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        響應(yīng)面法優(yōu)化商陸多糖提取工藝研究

        2019-09-18 09:36:20郭旭陳乃東
        食品研究與開發(fā) 2019年18期
        關(guān)鍵詞:商陸面法液料

        郭旭,陳乃東

        (1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽六安237012;2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室,安徽六安237012;3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校,河北石家莊050051)

        商陸(Phytolacca acinosa Roxb.)為商陸科植物商陸和垂序商陸的根,主產(chǎn)于河南、安徽、湖北等地。商陸味苦,性寒,有毒;歸肺、脾、腎、大腸經(jīng),逐水消腫,通利二便,解毒散結(jié),用于水腫脹滿,二便不通,治癰腫瘡毒[1],為歷版中國藥典收載。現(xiàn)代藥理研究表明,商陸富含多糖等化學(xué)成份[2-4],具促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能,刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2、誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素-1、抗腫瘤等作用[5-11]。

        響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)是一種應(yīng)用較廣的試驗(yàn)優(yōu)化方法,由于采用了更為合理的試驗(yàn)設(shè)計,能以最為經(jīng)濟(jì)的方式對試驗(yàn)進(jìn)行全面研究,可高效快速地確定多因子系統(tǒng)中最佳因子組合。本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法從提取時間、提取溫度、液料比三方面對商陸總多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為商陸質(zhì)量評價與資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        試驗(yàn)材料2016年11 月采自皖西學(xué)院藥用植物園,品種經(jīng)陳乃東教授鑒定為商陸(Phytolacca acinosa Roxb.)。新鮮的商陸根,洗凈,-50 ℃冷凍干燥至恒重,粉碎,過40 目篩,備用。

        蒽酮:上??曝S實(shí)業(yè)有限公司;硫酸、三氯甲烷:西隴科學(xué)股份有限公司;D(+)-葡萄糖:廣州萬從化工有限公司;正丁醇:天津博迪化工股份有限公司;無水乙醇:上海振興化工一廠。以上均為國產(chǎn)分析純。

        電子天平(FA-1004 型號):上海精科天平廠;立式高速冷凍離心器(HR/T20MN):湖南赫西儀器裝備有限公司;雙束紫外可見分光光度計(TU-1901):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000):上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 商陸多糖的提取

        精確稱取商陸粉末約2 g,按設(shè)定液料比、提取溫度、提取時間提取后過濾獲總多糖提取液。

        1.2.2 多糖含量的測定

        1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及以葡萄糖計多糖含量測定

        精確配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液,精密量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 7 支帶塞刻度試管中,分別加雙蒸水至體積為1.0 mL,搖勻,于冰水浴中緩慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液,搖勻,冷卻后,100.0 ℃水浴中水浴10.0 min 后取出,冷卻至20 ℃,以雙蒸水為空白對照,于620 nm 下測吸光度值,得吸光度與濃度的回歸方程a=8.256 7x+0.026 2,R2=0.990 1,在0~0.1 mg,吸光度(a)與濃度(x)呈良好的線性關(guān)系。

        精密量取1.2.1 制備的總多糖提取液1.0 mL,按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測吸光度,代入回歸方程,計算出以葡萄糖計商陸多糖含量。

        1.2.2.2 換算因子的測定及多糖含量的測定

        將1.2.1 制備的總多糖提取液適當(dāng)濃縮,經(jīng)醇沉、反復(fù)Sevage 法脫蛋白[12-15]至無明顯中層后,收集上部水層,-50 ℃冷凍干燥獲精制多糖。

        精密稱取精制多糖10.0 mg,置100 mL 容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,精密吸取1.0 mL,按1.2.2.1 所述方法測定其吸光度,按下式計算換算因子(F):

        式中:W 為精制多糖質(zhì)量,mg;C 為多糖液中葡萄糖折合濃度,mg/mL;D 為稀釋因素。

        本試驗(yàn)條件下測得F=1.762 8。

        將1.2.2.1 測定的以葡萄糖計多糖含量乘以換算因子,獲商陸多糖含量。

        1.2.3 單因素試驗(yàn)

        將不同提取條件下測得商陸多糖的含量作為商陸多糖提取率,分別考察提取溫度、液料比、提取時間對多糖提取率的影響。試驗(yàn)方案如下:

        保持液料比 50∶1(mL/g)、提取時間 3 h,研究提取溫度 40、55、70、85、100 ℃對多糖提取的影響。

        保持溫度70 ℃、提取時間3 h,考察液料比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1(mL/g)對多糖提取的影響。

        保持溫度 70 ℃、液料比 50∶1(mL/g),考察提取時間為 1、2、3、4、5 h 對多糖提取的影響。

        1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,基于Box-Behnken 設(shè)計思路,運(yùn)用Design-Expert 8.05b 軟件,分別以A 液料比、B 提取溫度、C 提取時間 3 個因素,以-1、0、1 表示其 3個水平(表1),多糖提取率為響應(yīng)值,開展響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝。

        表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

        1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        以商陸多糖提取率為評價標(biāo)準(zhǔn),采用Design-Expert 8.05b 軟件分析測得的數(shù)據(jù),確定商陸多糖的最佳提取工藝。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

        由圖 1a 可見,當(dāng)液料比為 10∶1(mL/g)~50∶1(mL/g)時,隨著液料比增加,多糖的提取率迅速增加,當(dāng)液料比超過70∶1(mL/g)時,多糖提取率增長緩慢??紤]液料比增加,后處理越費(fèi)時、費(fèi)力,從簡化工業(yè)生產(chǎn)后處理角度出發(fā),試驗(yàn)選擇液料比 30∶1(mL/g)~70∶1(mL/g)作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的液料比范圍。

        圖1 液料比、提取溫度與提取時間對多糖提取的影響Fig.1 The effects of liquid material ratio,extracting temperatures and extracting time on the yield of polysaccharide

        從圖1b 可見,提取溫度對商陸多糖提取有明顯影響,當(dāng)溫度由 40 ℃升為 55 ℃、85 ℃升為 100 ℃,提取率增長緩慢;當(dāng)溫度從55 ℃升至85 ℃,多糖的提取隨溫度的增高迅速上升,因此,試驗(yàn)選擇提取溫度55 ℃~85 ℃作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的溫度范圍。

        由圖1c 可見,當(dāng)提取時間由1 h 延長為2 h 時,多糖的提取率13.5%增加到14.1%,當(dāng)提取時間由2 h 增加到4 h 時,多糖提取率由14.1%迅速增加到20.1%,4 h 后,隨著時間延長,提取率增加緩慢,因此,試驗(yàn)選擇提取時間2 h~4 h 作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的提取時間范圍。

        2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

        2.2.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

        采取Box-Behnken 軟件對單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計量分析,最終得到最佳的試驗(yàn)結(jié)論。表2 為通過軟件分析之后得到的對商陸多糖提取的三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計及各試驗(yàn)條件下的商陸多糖提取率。

        表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface methodology

        2.2.2 回歸方程方差分析

        依據(jù)表2 的結(jié)果,利用Design-Expert 8.0.5b 進(jìn)行回歸分析,得到商陸多糖提取率(Y)與料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)多元非線性回歸方程:

        Y=-11.5+0.2A+0.2B+10.8C+0.002AB+0.05AC+0.03BC-0.004A2-0.003B2-2.4C2

        對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析,結(jié)果如表3所示。

        表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Significant test for regression model

        續(xù)表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Significant test for regression model

        由表3 可見,該模型極顯著(F 值=8.63,P<0.01),且失擬項(xiàng)(P=0.024 3)不顯著,說明該回歸方程擬合度好,受其它因素影響較小,可以用來預(yù)測商陸多糖的最佳提取工藝。此外,液料比的一次項(xiàng)(A)與二次項(xiàng)(A2)、提取時間的二次項(xiàng)(C2)極顯著(P<0.01),提取溫度的一次項(xiàng)(B)與二次項(xiàng)(B2)、提取時間的一次項(xiàng)(C)、液料比與提取溫度的二次交互項(xiàng)(AB)、提取溫度與提取時間的二次交互項(xiàng)(BC)均顯著(P<0.05),且各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由顯著性檢驗(yàn)中的決定系數(shù)R2=0.957 3,校正系數(shù)R2Adj=0.911 5可知,該模型中的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)性較高,并且能較好地反映出各個因素對商陸多糖提取率的影響。通過對上表的數(shù)學(xué)方差的統(tǒng)計和定量的分析,可以看出,各單因素對于多糖提取率的影響程度從大到小依次為液料比、提取時間、提取溫度。

        2.2.3 響應(yīng)面圖分析

        通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖,可以更加直觀地反映出各單因素對多糖提取的影響結(jié)果以及各單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系。液料比、提取時間、提取溫度這3 個因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面與等高線圖見圖2。通過響應(yīng)面圖可知,在所對應(yīng)的范圍內(nèi)存在極大值,即為各響應(yīng)面的最高點(diǎn),亦為等高線最內(nèi)橢圓的中心點(diǎn)。

        圖2 兩兩因素交互作用對多糖提取的影響Fig.2 Interactive effects of three factors on extracting polysaccharide

        從圖2a 可知,液料比與提取時間對商陸多糖提取率的交互作用顯著,當(dāng)液料比為 60∶1(mL/g)、提取時間為3.5 h 時,多糖提取率最高,從等高線圖亦可以看出,提取時間對響應(yīng)值的影響更大。

        從圖2b 可知,液料比與提取溫度對商陸多糖提取率的交互作用顯著,多糖提取率在液料比60∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃時達(dá)到最高,等高線曲線斜率反映出提取溫度對多糖提取率影響更明顯。

        從圖2c 可知,提取溫度與提取時間對商陸多糖提取率的交互作用顯著,提取溫度對多糖的影響占主導(dǎo)。在溫度70 ℃、提取時間3.5 h 時,多糖提取率較高。

        綜合Design-expert 軟件分析結(jié)果可以得出,商陸多糖最佳提取工藝為:液料比 60∶1(mL/g)、溫度 70 ℃提取3.5 h 時,理論上此條件下多糖提取率為21.38%。

        2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

        為了對最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證,在液料比60∶1(mL/g)、提取溫度70 ℃、提取時間3.5 h 下進(jìn)行3 組平行重復(fù)試驗(yàn),最終得到的商陸多糖的提取率為21.65%,與預(yù)測值的相差為1.26%,差異較小。故利用響應(yīng)面優(yōu)化提商陸多糖得到的提取工藝真實(shí)可靠,明顯高于魯建江等采用微波提取測定的19.061%[16],具有一定的實(shí)際應(yīng)用價值。

        3 結(jié)論

        本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化法,對液料比、提取時間、提取溫度這3 個因素進(jìn)行考察,并采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果得出,液料比、提取時間與提取溫度對多糖提取率影響顯著,其影響順序?yàn)椋阂毫媳龋咎崛r間>提取溫度。通過二次回歸方程,得到的最優(yōu)提取工藝為液料比 60∶1(mL/g)、提取時間 3.5 h、提取溫度70 ℃,商陸多糖的實(shí)際平均提取率為21.65%。

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