酶單因素試驗結(jié)果

果膠酶添加量、纖維素酶添加量、中性蛋白酶添加量對蘆薈凝膠多糖提取率的影響如圖1～圖3 所示。

圖1 表明：隨著果膠酶的添加量的增加蘆薈凝膠多糖的提取率先呈現(xiàn)上升趨勢，在添加量為1.0%時最高，隨著添加量的繼續(xù)增加，提取率下降，所以選擇果膠酶的添加量為1.0%。

圖1 果膠酶添加量對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.1 Effect of pectinase addition on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖2 纖維素酶添加量對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase addition on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖3 中性蛋白酶添加量對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.3 Effect of neutral protease addition on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖2 表明：隨著纖維素酶添加量的增加，蘆薈凝膠多糖提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當用量達到1.5%時提取率可取最大值，所以纖維素酶用量選擇為1.5%。

圖3 表明：隨著中性蛋白酶添加量的增加，蘆薈凝膠多糖提取率表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，當酶量小于1.5%時，中性蛋白酶在分解細胞結(jié)構(gòu)的同時有利于多糖的浸出，當酶量大于1.5%，多糖提取率反而下降。由圖可知，中性蛋白酶取1.0%～1.5%最好。

2.2.2 正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶配比結(jié)果

通過正交試驗來進一步確定復(fù)合酶的最佳配比，正交試驗結(jié)果如表4 所示。

正交試驗結(jié)果說明，這3 個因素影響蘆薈凝膠多糖提取率的大小分別為A＞B＞C，即果膠酶＞纖維素酶＞中性蛋白酶，最佳配比組合為：A2B2C1，即果膠酶1.0%，纖維素酶酶1.5%，中性蛋白酶1.0%，經(jīng)驗證試驗得蘆薈凝膠多糖提取率為8.243%。

表4 復(fù)合酶配比正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test for the multi-enzyme

2.3 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法最佳提取條件的確定

2.3.1 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法單因素試驗結(jié)果

提取溫度、提取液pH 值、液料比、提取時間對蘆薈凝膠多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4～圖7。

圖4 提取溫度對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.4 The Effect of extraction temperature on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖4 可以看出，蘆薈凝膠多糖提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度達到50 ℃時，多糖提取率最高，表明適當?shù)靥岣邷囟瓤梢蕴岣呙傅幕钚?，促進酶對植物細胞壁的分解，有利于提取溶劑中易釋放多糖，從而提高多糖提取率；當溫度大于50 ℃時，隨著溫度的升高蘆薈凝膠多糖提取率逐漸降低，這可能是由于超過一定溫度時，溫度的升高會導(dǎo)致酶活性的降低或酶部分失活。

圖5 超聲提取時間對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.5 The effect of extraction time on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖6 液料比對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.6 The effect of material-water ratio on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

圖7 pH 值對蘆薈凝膠多糖提取率的影響Fig.7 The effect of pH on the extraction rate of aloe gel polysaccharides

由圖5 可以看出，蘆薈凝膠多糖提取率隨超聲時間的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當超聲時間達到30 min 時，蘆薈凝膠多糖提取率最低，當超聲時間大于30 min 時，提取率逐漸上升。

由圖6 可以看出，當液料比大于 2∶1（mL/g）時，液料比的升高反而會使蘆薈凝膠多糖提取率降低，而且提取液體積的過量增加會導(dǎo)致后續(xù)濃縮工序的負擔過重，選擇液料比為2∶1（mL/g）為較適宜液料比。

由圖7 可以看出，當pH 值小于4.5 時，蘆薈凝膠多糖提取率隨著pH 值的升高而增大，說明合適地提高蘆薈凝膠提取液的pH 值可以提高酶的活性，并能夠促進酶對蘆薈凝膠細胞壁的分解，有利于蘆薈凝膠多糖的釋放，提高多糖提取率，pH 值達到4.5 時提取率最高，當pH 值大于4.5 時，蘆薈凝膠多糖提取率隨著pH 值的升高而呈現(xiàn)降低趨勢，這可能是由于超過了酶的最適pH 值而導(dǎo)致酶活性的降低。

2.3.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取條件

2.3.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化方案與試驗結(jié)果Table 5 The methods and experimental results of response surface analysis

以蘆薈凝膠多糖的提取率為響應(yīng)值，通過Design-Expert.V8.0.6 軟件對表5 數(shù)據(jù)進行四元二次回歸分析，得到方程為：

2.3.2.2 響應(yīng)面方差分析與顯著性檢驗

回歸方程的各項方差分析見表6。

表6 回歸模型的方差分析表Table 6 The anova table of regression model

表6 回歸模型的方差分析表Table 6 The anova table of regression model

回歸模型的方差分析結(jié)果為F=14.32，對應(yīng)的p＜0.001，表明該模型極顯著。p＜0.05，失擬項不顯著（p=0.185 4），模型顯著（p=0.001 0）。

表7 為模型的顯著性檢驗。

該回歸方程確定系數(shù)R2=0.948 5，表明蘆薈凝膠多糖提取得到的試驗值與模型回歸值有良好的一致性，即模型穩(wěn)定并且與實際情況擬合度很好，可以客觀地描述試驗結(jié)果，校正系數(shù)R2=0.882 2，表明在多糖提取率總的變異中有88.22 %是由獨立變量引起，11.78%與該模型不符。失擬項不顯著，表明該模型能對最佳提取條件進行準確預(yù)測和分析。

2.3.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

圖8～圖10 為相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

從圖中可以明顯的看出各獨立變量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖曲面坡度陡峭程度及等高線的形狀（圓形或橢圓）可以看出相應(yīng)兩個變量之間的交互作用是否顯著。響應(yīng)曲面坡度平緩和圓形的等高線表明交互作用較小，可以忽略；而響應(yīng)曲面坡度陡峭和橢圓的等高線則表示交互作用較為顯著或極其顯著。由圖8～圖10 可以看出提取液pH 值對多糖得率的影響最顯著，然后是超聲時間和超聲溫度，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖8 超聲時間與超聲溫度對蘆薈凝膠多糖提取率影響的曲面和等高線圖Fig.8 The response surface figure and contour plot of the impact of extraction time and temperature on the yield of aloe gel polysaccharides

圖9 超聲時間與pH 值對蘆薈凝膠多糖提取率影響的曲面和等高線圖Fig.9 The response surface figure and contour plot of the impact of extraction time and pH value on the yield of aloe gel polysaccharides

圖10 超聲溫度與pH 值對蘆薈凝膠多糖提取率影響的曲面和等高線圖Fig.10 The response surface figure and contour plot of the impact of extraction temperature and pH value on the yield of aloe gel polysaccharides

由圖8 可知，響應(yīng)曲面坡度平緩，等高線橢圓的曲率較小，說明當提取液pH 值為4.50 時，超聲時間與超聲溫度的交互作用對蘆薈凝膠多糖提取率的影響不明顯。并隨著超聲時間的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在超聲時間為40min～60 min 時，超聲溫度從45 ℃～55 ℃時，對蘆薈凝膠多糖提取率最有利。

由圖9 可知，響應(yīng)曲面坡度陡峭，等高線橢圓的曲率較大，說明當超聲溫度為50 ℃時，超聲時間與提取液pH 值的交互作用對蘆薈凝膠多糖提取率的影響高度顯著。并在超聲時間為40 min～60 min 時，提取液pH值由4 到4.5 時，蘆薈凝膠多糖提取率可得到最大值。

由圖10 可知，響應(yīng)曲面坡度相對較為陡峭，等高線橢圓的曲率較大，當超聲時間為50 min 時，超聲溫度與提取液pH 值的交互作用對蘆薈凝膠多糖提取率的影響比較顯著，當超聲溫度由45 ℃～55 ℃，提取液pH 值由4 到4.5 時，多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢。

2.3.2.4 模型的驗證

為得到最佳提取條件，在模型所擬范圍內(nèi)，對響應(yīng)值方程求一階偏導(dǎo)，得到提取率Y 取最大值8.781%時，X1、X2、X3所對應(yīng) 的值分別 是 X1=51.80 min、X2=51.06 ℃、X3=4.22，為了驗證響應(yīng)曲面法的可靠性，通過上述最佳提取工藝參數(shù)來進行蘆薈凝膠中多糖的超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取試驗，同時考慮到實際操作中出現(xiàn)的情況，將提取工藝參數(shù)修正為：超聲提取溫度51 ℃，提取時間52 min，提取液pH 值4.2，蘆薈凝膠多糖的提取率為8.692%，其誤差約為1.01%，在可接受范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本試驗通過利用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法來提取蘆薈凝膠多糖，試驗表明超聲波作用的同時進行酶解的協(xié)同方式不僅能增加多糖提取率，還能節(jié)約時間。通過試驗確定其復(fù)合酶的最佳配比為：果膠酶1.0%，纖維素酶酶1.5%，中性蛋白酶1.0%；通過利用設(shè)計軟件Design-Expert.V8.0.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取蘆薈凝膠多糖的最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度為51 ℃，超聲時間為52 min，pH 值為4.2。在此條件下蘆薈多糖提取率平均值為8.692%。